وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا على وعود كبيرة سريريا. في هذا الصدد، وخلايا متعددة القدرات، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة)، ويمكن استخدام العلاجي، في المستقبل القريب، لاستعادة وظيفة لأعضاء تالفة. ومع ذلك، العديد من القضايا الفنية، بما في ذلك إجراء الغازية للغاية من عزل اللجان الدائمة وعدم الكفاءة المحيطة التضخيم، وتعيق حاليا استخدام السريرية المحتملة لهذه الطرائق العلاجية. هنا، ونحن نقدم طريقة فعالة للغاية لتوليد الخلايا الدهنية dedifferentiated (DFAT)، وخلايا لجنة السلامة البحرية الشبيهة. ومن المثير للاهتمام، وخلايا DFAT يمكن التفريق إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. على الرغم من أن مجموعات أخرى قد قدمت سابقا أساليب مختلفة لتوليد خلايا DFAT من الأنسجة الدهنية ناضجة، يسمح لدينا وسيلة لنا لإنتاج خلايا DFAT أكثر كفاءة. وفي هذا الصدد، علينا أن نبرهن على ثقافة DFAT المتوسطة (DCM)، تستكمل مع 20٪ FBS،هو أكثر فعالية في توليد خلايا DFAT من DMEM، على أن تستكمل مع FBS 20٪. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا DFAT التي تنتجها طريقة لدينا ثقافة الخلية يمكن redifferentiated إلى عدة أنواع الأنسجة. على هذا النحو، وقدم نموذجا مثيرة جدا للاهتمام ومفيدة للدراسة فقد التمايز الأنسجة.

Introduction

العلاج بالخلايا وهندسة الأنسجة هي المواضيع الساخنة في مجال الطب التجديدي ^1-5. في حين أن هذه الطرائق العلاجية على وعود كبيرة، العديد من القضايا الفنية تعرقل حاليا استخدام السريري. في هذا الصدد، كما هو الحال في توليد خلايا الجذع، يجب على جميع العلاجات هندسة الأنسجة تنتج خلايا خالية من transductions الجين الخارجية من أجل الحفاظ على سلامة المرضى. وفقا لذلك، كنا المجموعة الأولى لإنتاج خلايا DFAT الإنسان ⁶ بنجاح. وقد تبنت عدة مجموعات بحثية أخرى منذ أسلوبنا على توليد خلايا DFAT من أصل الثدييات ^7-9، إلقاء مزيد من الضوء على فائدة نموذجنا.

على مدى العديد من الدراسات، وجدنا أن نوعية البيئة زراعة الخلايا يمكن تعديلها عن طريق ضبط محتوى المتوسطة الخلية. وقد أدى هذا الاكتشاف إلى زيادة في معدل النجاح من إنتاج خلايا DFAT وتحسنت نوعية الخلية؛ كل من العوامل الحاسمة فيتوليد كفاءة الخلايا للتجارب السريرية في المستقبل. في هذا الصدد، وتحسين DFAT الثقافة المتوسطة (DCM، وسيلة مماثلة لالجذعية الوسيطة المتوسطة الخلية، والتي تحتوي على الانسولين المؤتلف البشري، الزلال في الدم، وحمض-L الجلوتاميك، والعديد من الأحماض الدهنية، والكولسترول) وطريقة لتوليد الخلايا DFAT و وقد وضعت انتشار (للمزيد من المعلومات عن محتويات DCM متاحة عند الطلب). تم إنشاء استخدام هذا الأسلوب جودة عالية خلايا DFAT مع القدرة على التمايز إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. وإجمالا، هذا البروتوكول زراعة الخلايا التحقق من صحة يحسن نوعية الخلايا DFAT وقد تكون مفيدة للغاية لتعزيز التطبيقات السريرية لعلاج الخلايا وهندسة الأنسجة.

Protocol

وقد تم الحصول على عينات من الدهون تحت الجلد البشري من المرضى الذين يخضعون لجراحة في أقسام جراحة التجميل، جراحة المسالك البولية، جراحة الأطفال وجراحة العظام في مستشفى إيتاباشي جامعة نيهون (طوكيو، اليابان). المرضى أعطى موافقة خطية مطلعة، وافقت لجنة الأخلاقيات من جامعة نيهون كلية الطب الدراسة.

1. نسيج التحضير

1. جلب عينات الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر.
2. غسل 1-2 غرام من الأنسجة الدهنية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (-) في درجة حرارة الغرفة (RT) مرة واحدة، في أنبوب 50 مل ثم وضع العينة في طبق من البلاستيك 10 سم.

2. كولاجيناز الهضم

1. إزالة عينة من برنامج تلفزيوني (-)، ثم إضافة 10 مل من معقم 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز (كولاجيناز النوع الثاني) إلى الطبق الذي يحتوي على عينة الأنسجة.
2. اللحم المفروم مع النسيج المقص الجراحي لحوالي 15 دقيقة، حتى تصل إلى المهروس تتألفency.
3. وفي وقت لاحق، هضم الأنسجة المفروم في 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (60 دورة في الدقيقة) في أنبوب 50 مل مع الإثارة لطيف على شاكر.
4. تصفية العينة هضمها من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. بعد ذلك، تمرير 10 مل من DCM (انظر الجدول المواد) تستكمل مع 2٪ FBS من خلال مرشح.

عزل 3. خلية

1. الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
2. في هذه المرحلة، وإعداد 5 مل من DCM تستكمل مع 2٪ FBS في أنبوب 50 مل.
3. بعد ذلك، وضع الخلايا الدهنية العائمة باستخدام ماصة ميكرولتر 1000 وإضافة الخلايا إلى 50 مل أنبوب يحتوي المتوسطة.
4. وفي وقت لاحق، هز أنبوب 50 مل بلطف لمزج المتوسطة DCM مع الخلايا.
5. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
6. تجاهل المتوسطة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام 18 G إبرة وحقنة 20 مل.
7. المقبل، إضافة 10 مل من DCM الصورةupplemented مع 2٪ FBS إلى الخلايا التي تم جمعها.
8. خلط DCM مع الخلايا عن طريق هز أنبوب 50 مل بلطف.
9. أنبوب الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.

4. خلايا التصفيحات

1. إضافة 41 مل من DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪ إلى 12.5 سم قارورة.
2. بعد ذلك، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر إضافة 40 ميكرولتر من الخلايا الدهنية إلى القارورة.
3. ثم، تملأ القارورة مع DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪. خطوة حاسمة: عند هذه النقطة، وضمان أن الخلايا تنتشر في جميع أنحاء المتوسط. بصريا فحص خلايا منفصلة، ​​وبعد ذلك الحفاظ على قارورة على غطاء طبق بتري مستديرة للحفاظ على انها مسطحة.
4. وأخيرا، ضع قارورة داخل الحاضنة وترك الأمر دون عائق في 5٪ CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
5. بعد أسبوع من الحضانة، عكس القارورة والتحقق من وجود خلايا DFAT. بعد ذلك، تقييم DFAT جيل خلية الكفاءة كما هو موضح ¹⁰ منذ في هذا fibrobl نقطةوتقع خلايا مثل AST (خلايا DFAT) في مناطق مختلفة من الخلايا الدهنية.
6. تستكمل إضافة 5 مل من DCM أو DMEM مع FBS 20٪ إلى قارورة بعد إزالة خلية ثقافة المتوسط ​​السابق. السماح للخلايا DFAT لتنمو لمدة أسبوع آخر بعد تغيير المتوسطة.
7. باستخدام عداد الخلية، وحساب عدد الخلايا DFAT ولدت في ظل ظروف مختلفة الثقافة الخلية (DCM مقابل DMEM).

النتائج

في هذه الدراسة، تم تحسين طريقة وأدوات لتوليد الخلايا DFAT (الشكل 1). لدينا وسيلة تسمح لنا لتوليد خلايا DFAT باستخدام كل DCM والمتوسطة DMEM تحتوي على 20٪ FBS (الشكل 2A). على هذا النحو، قارنا كفاءة DCM وDMEM في توليد خلايا DFAT. في هذا الصدد، وتعزيز DC...

Discussion

الخلايا الشحمية الناضجة التي تخضع لها فقد التمايز في المختبر، وهي عملية تعرف باسم الثقافة السقف، قد العودة إلى النمط الظاهري أكثر بدائية واكتساب قدرات التكاثري. ويشار إلى هذه الخلايا إلى خلايا الدهون كما dedifferentiated (DFAT). تم تقييم إمكانات multilineage تمايز الخلايا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G needle	NIPRO	02-002
20 ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550