JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Rotifers הוא זואופלנקטון מיקרוסקופי קוסמופוליטית (<1 מ"מ) המהווה את המערכה Rotifera 1. יש להם תוכנית פשוטה הגוף מורכב כ -1,000 תאים סומטיים כמו גם מנגנון ריסי גלגל דמוי מאפיין שנקרא קורונה, אשר משמש לתנועה והאכלה. רוב rotifers שייכים כיתות Monogononta או Bdelloidea, המכילים כ -1,600 ו -500 מינים, בהתאמה 2. Rotifers Monogonont יש בדרך כלל שני שלבי רבייה מיניים מינית (בשכפול הגנטי מחזורי), בעוד rotifers bdelloid לשכפל בשכפול גנטי 3 חובה. בסך הכול אפשר להשיג אנשי rotifer זהים גנטי, אשר מבטיח שחזור גבוה בניסויים. בנוסף, יש להם כמה יתרונות אחרים כמו אורגניזמים מודל, כגון תוחלת חיים קצרה, קלות תרבות, זמינות של נתוני רצף גנומי transcriptomic 4-7, ו עמדת פילוגנטי ייחודית רחוקה מנקודהrthropods נמטודות 8. Rotifers ולכן מבטיח מודלים חסרי חוליות ב אקולוגית, טוקסיקולוגית, והזדקנות מחקרים 9-12.

זמן ההישרדות תחת חשיפה ללחץ או כימיקלים סביבתיים הוא פרמטר נמדד לעתים קרובות בתחומי מחקר אלה 13-19. עם זאת, זהירות נדרשת כאשר מודד את זמן ההישרדות של rotifers כי זה רגיש לתנאי סביבה של האמהות שלהם. כלומר, בתוך manjavacas monogonont rotifer Brachionus, צאצא נקבה מאמהות בגילאי יש תוחלת חיים קצרה יותר מאשר אלו של אמהות צעירות; עם זאת, הגבלת קלוריות אימהיות (CR) מקזזת בחלקה את ההשפעות המזיקות של גיל האם מתקדם 20. ב B. plicatilis, אימהית CR מספק לאריכות הצאצאים, זמן ההישרדות הארוך תחת רעב והתנגדות סטרס חמצוני הגבוהות הכרוכות עם ביטוי מוגבר של אנזימים נוגדי חמצון 21,22. השפעת גיל האםגם נצפה rotifers bdelloid 23. לכן, תנאי rotifers ניסיוני צריכים להיות מתואמים היטב במשך כמה דורות לפני המדידות של זמן הישרדות.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מדידת זמן הישרדות rotifers Brachionus הבא סנכרון של תנאי תרבות במשך כמה דורות. צום לסירוגין (IF), וריאציה של CR איפה rotifers ניזונים מעת לעת, יושמה כדי לחשוף את השפעת הסנכרון בשל ההשפעות הידועות של IF על אריכות ימים 22,24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת Media

הערה: השתמש חצי מדולל Brujewicz מי ים מלאכותי של ppt המליחה 16.5 (PSU). Seawaters המלאכותית אחרת גם משמשת לעתים קרובות כדי rotifers תרבות Brachionus 25,26.

  1. להוסיף 454 מ"מ NaCl, 26 מ"מ MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 מ"מ KCl, ו -10 מ"מ CaCl 2 כדי 4.5 ליטר של מים מזוקקים (נפח סופי יהיה 5 L). לחלופין, להשתמש במי דילול יונים במקום מים מזוקקים. להוסיף CaCl 2 לאחר המסת כל המלחים האחר.
  2. הכן את פתרון 3 מניות 0.48 M NaHCO (ריכוז 200x). הוסף 25 מ"ל של אותו הפתרון לעיל. הריכוז הסופי של NaHCO 3 הוא 2.4 מ"מ.
  3. כן פתרון המניות 0.4 M NaBr (ריכוז 500x). הוסף 10 מ"ל של אותו הפתרון לעיל. הריכוז הסופי של NaBr הוא 0.8 מ"מ. הפוך עד 5 ליטר עם מים מזוקקים.
  4. סנן את הפתרון עם מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר.לדלל אותו פעמיים עם מים סטריליים לפני השימוש (V / V).
    הערה: אפשר להכין ריכוז 2x של מי ים מלאכותי Brujewicz כפתרון מניות.

