JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

الدوارات هي المجهري العوالق الحيوانية عالمية (<1 مم) التي تشكل الأسرة في اللغات الدوارات 1. لديهم خطة هيئة بسيطة تتألف من حوالي 1000 الخلايا الجسدية فضلا عن جهاز الهدبية عجلة تشبه مميزة تسمى الهالة، والذي يستخدم لتنقل والتغذية. معظم الدوارات تنتمي إلى الطبقات Monogononta أو Bdelloidea، والتي تحتوي على حوالي 1600 و 500 نوعا، على التوالي 2. يكون الدوارات Monogonont عموما مرحلتي الإنجابية الجنسية واللاجنسية (التوالد العذري الدوري)، في حين تتكاثر الدوارات bdelloid من التوالد العذري اجبة 3. ومن الممكن بالتالي الحصول على الأفراد حيدة الخلية والروتيفر متطابقة وراثيا، والتي تضمن استنساخ عالية في التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، لديهم العديد من المزايا الأخرى مثل الكائنات النموذج، مثل عمر قصير، وسهولة الثقافة، وتوافر الجينومية وtranscriptomic البيانات تسلسل 4-7، وموقف النشوء والتطور الفريد من بعيدrthropods والديدان الخيطية 8. ولذلك الدوارات واعدة نماذج اللافقارية في الايكولوجية، السمية، والدراسات 9-12 الشيخوخة.

الوقت البقاء على قيد الحياة تحت التعرض للإجهاد البيئي أو المواد الكيميائية غير معلمة قياس في كثير من الأحيان في هذه المجالات البحثية 13-19. ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر عند قياس الوقت البقاء على قيد الحياة من الدوارات لأنها عرضة للظروف البيئية أمهاتهم. وهي، في monogonont manjavacas حيدة الخلية والروتيفر Brachionus، المواليد الإناث من الأمهات الذين تتراوح أعمارهم بين لها عمر أقصر من تلك التي من الأمهات الشابات. ومع ذلك، وتقييد السعرات الحرارية الأمهات (CR) تعوض جزئيا من الآثار الضارة للمتقدم عمر الأم 20. في B. plicatilis، توفر CR الأمهات طول العمر ذرية، وقت بقاء طويل تحت التجويع، وارتفاع الأكسدة المقاومة الضغط المرتبطة مع تعزيز التعبير عن الانزيمات المضادة للأكسدة 21،22. تأثير عمر الأمكما لوحظ في الدوارات bdelloid 23. ولذلك، فإن ظروف الدوارات التجريبية يجب أن تكون متزامنة بعناية على مدى عدة أجيال قبل أن قياسات الوقت البقاء على قيد الحياة.

نحن هنا نقدم بروتوكول لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة في الدوارات Brachionus التالية تزامن الظروف والثقافة على مدى عدة أجيال. الصوم المتقطع (IF)، والاختلاف من CR حيث يتم تغذية الدوارات بشكل دوري، تم تطبيق للكشف عن تأثير التزامن بسبب الآثار المعروفة للIF على طول العمر 22،24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: استخدام مياه البحر الاصطناعي نصف المخفف Brujewicz الملوحة 16.5 جزء في الألف (PSU). وكثيرا ما تستخدم أيضا مياه البحر الاصطناعية الأخرى لثقافة الدوارات Brachionus 25،26.

  1. إضافة 454 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 26 ملي MgCl 2، 27 ملي MgSO 4، 10 ملي بوكل، و 10 ملي CaCl 2-4،5 لتر من الماء المقطر (الحجم النهائي سيكون 5 لتر). بدلا من ذلك، واستخدام الماء منزوع الأيونات تخفيف بدلا من الماء المقطر. إضافة CaCl 2 بعد حل جميع الأملاح الأخرى.
  2. إعداد M NaHCO حل 3 الأوراق المالية 0.48 (تركيز 200X). إضافة 25 مل منه إلى الحل السالف الذكر. التركيز النهائي من NaHCO 3 هو 2.4 ملم.
  3. إعداد M NaBr حل الأوراق المالية 0.4 (تركيز 500X). إضافة 10 مل منه إلى الحل السالف الذكر. التركيز النهائي من NaBr هو 0.8 ملم. ما يصل إلى 5 لتر مع الماء المقطر.
  4. تصفية حل مع فلتر الغشاء 0.45 ميكرون.تمييع مرتين مع الماء المعقم قبل الاستخدام (ت / ت).
    ملاحظة: من الممكن أن تجعل تركيز 2X من Brujewicz مياه البحر الاصطناعي كحل الأسهم.

2. شروط الثقافة العامة

  1. ثقافة أثار مختبر أو الدوارات البرية المأسورة في العقيمة كوب 100 مل بين 20 و 30 درجة مئوية. ارتفاع درجات الحرارة يؤدي إلى أقصر عمرا وتسارع الاستنساخ. استخدام 25 درجة مئوية لمدة راحة من التجارب. كثافة حيدة الخلية والروتيفر أو حجم مياه البحر الاصطناعي ليست قضية كبيرة هنا.
  2. ثقافة أنواع الطحالب الدقيقة الغذائية في مياه البحر الاصطناعي (11). انظر سنيل وآخرون (2014) لمزيد من التفاصيل 11. عادة، استخدم جنس (Tetraselmis) tetrathele (~ 2 × 10 5 خلية / مل 27،28)، T. suecica (~ 6 × 10 5 خلية / مل 25،29)، وNannochloropsis oculata (= 7 × 10 6 خلية / مل 30،31). ومنذ الحمية الطحالب (الأنواع، كونديت الثقافةالأيونات، التراكيب الكيميائية الحيوية) يؤثر بشكل كبير وقت بقاء الدوارات Brachionus، استخدم نفس الكثير من microalga في كل المجموعات التجريبية.
  3. الحفاظ على السكان الأسهم من الدوارات في ثقافة دفعة عن طريق تغذية وتغيير وسائل الإعلام في بعض الأحيان (على سبيل المثال، وإطعام كل أيام 2 و تطعيم كل أسبوع). العديد من حديثي الولادة والبالغين تحمل 2-3 البيض ويمكن ملاحظة عند الدوارات هي في أفضل الظروف.
    ملاحظة: طريقة بديلة للحصول على الدوارات التجريبية هي أن يفقس البيض يستريح. تعتبر الدوارات التي تحاك من البيض يستريح لتكون متزامنة بشكل جيد، وحياتها لا يختلف كثيرا عن أن من الدوارات التي تحاك من البيض amictic 11. ومع ذلك، الدوارات من البيض يستريح تبدأ التكاثر في وقت سابق من تلك التي من البيض amictic. وبالتالي، لا بد من الحذر لقياس الصفات الإنجاب.

3. تزامن الروتيفيرا من قبل الثقافة

  1. حدد حيدة الخلية والروتيفر واحد من شارعسكان اوك والثقافة كما هو موضح في 2،1-2،3 لإقامة شبه سكان التي سيتم استخدامها لإجراء التجارب. ثقافة عادة لمدة أسبوعين.
  2. جمع الدوارات التي تحمل البيض من سكان الفرعي (جمع عدد مزدوج من الأفراد التي سيتم استخدامها لتجربة). الثقافة بأنها مجموعة نموذجية واحدة (الكثافة: ~ 50 فردا / مل) في لوحة الثقافة 6 جيدا كما هو موضح في 2،1-2،3 في وسائل الإعلام الجديدة تحت تغذية libitum الإعلانية. السيطرة على الكثافة السكانية مهم جدا لأنه وسيلة مكيفة يؤثر علم وظائف الأعضاء التناسلية من الدوارات Brachionus 32،33.
  3. نقل حديثي الولادة تحاك من البيض الأولى الراشدين إلى وسائل الإعلام ثقافة أعد حديثا. كرر هذا الإجراء أكثر من 2-3 أجيال.
  4. استخدام حديثي الولادة تحاك في غضون فترة زمنية معينة (على سبيل المثال، <3 ساعة) لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة. لتجنب التحيز المحتمل في اختيار فرد واحد، على الرغم من واردا جدا، والتحقق من استنساخ باستخدام العديد INDEمعلقة-الفرعية من السكان.
    ملاحظة: كما الدوارات عادة ما تتكاثر لاجنسيا فقط تحت هذا الشرط، ضمان عدم وجود الذكور موجودة في كافة مراحل التجربة. الذكور هم أصغر من حديثي الولادة وعادة ما تتحرك بسرعة أكبر من الإناث. الإناث Mictic لها أعمار مختلفة من الإناث amictic في ظل ظروف معينة (29).

4. قياسات الوقت البقاء على قيد الحياة

  1. مكان حديثي الولادة في لوحات بلاستيكية (عادة 24- أو 48-جيدا لوحات، مع كل منها يحتوي أيضا 1 مل من مياه البحر الاصطناعي).
  2. في 24 فترات ساعة، ونقل الدوارات إلى وسائل الإعلام الثقافة أعدت حديثا أو في 12 ساعة فترات إذا في ارتفاع درجة الحرارة (30 درجة مئوية أو أعلى). تسجيل عدد من ذرية وإذا كان كل فرد هو حيا أو ميتا. تسجيل حيدة الخلية والروتيفر في عداد الموتى عند حركة أهداب من الهالة قد توقف تماما.
    ملاحظة: الروتيفيرا غالبا ما نعلق على الجدران الجانبية من الآبار. pipetting لطيف من الماء يساعد على العثور عليها. إذا لم يتم العثور على الدوارات أو عالبريد التالفة عن طريق الخطأ من قبل pipetting ل، تسجيلها باسم "رقابة"، وليس كما "حيا".
  3. إزالة حديثي الولادة عند الدوارات التجريبية تتوالد بنشاط. حديثي الولادة تنمو بسرعة وأنه من الصعب أحيانا التمييز بينها وبين الدوارات التجريبية.

تحليل 5. البيانات

  1. إنشاء بقاء منحنى كابلان ماير (الشكلان 1 و 2) من خلال التآمر معدل البقاء على قيد الحياة التراكمي على المحور Y والوقت على المحور العاشر. هذا هو التمثيل الأكثر شيوعا من بيانات البقاء على قيد الحياة. استخدام غير حدودي الاختبار سجل رتبة (وتسمى أيضا رف كوكس test) لمقارنة إحصائية من الوقت البقاء على قيد الحياة 34. كما يتم تضمين اختبار سجل رتبة في الحزم الإحصائية القياسية الأخرى مثل أحزاب اللقاء المشترك وR.
    ملاحظة: لا تستخدم ر الطالب اختبار أو تحليل التباين (ANOVA)، يليه مقارنة متعددة حدودي لأنه عادة ما يتم الوفاء التوزيع العادي عن طريق البيانات البقاء على قيد الحياة 35. أيضا، هذه methoس لا تأخذ الأفراد رقابة بعين الاعتبار. مان ويتني U اختبار يمكن أن تستخدم إذا كان هناك أية بيانات للرقابة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج


ويبين الشكل 1 منحنيات البقاء على قيد الحياة تمثيلية من السكان سيئة متزامنة (من أصل اثنين مكررات). في هذه التجربة، كانت الدوارات إما كل يوم بتغذية [libitum الإعلانية مجموعة (AL)] أو مرة كل يومين (IF المجموعة). كان بقاء متوسط ​​13 و 18 يوما في سو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف البروتوكول الحالي وسيلة لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة في الدوارات Brachionus. الخطوة الحاسمة هي تزامن الظروف حيدة الخلية والروتيفر على مدى عدة أجيال. عندما تتم مزامنة الدوارات التجريبية بشكل جيد، لوحظ نوع نموذجي منحنى أنا البقاء على قيد الحياة مع القليل جدا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لجورج جارفيس، مارثا بوك، وبات Hecox-ليا، المختبر البيولوجي البحري، لمساعدتهم في التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideWako190-13921
Magnesium chlorideWako136-03995
Magnesium sulfateWako131-00427
Potassium chlorideWako168-22111
Calcium chlorideWako035-00455
Sodium bicarbonateWako199-05985
Sodium bromideWako190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)MilliporeHAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treatedThomas Scientific6902D01Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treatedThomas Scientific6902D07Flat bottom
Tetraselmis, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersion 6.0d

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113 Monogononta

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved