Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Резюме

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Аннотация

Тканевая инженерия и клеточная терапия весьма перспективны клинически. В связи с этим, мультипотентных клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), может быть использовано в терапевтических целях, в ближайшем будущем, для восстановления функции поврежденных органов. Тем не менее, некоторые технические вопросы, в том числе весьма инвазивной процедуры выделения MSCs и неэффективностью окружающих их усиление, в настоящее время препятствуют потенциальное клиническое применение этих терапевтических методов. Здесь мы вводим высокоэффективный метод для генерации дедифференцированных жировых клеток (DFAT), МСЦ-подобных клеток. Интересно отметить, что DFAT клетки могут быть дифференцированы в нескольких типах клеток, включая Adipogenic, остеогенных и хондрогенных клеток. Хотя другие группы ранее были представлены различные методы для создания клеток DFAT из зрелой жировой ткани, наш метод позволяет более эффективно производить клетки DFAT. В связи с этим, мы показали, что DFAT культуральную среду (ДХМ), дополненной 20% ФБС,более эффективен в создании клеток DFAT чем DMEM, дополненной 20% FBS. Кроме того, клетки, полученные DFAT нашим методом культивирования клеток может быть повторно дифференцироваться в несколько типов ткани. Таким образом, очень интересная и полезная модель для изучения дифференцировке тканей представлена.

Введение

Клеточная терапия и тканевая инженерия являются горячие темы в области регенеративной медицины ^1-5. В то время как эти терапевтические методы весьма перспективны, несколько технических вопросов, в настоящее время препятствуют их клинического применения. В связи с этим, как и в поколении плюрипотентных клеток, все тканевой инженерии терапии должны продуцировать клетки в отсутствие внешних каскадов, генов для того, чтобы поддерживать безопасность пациента. Соответственно, мы были первой группой , чтобы успешно производить клетки DFAT человека ^6. Несколько других исследовательских групп , так как принят наш метод для создания DFAT клетки млекопитающего ^7-9, дополнительно подчеркивая полезность нашей модели.

В течение нескольких исследований, мы обнаружили, что качество окружающей среды для культивирования клеток, может быть изменена путем корректировки содержания клеточной среды. Это открытие привело к увеличению скорости успеха производства DFAT клеток и улучшение качества клеток; оба решающими факторамиэффективно создания клеток для будущих клинических испытаний. В связи с этим, улучшенной DFAT культуральной среды (ДХМ, среду, подобную мезенхимальных стволовых клеток среду, которая содержит рекомбинантный человеческий инсулин, сывороточный альбумин, L-глутаминовую кислоту, несколько жирных кислот и холестерина), и способ для генерации DFAT клеток и пролиферация была разработана (более подробную информацию о содержании DCM предоставляется по запросу). С помощью этого метода высокого качества DFAT клетки генерировались с возможностью дифференцироваться в несколько типов клеток, в том числе Adipogenic, остеогенных и хондрогенных клеток. В целом, это подтверждено протоколом культуры клеток повышает качество клеток DFAT и может быть весьма полезным для повышения клинического применения клеточной терапии и тканевой инженерии.

протокол

Образцы человеческого подкожной жировой клетчатки были получены от пациентов, перенесших операцию в департаментах пластической хирургии, урологии, детской хирургии и ортопедической хирургии Университета Нихон Итабаси больницы (Токио, Япония). Пациенты дали письменное информированное согласие, а Комитет по этике Университета Нихон Медицинской школы одобрил исследование.

1. Подготовка ткани

1. Доведите образец ткани из операционной в лабораторию.
2. Мытье 1-2 г жировой ткани с 5 мл PBS (-) при комнатной температуре (RT) один раз, в 50 мл пробирку, а затем поместить образец в 10 см пластиковую чашку.

2. коллагеназы

1. Извлеките образец из PBS (-), а затем добавляют 10 мл стерильного 0,1% (вес / объем) раствора коллагеназы (коллагеназа типа II), в чашку, содержащую образец ткани.
2. Фарш ткани с хирургическими ножницами в течение примерно 15 мин, пока она не достигнет протертые состоятьобразность.
3. Впоследствии переваривать измельченной ткани в 0,1% (вес / объем) раствора коллагеназы при 37 ° С в течение 30 мин (60 оборотов в минуту) в 50 мл пробирку с осторожном встряхивании на качалке.
4. Фильтр Расщепленный образец через фильтр с размером 100 мкм в 50 мл пробирку. Затем пройти 10 мл ДХМ (см таблицу материалов) , дополненной 2% FBS через фильтр.

3. Выделение клеток

1. Центрифуга отфильтрованные клетки при 100 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
2. На данный момент, подготовить 5 мл ДХМ с добавлением 2% FBS в 50 мл пробирку.
3. Затем, нарисуйте вверх плавающих жировых клеток с помощью 1000 мкл пипетку и добавьте клетки 50 мл пробирку, содержащую среду с.
4. Впоследствии, встряхнуть 50 мл пробирку осторожно перемешать среду DCM с клетками.
5. Затем, отцентрифугировать пробирку при 100 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
6. Откажитесь среды в нижней части трубки, используя 18 г иглу и 20 мл шприца.
7. Затем добавляют 10 мл DCM supplemented с 2% FBS в собранных клеток.
8. Смешайте DCM с клетками путем встряхивания 50 мл трубку осторожно.
9. Отцентрифугировать пробирку при 100 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.

4. Покрытие клетки

1. Добавить 41 мл ДХМ или DMEM, дополненной 20% FBS до 12,5 см колбу.
2. Далее, используя 200 мкл пипеткой добавляют 40 мкл жировых клеток в колбу.
3. Затем заполнить колбу с DCM или DMEM, дополненной 20% FBS. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: На данный момент, убедитесь, что клетки разбросаны по всей среде. Визуально проверьте отдельные клетки, а затем держать колбу на крышке круглой чашке Петри, чтобы держать его квартиру.
4. Наконец, колбу помещают внутри инкубатора и оставить его ненарушенных в 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 7 дней.
5. После недельной инкубации, инвертировать колбу и проверять клетки DFAT. Затем оценить DFAT поколение клеток знания , как описано ¹⁰ , так как в этой точке fibroblAST-подобные клетки (DFAT клетки) расположены в регионах, отличных от жировых клеток.
6. Добавляют 5 мл ДХМ или DMEM с добавлением 20% FBS в колбу после удаления предыдущей клеточной культуральной среды. Дайте клеткам DFAT расти еще на одну неделю после того, как изменения среды.
7. С помощью счетчика клеток, подсчитывают количество клеток DFAT, генерируемых при различных условиях культивирования клеток (ДХМ против DMEM).

Результаты

В этом исследовании, метод и инструментарий для генерации DFAT клеток была улучшена (Рисунок 1). Наш метод позволяет генерировать клетки DFAT использованием как DCM и среды DMEM , содержащей 20% FBS (рис 2А). Таким образом, мы сравнили эффективность DCM и DMEM в фор...

Обсуждение

Зрелые адипоциты , которые проходят в пробирке дедифференциации, процесс , известный как потолок культуры, может вернуться к более примитивным фенотипа и получить пролиферативные способности. Эти клетки называются дедифференцируются жир (DFAT) клеток. Мультилинейной дифференциаци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G needle	NIPRO	02-002
20 ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550