שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

הנדסת רקמות טיפול בתאים להחזיק הבטחה גדולה קלינית. בהקשר זה, תאי מולטיפוטנטיים, כגון תאי גזע mesenchymal (MSCs), ניתן להשתמש לצורך טיפולי בעתיד הקרוב, כדי לשקם את תפקוד לאיברים פגומים. אף על פי כן, כמה בעיות טכניות, לרבות הליך פולשני מאוד לבודד MSCs ואת יעילות שמסביב הגברה שלהם, כרגע לעכב את השימוש הקליני הפוטנציאל של שיטות טיפול אלה. בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה ביותר עבור הדור של תאי שומן dedifferentiated (DFAT), תאי MSC דמויים. מעניין לציין, כי תאים DFAT ניתן להבדיל לכמה סוגי תאים כולל adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. למרות קבוצות אחרות בעבר הציגו שיטות שונות להפקת תאי DFAT מרקמות שומן בוגרות, השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT בצורה יעילה יותר. בהקשר זה, אנו מראים כי מדיום תרבות DFAT (DCM), בתוספת 20% FBS,הוא יעיל יותר ביצירת תאי DFAT מ DMEM, בתוספת 20% FBS. בנוסף, תאי DFAT המיוצרים על ידי שיטת תרבית תאים שלנו ניתן redifferentiated לתוך סוגי רקמות שונים. ככזה, מודל מעניין ושימושי מאוד לחקר dedifferentiation רקמות מוצג.

Introduction

Cell טיפול והנדסת רקמות הם נושאים חמים בתחום של רפואה רגנרטיבית ^1-5. בעוד שיטות טיפול אלה מחזיקות הבטחה גדולה, כמה בעיות טכניות כרגע לעצור בשימושו הקליני שלהם. בהקשר זה, כמו בדור של תאי שב"ס, כל טיפולי הנדסת הרקמות חייבים לייצר תאים ללא transductions גן החיצוני על מנת לשמור על בטיחות חולה. בהתאם לכך, היינו הקבוצה הראשונה לייצר תאי DFAT אדם בהצלחה ^6. מספר קבוצות מחקר אחרות מאז אמצו את השיטה שלנו כדי לייצר תאי DFAT ממוצא יונק ^7-9, עוד המדגישות את התועלת של המודל שלנו.

במהלך מספר מחקרים, מצאנו כי איכות סביבת תרבית תאים ניתן לשנות על ידי התאמת התוכן של המדיום הסלולרי. ממצא זה הוביל לעלייה בשיעור ההצלחה של ייצור תאי DFAT ואיכות תא משופר; הן גורמים קריטייםיצירת תאים ביעילות לניסויים קליניים עתידיים. בהקשר זה, מדיום תרבות משופר DFAT (DCM, מדיום דומה mesenchymal גזע מדיום סלולארי, המכיל אינסולין אנושי רקומביננטי, אלבומין, חומצת L-גלוטמית, כמה חומצות שומן, כולסטרול) שיטה לייצור תאי DFAT ו התפשטות פותחה (מידע נוסף על התוכן של DCM זמין לפי בקשה). שימוש זה תאי שיטה באיכות גבוהה DFAT נוצרו עם היכולת להתמיין לסוגי תאים שונים, הכוללים adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. בסך הכל, פרוטוקול תרבית תאי תוקף זה משפר את איכות תאי DFAT ועשוי להיות שימושי למדי עבור שיפור יישומים קליניים של טיפול בתאים והנדסת רקמות.

Protocol

דוגמאות של שומן תת עורי האנושי התקבלו מחולים שעברו ניתוח במחלקות לכירורגיה פלסטית, אורולוגיה, כירורגיה ילדים כירורגיה אורתופדית בבית החולים איטבאשי אוניברסיטת ניהון (טוקיו, יפן). החולים נתן הסכמה בכתב הודיע, וועדת האתיקה של אוניברסיטת ניהון לרפואה אישרה את המחקר.

1. רקמות הכנה

1. תביאו את דגימת רקמה מחדר הניתוח למעבדה.
2. לשטוף 1-2 גרם של רקמה שומנית עם 5 מ"ל של PBS (-) בטמפרטורת החדר (RT) פעם, בתוך שפופרת 50 מ"ל ולאחר מכן הנח את הדוגמה צלחת פלסטיק 10 ס"מ.

2. עיכול Collagenase

1. הסר את המדגם מתוך PBS (-), ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 0.1% סטרילי (w / v) פתרון collagenase (סוג Collagenase השנייה) כדי בצלחת המכילה את דגימת רקמה.
2. לרכך את הרקמה עם מספרי כירורגיות למשך כ 15 דקות, עד שהוא מגיע מחיה מורכבתency.
3. בהמשך לכך, לעכל את הרקמה טחון ב -0.1% (w / v) פתרון collagenase על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (60 סל"ד) בצינור 50 מ"ל עם תסיסה עדינה על שייקר.
4. סנן המדגם מתעכל דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של DCM (ראו טבלה של חומרים) בתוספת 2% FBS דרך המסנן.

בידוד תא 3.

1. צנטריפוגה תאים המסוננים ב 100 XG דקות 1 ב RT.
2. בשלב זה, להכין 5 מ"ל של DCM בתוספת 2% FBS בתוך שפופרת 50 מ"ל.
3. בשלב הבא, לצייר את תאי השומן צף בעזרת פיפטה 1,000 μl ולהוסיף את התאים במדיום המכיל 50 מ"ל צינור.
4. בהמשך לכך, לנער את שפופרת 50 מ"ל בעדינות לתערובת המדיום DCM עם התאים.
5. לאחר מכן, צנטריפוגות הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.
6. מחק את המדיום בתחתית הצינור באמצעות מחט 18 G ו מזרק 20 מ"ל.
7. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של DCM supplemented עם 2% FBS אל התאים שנאספו.
8. מערבבים את DCM עם התאים על ידי טלטול שפופרת 50 מ"ל בעדינות.
9. צנטריפוגה הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.

4. תאי ציפוי

1. להוסיף 41 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת FBS 20% בבקבוק 12.5 ס"מ.
2. לאחר מכן, בעזרת פיפטה 200 μl להוסיף 40 μl של תאי השומן אל הבקבוק.
3. לאחר מכן, למלא את הבקבוק עם DCM או DMEM בתוספת 20% FBS. שלב קריטי: בשלב זה, להבטיח כי התאים מפוזרים ברחבי בינוני. ראייה לבדוק את התאים המנותקים ולאחר מכן לשמור את הבקבוק על המכסה של צלחת פטרי עגולה כדי לקבע אותו שטוח.
4. לבסוף, הניחו את הבקבוק בתוך האינקובטור ולהשאיר אותה ללא הפרעה חממה 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
5. לאחר שבוע של דגירה, להפוך את הבקבוק לאיתור תאי DFAT. לאחר מכן, להעריך שליטת דור תא DFAT כמתואר ¹⁰ מאז ב fibrobl בנקודה זותאי אס 'דמוי (תאי DFAT) ממוקמים באזורים מובחנים מתאי שומן.
6. הוסף 5 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת 20% FBS אל הבקבוק לאחר הסרת המדיום תרבית תאים הקודמת. אפשר תאי DFAT לגדול במשך שבוע נוסף לאחר שינוי המדיום.
7. באמצעות דלפק תא, לספור את מספר תאי DFAT שנוצרו בתנאי תרבית תאים שונים (DCM לעומת DMEM).

תוצאות

במחקר זה, שיטת ערכת הכלים עבור דור תא DFAT השתפרו (איור 1). השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT היא באמצעות DCM ו DMEM בינוני המכילים 20% FBS (איור 2 א). ככזה, השווינו את היעילות של DCM ו DMEM ביצירת תאי DFAT. בהקשר זה, DCM משופרת התפשטות תאים DFAT פי שלו?...

Discussion

Adipocytes מבוגרים שעוברים ב dedifferentiation במבחנה, תהליך המכונה תרבות תקרה, עלול לחזור פנוטיפ פרימיטיווי יותר ולהשיג יכולות שגשוג. תאים אלה מכונים שומן dedifferentiated כתאים (DFAT). פוטנציאל בידול multilineage של תאי DFAT הוערך. Cytometry זרימה חשף ניתוח ביטוי ניתוח גנים שתאי DFAT היו הומוג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 μm Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5 cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G needle	NIPRO	02-002
20 ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550