2. תנאי תרבות כלליות

  1. תרבות הגדלים במעבדה או rotifers בר-שנתפסו בכוס 100 מ"ל סטרילי בין ג '20 ו -30 מעלות. טמפרטורות גבוהות לגרום תוחלת חיים קצרות יותר ורבייה מואצת. השתמש 25 ° C לנוחיות ניסויים. צפיפות rotifer או הנפח של מי ים מלאכותי אינה בעיה גדולה כאן.
  2. מיני תרבות microalgae תזונתיים במי ים מלאכותיים 11. ראה ואח סנל. (2014) לפרטים 11. בדרך כלל, להשתמש Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 תאים / מ"ל 27,28), צ ' suecica (~ 6 x 10 5 תאים / מ"ל 25,29), ו Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 תאים / מ"ל 30,31). מאז אצות דיאטה (מינים, קונדיט תרבותיונים, קומפוזיציות ביוכימי) משפיע זמן ההישרדות משמעותית של rotifers Brachionus, להשתמש באותו הרבה microalga בכל קבוצות הניסוי.
  3. שמור אוכלוסיית מניות של rotifers בתרבות תצווה על ידי האכלה והשינוי בתקשורת מדי פעם (למשל, להאכיל כל 2 ימים לחסן כל שבוע). רבים ילודים ומבוגרים נושאות 2-3 ביצים ניתן להבחין כאשר rotifers הם בתנאים אופטימליים.
    הערה: דרך חלופית להשיג rotifers ניסיוני היא לבקוע ביצים נחות. Rotifers בקע מן הביצים נחות נחשב להיות מסונכרנים היטב, ואת תוחלת החיים שלהם אינה שונה באופן מהותי מזו של rotifers בקע מן הביצים amictic 11. עם זאת, rotifers מביצים נח להתחיל רבייה מוקדם יותר מאלו מביצים amictic. לכן, זהירות נדרשת למדידות של תכונות הרבייה שלהם.

סנכרון 3. rotifers ידי תרבות קדם

  1. בחר rotifer אחת מן stאוכלוסייה ותרבות Ock כמתוארת 2.1-2.3 להקים אוכלוסיית משנה אשר תשמש עבור ניסויים. בדרך כלל התרבות במשך שבועיים.
  2. אסוף rotifers נושאות הביצית מן האוכלוסייה משנה (לאסוף מספר כפול של אנשים אשר ישמשו לצורך הניסוי). תרבות בם עוקבה יחידה (צפיפות: ~ 50 אנשים / מיליליטר) בצלחת תרבות 6 היטב כמתואר 2.1-2.3 בתוך תקשורת טריה תחת האכלה כרצונך. שליטת צפיפות אוכלוסייה חשובה כי המדיום המותנה משפיע פיזיולוגית רבייה של rotifers Brachionus 32,33.
  3. עבר בילודים בקעו מן הביצים הראשונות של המבוגרים למדיה ותרבות מוכנים חדש. חזור על הליך זה על פני 2-3 דורות.
  4. השתמש בילודים בקעו בתוך פרק זמן מסוים (למשל, <3 שעות) למדידת זמן ההישרדות. כדי למנוע הטיות אפשריות בבחירת האדם היחיד, אם כי מאוד לא סביר, לבדוק שחזור באמצעות מספר indeתת-אוכלוסיות משתלשלות.
    הערה: כפי rotifers בדרך כלל לשחזר רק asexually תחת תנאי זה, להבטיח ללא זכרים נוכחים לאורך כל הניסוי. הזכרים קטנים יותר בילודים ובדרך כלל לנוע מהר יותר מאשר נקבות. לנקבות יש Mictic: אורך חיים שונים נקבות amictic בתנאים מסוימים 29.

4. מדידות של הישרדות זמן

  1. בילודים מקום בצלחות פלסטיק (בדרך כלל 24 או צלחות 48-היטב, עם כל 1 מ"ל המכיל גם של מי ים מלאכותיים).
  2. בגיל 24 מרווחי hr, להעביר את rotifers למדיה ותרבות המוכנות חדש או ב 12 מרווחי hr אם בטמפרטורה גבוהה (30 ° C ומעלה). רשום את מספר הצאצאים והאם כל אדם חי או מת. רשום את rotifer כמת כאשר תנועת ריסים של העטרה הפסיקה לחלוטין.
    הערה: rotifers לעתים קרובות לצרף הקירות הצדדיים של בארות. pipetting העדין של המים מסייע למצוא אותם. אם rotifers לא נמצא או arדואר ניזוק באופן מקרי על ידי pipetting, להקליט אותם, כמו "צנזורה", לא כמו "מת".
  3. סור בילודים כאשר rotifers הניסיון להתרבות באופן פעיל. ילודים לצמוח במהירות וזה לפעמים קשה להבדיל ביניהם לבין rotifers הניסיון.

ניתוח 5. נתונים

  1. צור את עקומת ההישרדות קפלן-מאייר (איורים 1 ו -2) על ידי התוויית שיעור ההישרדות המצטברת על ציר Y וזמן על ציר X. זהו הייצוג הנפוץ ביותר של נתוני הישרדות. השתמש בבדיקת הלא פרמטרית log-rank (נקרא גם מבחן מנטל-קוקס) עבור השוואה סטטיסטית של זמן ההישרדות 34. מבחן log-rank כלול גם חבילות סטטיסטיות מקובלות אחרות כגון JMP ור '
    הערה: אל תשתמש מבחן t או הניתוח של סטודנטים שונים (ANOVA) ואחריו השוואה מרובה פרמטרית כי התפלגות נורמלית בדרך כלל לא פגשה נתוני הישרדות 35. כמו כן, אלה methods לא לוקח אנשים מצונזרים בחשבון. מאן-ויטני U הבדיקה יכולה לשמש אם אין נתונים מצונזרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות


איור 1 מציג עקומות הישרדות נציג של אוכלוסיות מסונכרנות היטב (מתוך שני משכפל). בניסוי זה, rotifers היו או היומיום הפד [כרצונך (AL) הקבוצה] או בכל יום אחר (IF קבוצה). חציון ההישרדות עמד על 13 ו -18 ימים באזור אל ואם קבוצות, בהתאמה. למרות זאת ידוע היט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למדידת זמן ההישרדות rotifers Brachionus. השלב הקריטי הוא סנכרון תנאי rotifer במשך כמה דורות. כאשר rotifers ניסיוני מסונכרנים היטב, עקומת ההישרדות לי סוג טיפוסי הוא ציין עם תמותה מוקדמת מעט מאוד כפי שדווח בכמה מחקרים קודמים 18,24,37,38. סטיות התקן של ז?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ג'ורג ג'רוויס, מרתה בוק, ובט היקוקס-לאה, במעבדה לביולוגיה ימית, על עזרתם הצילומים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideWako190-13921
Magnesium chlorideWako136-03995
Magnesium sulfateWako131-00427
Potassium chlorideWako168-22111
Calcium chlorideWako035-00455
Sodium bicarbonateWako199-05985
Sodium bromideWako190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)MilliporeHAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treatedThomas Scientific6902D01Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treatedThomas Scientific6902D07Flat bottom
Tetraselmis, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersion 6.0d

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113Monogonontarotifer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved