Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Abstract

الضامة والخلايا الجذعية (DCS) هي خلايا المناعة الفطرية الموجودة في الأنسجة والأعضاء اللمفاوية التي تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. ومع ذلك، فهي من الصعب عزل بأعداد كافية لدراستها بالتفصيل، لذلك، وضعت في المختبر النماذج. في المختبر ثقافات العظام الضامة المشتقة من نخاع والخلايا الجذعية هي طرق قيمة راسخة والدراسات المناعية. هنا، يتم وصف طريقة لزراعة وتحديد كل من البلدان النامية والضامة من ثقافة واحدة من خلايا نخاع العظام باستخدام الأساسي خلوى محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF). ويستند هذا البروتوكول على إجراءات المتبعة أول من وضعه لوتز وآخرون. في عام 1999 للعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع. الثقافة هي غير متجانسة، وتستخدم MHCII وحمض الهيالورونيك fluoresceinated (FL-HA) للتمييز الضامة من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة. تستمد هذه GM-CSF الضامة المواليةبنصيحة مصدر مناسب من الضامة في المختبر المشتقة التي تشبه البلاعم السنخية في كل من النمط الظاهري وظيفة.

Introduction

وقد وصفت العديد من الطرق الثقافة في المختبر لتوليد العظام الضامة المشتقة من نخاع (BMDMs) والعظام البلدان النامية المشتقة من نخاع (BMDCs) باستخدام واحد أو مزيج من عوامل النمو. BMDMs يمكن توليدها عن طريق زراعة خلايا نخاع العظام باستخدام إما بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) أو GM-CSF 1،2. لBMDCs، إضافة FLT3 يجند للثقافة نخاع العظام يثير البلدان النامية الكلاسيكية وبلازماوية الشكل غير ملتصقة (CD11c وعالية / MHCII عالية وCD11c والصغرى، B220 + على التوالي) بعد 9 أيام في الثقافة 3،4. في المقابل، الخلايا غير ملتصقة ولدت بعد 7-10 أيام في الثقافة مع GM-CSF وحدها 5،6، GM-CSF و IL-4 7، أو GM-CSF وFLT3 يجند 8،9 توليد BMDCs تشبه عن كثب البلدان النامية التهابات (الأعلى CD11c و، MHCII مرتفعة CD11b +) 10. في حين تستخدم هذه في المختبر الثقافات لتوليد الضامة أوالبلدان النامية، فمن غير الواضح إذا كان كل ثقافة يثير مجموعات نقية. على سبيل المثال، على الرغم من وصفها الخلايا الملتصقة في الثقافات GM-CSF أن يكون الضامة 5، الخلايا غير ملتصقة من نفس الثقافة وتستخدم البلدان النامية 6،11-13، مع افتراض أنها متجانسة وأي تقلب ملاحظتها نظرا لمراحل مختلفة من التنمية 14،15. وعلاوة على ذلك، وقد وجدت الدراسات GM-CSF لانه عامل نمو أساسي للتنمية البلاعم السنخية في الجسم الحي 16،17، ويمكن استخدامها في المختبر لتوليد الضامة مثل السنخية 16،17،18.

البعض من الالتزام، والإجراءات لتوليد الضامة والبلدان النامية من GM-CSF تعامل الثقافات نخاع العظم هي مشابهة جدا مما يشير إلى عدم التجانس قد تكون موجودة داخل GM-CSF الثقافات نخاع العظام. هذا يبدو في الواقع أن هذا هو الحال كما أفادت ورقتين وجود BMDMs في جزء غير ملتصقة الثقافات BMDC. في ورقة واحدة، فإنها identifiإد يبلغ عدد سكانها الخلايا كما CD11c و+، CD11b +، MHCII منتصف، MerTK +، وCD115 +، الذي أعرب عن التعبير توقيع الجينات التي تشبه كثيرا الضامة السنخية وكان انخفاض القدرة على تنشيط خلايا T 19. الورقة الثانية تستخدم MHCII وFL-HA لتحديد السكان مثل بلعم السنخية (CD11c و+، MHCII منتصف / منخفضة، وارتفاع FL-HA) التي كانت متميزة من غير ناضجة (CD11c و+، MHCII منتصف، FL-HA منخفض) وناضجة البلدان النامية (CD11c و+، MHCII عالي)، سواء ظاهريا وظيفيا 18. توضح هذه الأوراق على حد سواء أن الثقافات GM-CSF BMDC غير متجانسة، تحتوي على كل بلعم وسكان العاصمة مشيرا إلى أن ينبغي الحرص عند تفسير البيانات من الثقافات BMDC.

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل نخاع العظم، خلايا نخاع العظام الثقافة في GM-CSF، وتحديد السنخية مثل بلعمالسكان من البلدان النامية غير الناضجة والناضجة في ثقافة نخاع العظام عن طريق التدفق الخلوي باستخدام FL-HA ملزمة والتعبير MHCII. ويستند هذا الإجراء على الإجراء المعمول بها لوتز وآخرون (6) وغير قادرة على توليد 5 - 10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة في يوم 7 من ثقافة 10 مل. الثقافة هي قابلة للاستخدام من أيام 7-10 وينتج مجموعة متغايرة من الضامة، البلدان النامية غير الناضجة والناضجة، وكذلك بعض الأسلاف في يوم 7. وهذا يوفر طريقة بسيطة لزراعة وعزل في المختبر الضامة السنخية مثل بكميات كبيرة.

Protocol

والموت الرحيم الفئران وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لأبحاث الحيوان الأخلاقي الإجراءات المعتمدة من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان كولومبيا البريطانية.

1. الحصول على خلية واحدة نخاع العظم تعليق من الفأر عظم الفخذ والساق

  1. التبديل على مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لمدة 15 دقيقة قبل بدء الإجراءات لتطهير الهواء مجلس الوزراء والسماح للاستقرار تدفق الهواء، ثم نظيفة / رش سطح BSC مع 70٪ من الإيثانول. إبقاء كل شيء معقمة قدر الإمكان لمجمل البروتوكول. لا قطع عظام في ظل ظروف غير معقمة.
  2. إعداد أدوات تشريح عن طريق نقع في 70٪ من الإيثانول (1 زوج من مقص تشريح، 2 أزواج من ملقط)، محلول ملح هانك المتوازن مع 5٪ مصل العجل الجنين (HBSS-FCS)، أطباق بتري معقمة (100 ملم × 15 ملم)، 1 المحاقن مل، 26½ الإبر قياس، أنابيب جمع المخروطية (15 مل أو 50 مل)، والمناشف الورقية في ش.
  3. الموت ببطء باستخدام الماوسالبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية المؤسسة. تحقيق في BSC، وضع على رأس واحد أو اثنين من المناشف الورقية ورذاذ الفأر مع الايثانول 70٪.
  4. في BSC، فتح العقيمة طبق بتري جو معقم و مطهر، قسامة 10 مل من HBSS-FCS إلى قاعدة و1-2 مل إلى غطاء.
  5. ضع الماوس على بطنه مع الجزء الخلفي مواجهة ورفع الجلد حول أقسام الصدرية مع أصابع اليد غير المسيطرة. استخدام المقص لإجراء شق حيث يتم رفع الجلد.
  6. الابقاء على طرفي قطع، نهاية واحدة مع كل جهة، وبعناية مزق الجلد حول الماوس من الخلف إلى المعدة، ومواصلة سحب حتى اثنين من طرفي لقاء شق في المعدة.
  7. الوجه الماوس لالمعدة مواجهة، وبيد واحدة سحب النصف السفلي من الجلد أسفل نحو الساق، والحفاظ على الانسحاب الجلد حتى يتعرض الساقين.
  8. عقد سفح الماوس صعودا وقطع الأوتار أخيل فوق مفصل الكاحل والأربطة التي تربط العضلات على الاقدام في نهاية السفلى من الساق مع مقص. هذا يخفف من الأقدام من عظام الساق.
  9. في حين الضغط على الساق من القدم، وقطع العضلات والأربطة مع مقص في جميع أنحاء مفصل الركبة في نهاية السفلى من عظم الفخذ لقطع عضلات الفخذ من أسفل الساق. استخدام الملقط لسحب بلطف عضلات خففت بعيدا عن الشظية والسطوح الفخذ. الحرص على عدم قطع الشريان الفخذي لتجنب نزيف حاد.
  10. بيد واحدة على عقد في القدم، اضغط مقص مفتوحة إلى أسفل في نهاية العلوي من عظم الفخذ في مفصل الورك، وتناوب على ساق وسحب بلطف لفصل عظم الفخذ من مفصل الورك أثناء استخدام مقص لجعل خفض النهائي مجانا الساق من الجسم.
  11. من هذه النقطة فصاعدا، عقد فقط النسيج مع ملقط معقم. الابقاء على الساق في نهاية واحدة وسحب قبالة القدم من جهة أخرى.
    ملاحظة: هذا لا ينبغي أن تتطلب الكثير من القوة، كما تم قطع الأربطة التي تربط في الخطوة1.9. بدلا من ذلك، وقطع الساق فقط فوق الكاحل حيث تنصهر العظام.
  12. عقد الساق قبل نهاية البعيدة للعظم الفخذ مع مجموعة واحدة من الملقط والنهاية القريبة من الظنبوب والشظية مع آخر، ثني بعناية الظنبوب والشظية في الاتجاه المعاكس لمفصل الركبة للفصل بينهما من عظم الفخذ والرضفة.
  13. استخدام ملقط لهدم الأربطة والعضلات المتبقية لا تزال تعلق على عظام الساق السفلى. هنا، وإزالة الشظية جنبا إلى جنب مع أنسجة الضامة مع ملقط كما هو صغير جدا بحيث لا يمكن مسح لخلايا نخاع العظام. وضع الساق على تنظيف المقلوب طبق بتري غطاء.
  14. عقد نهاية السفلى من عظم الفخذ مع مجموعة واحدة من الملقط والرضفة مع آخر، ثني الرضفة والأنسجة المحيطة بها في الاتجاه المعاكس للمفصل لإزالة. ثم تنظيف قبالة الأنسجة الضامة من عظم الفخذ المتبقية. سحب منهم بعيدا مع ملقط، ووضعه على المقلوب طبق بتري غطاء. تجاهل الرضفة.
  15. كرر 1.7- 1.13 مع الساق الأخرى إذا لزم الأمر. نقل العظام إلى 1.6 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل العقيمة HBSS-FCS لنقل إذا لزم الأمر.
  16. وضع العظام على طبق بتري غطاء المقلوب، مع 1-2 مل من HBSS-FCS، استخدام ملقط لتنظيف أي نوع من الأنسجة المتبقية لا تزال تعلق على الساق وعظم الفخذ، ثم نقل العظام إلى قاعدة طبق بتري تحتوي على 10 مل من HBSS- FCS. بدلا من ذلك، تنظيف العظام وإزالة الأنسجة العضلية المرفقة باستخدام الايثانول 70٪ الأنسجة غارقة.
  17. قطع كل من العظام في نصف مع مقص. درع جزئيا طبق بيتري مع غطاء العقيمة في حين قطع لضمان عظام البقاء في الطبق. بدلا من ذلك، وقطع في نهاية كل العظام للسماح التنظيف في الخطوة التالية.
  18. إرفاق 26½ G الإبرة إلى حقنة 1 مل، ووضع 1 مل HBSS-FCS من طبق بيتري. إدراج غيض من الإبرة في نهاية قطعة عظم وطرد خلايا نخاع العظام (الأنسجة الناعمة الحمراء داخل العظام). ادخال الإبرة في الرأسمن العظام ونهاية مفتوحة، حتى يتم إزالة كافة نخاع اللون الأحمر. مراقبة عظام بيضاء اللون.
  19. تمرير أي كتل واضحة من نخاع العظام من خلال حقنة عدة مرات لتشكيل تعليق خلية واحدة.
  20. تجاهل العظام مسح. استخدام ماصة 10 مل إلى مزيج تعليق الخلية جيدا ونقل إلى أنبوب جمع. شطف طبق بيتري مرة واحدة مع 5 مل من HBSS-FCS لجمع الخلايا المتبقية في طبق. وضع الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: تعليق خلية نخاع العظام لا تزال قابلة للحياة إذا تخزينها ل2-3 ساعة عند 4 درجات مئوية.

2. طلاء والتثقيف من خلايا نخاع العظام (خلايا نخاع العظم)

  1. تحضير الكواشف واللوازم التالية.
    1. إعداد العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) عن طريق كلوريد الأمونيوم 0.84٪ في الحل النهائي من 2 ملي تريس درجة الحموضة 7.2، ثم تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
    2. إعداد وسائل الاعلام BMC بإضافة 10٪ FCS، 20 ملي HEPES، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، 55 & #181، م 2 المركابتويثانول، 50 U / مل البنسلين والستربتومايسين، 1 ملم البيروفات الصوديوم، و 2 مم L-الجلوتامين لRPMI المتوسطة 1640.
    3. الحصول المتاحة تجاريا المؤتلف GM-CSF أو استخدام GM-CSF التي تحتوي على طاف من AG8.653 خلايا المايلوما transfected مع GM-CSF الجين 20. تحديد تركيز GM-CSF في طاف بواسطة ELISA وإضافة ما يعادل 20 نانوغرام / مل لوسائل الإعلام BMC.
  2. تدور باستمرار خلايا نخاع العظام في 314 x ج لمدة 5 دقائق. بيليه باللون الأحمر، نظرا لكرات الدم الحمراء. في BSC، ونضح طاف باستخدام معقم ماصة باستير الزجاج تعلق على فراغ شفط، تخفيف بيليه بواسطة التنصت، ثم إضافة 10 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. دوامة resuspend الخلايا واحتضان العازلة في تحلل كريات الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة 10 مل من HBSS-FCS ثم تدور الخلايا في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. مراقبة بيليه الخلية كما اللون الأبيض. و resuspend الخلايا في حجم المطلوب من وسائل الإعلام BMC.
  4. عد دورة الفتشوبسبينديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد تلطيخ الخلايا الميتة مع 0.4٪ التريبان الأزرق.
    ملاحظة: إذا تم استخدام نخاع العظام من ساق واحدة (الساق واحد وعظم الفخذ)، resuspend في 5 مل من وسائل الاعلام BMC، وتأخذ 10 ميكرولتر من التعليق الخلية وتمييع مع 70 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق، وتخلط جيدا ونقل 10 ميكرولتر من التخفيف 1/8 الخلية إلى غرفة عدادة الكريات. عد خلايا قابلة للحياة في أربعة أجزاء: متوسط ​​التهم رباعي أربعة س عامل التخفيف × 10 4 = عدد الخلايا لكل مل. وهناك عظم الفخذ والساق من ساق واحدة تسفر عادة حوالي 2-4 × 10 7 الخلايا بعد RBC تحلل.
  5. تقدير عدد 10 مل أطباق من الثقافات نخاع العظام اللازمة لإجراء التجارب النهائية بناء على عدد من مجموع الخلايا اللازمة لإجراء التجارب في نهاية الثقافة.
    ملاحظة: كل طبق يتطلب 2 × 10 6 خلايا نخاع العظام في بذر الأولي وعوائد 5-10 × 10 6 خلايا في يوم 7.
    1. عليمثل عدد من الخلايا للتصفيح في أنبوب جديد، وتدور باستمرار في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، و resuspend الخلايا في 4 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام BMC.
  6. إعداد جديدة معقمة 100 ملم × 15 ملم طبق بتري مع 9.5 مل من وسائل الاعلام BMC تحتوي على 200 نانوغرام من GM-CSF (المؤتلف أو من GM-CSF التي تحتوي على طاف). إضافة 500 ميكرولتر من 4 × 10 6 خلية / خلايا نخاع العظام مل من وسط طبق بيتري لتركيز النهائي من 2 × 10 5 خلية / مل في 10 مل.
    ملاحظة: من المهم استخدام طبق بتري معقمة ليس طبق زراعة الأنسجة. أيضا، عند إضافة الخلايا، وضمان بقاء الخلايا تتركز في الوسط وتقليل التأثير السلبي على الأطباق بعد البذر وخلال التغييرات وسائل الإعلام. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. هذا هو اليوم 0 في الثقافة.
  7. في اليوم 3، إضافة 10 مل من وسائل الاعلام BMC الطازجة التي تحتوي على 200 نانوغرام من GM-CSF إلى كل طبق من الخلايا. الحرص على التقليل من اضطرابات سو الخلايا تتركز في تعليق. الحجم الكلي للثقافة الخلية هو الآن 20 مل.
  8. مراقبة الخلايا تحت المجهر في ضوء التكبير 100X. لاحظ العديد من الخلايا غير ملتصقة (الجولة) وعدد قليل من الخلايا الملتصقة (مسطحة). الخلايا في مجموعات من ثلاثة أو أربعة بتلات تشبه زهرة يمكن أن ينظر إليه، مشيرا إلى انتشار الأسلحة النووية.
  9. في يوم 6 إجراء تغيير وسائل الاعلام نصف. إزالة بعناية 10 مل من وسائل الاعلام في أنبوب 50 مل مخروطي العقيمة، وتدور باستمرار في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح وتجاهل طاف.
  10. resuspend الكرية خلية في 10 مل من وسائل الاعلام BMC الطازجة التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل من GM-CSF، بلطف دوامة وإضافة إلى الطبق ثقافة الخلية الأصلي لإجمالي حجم 20 مل. مراقبة الخلايا تحت المجهر.
    وينبغي أن يكون يوم 7 الثقافة في 70٪ أو أكثر في confluency مع خلايا مسطحة ملتصقة والسحب الكثيفة من خلايا مستديرة غير ملتصقة: ملاحظة.

3. جمع وإعداد BMDC وBMDMs عن التدفق الخلوي

    <لى> حافظ على جميع المخازن في 4 درجات مئوية.
  1. حصاد الخلايا من يوم 7 إلى يوم 10. لحصاد الخلايا، الأول نقل 10 مل من طاف ثقافة إلى 50 مل أنبوب جمع مخروطي الشكل، ثم إمالة طبق عموديا قبل ما يقرب من 30 درجة وغسل الطبق قبل pipetting 10 مل المتبقية الثقافة من أعلى الطبق. كرر هذا يغسل 5 مرات، في كل مرة يدور الطبق بمقدار الثلث.
  2. نقل ما تبقى من 10 مل من الخلايا إلى أنبوب جمع نفسه والتخلص من لوحة والخلايا الملتصقة.
    ملاحظة: سوف يغسل إزالة الخلايا غير ملتصقة وملتصقة فضفاضة. الخلايا الملتصقة مسطحة هي مقاومة للغسيل. عادة، ما بين 5 - من المتوقع 10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة من لوحة واحدة في اليوم و 7 و2-5 × 10 6 خلايا في يوم 10، على الرغم من أن لوتز وآخرون. ذكرت 10 × 10 6 خلايا في يوم 10. لا تؤخذ عادة الخلايا الملتصقة. ومع ذلك، إذا كان يحتاج هذه الخلايا ليتم مقارنة مع الخلايا غير ملتصقة، ويمكن إزالتها على النحو التالي. إضافة 5 مل من 0.7 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4 إلى الطبق بعد إزالة الخلايا غير ملتصقة، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ماصة صعودا وهبوطا لإزالة الخلايا الملتصقة وجمع في أنبوب منفصل.
  3. تدور باستمرار الخلايا التي تم جمعها في 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. resuspend في 5 مل سائل الإعلام BMC العقيمة عند 4 درجات مئوية، دوامة بلطف إلى المزيج، والعد باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
    ملاحظة: كل طبق سوف تسفر 5-10 × 10 6 خلايا غير ملتصقة من ثقافة اليوم 7. من الآن فصاعدا، تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية.
  4. لتحليل تدفق cytometric، ونقل 2 × 10 5 خلايا لكل عينة إلى 5 مل البوليسترين أنابيب أسفل الجولة، إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة عند 4 درجات مئوية (1X الفوسفات مخزنة المالحة، 2 مم EDTA و 2٪ زلال المصل البقري) إلى كل عينة.
  5. تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. مراقبة بيضاء، بيليه مبهمة واضحة فيالجزء السفلي من الأنبوب.
  6. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من الخالي من الملصقات التيسير مستقبلات أب لمنع التيسير مستقبلات ملزم (استخدام 1/10 طاف من 2.4G2 خط انتاج خلايا المايلوما) واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. ثم إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة لكل عينة، بلطف دوامة، ثم تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
  7. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من CD11c و-PeCy7 عند 0.2 ميكروغرام / مل، GR1 والمحيط الهادئ الأزرق عند 0.25 ميكروغرام / مل، MHCII-APC في 0.05 ميكروغرام / مل، وFL-HA في حوالي 2 ميكروغرام / مل لتحديد الضامة والبلدان النامية.
    ملاحظة: تم إعداد FL-HA في المنزل باستخدام فلوريسئين والديك مشط حمض الهيالورونيك ملح الصوديوم كما هو موضح سابقا 21.
  8. احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية للسماح ملزم لسطح الخلية. إضافة 300 ميكرولتر من FACS العازلة لكل عينة، بلطف دوامة، ثم تدور الخلايا في أسفل 314 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف ملاحظة: إذا الحيويوتستخدم الأجسام المضادة tinylated في 3.8، كرر 3،8-9 مع الفلورسنت streptavidin.
  9. غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر آخر من FACS العازلة، بلطف دوامة لخلط وتدور باستمرار الخلايا في 314 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على 0،1-0،2 ميكروغرام لكل مل من يوديد propidium أو دابي لتسمية الخلايا nonviable. الخلايا هي الآن جاهزة لتحليل تدفق cytometric 22.
    ملاحظة: انظر نتائج والشكل (3) لمزيد من التفاصيل من السكان وكيفية بوابات الخلايا.

النتائج

ويرد مخطط يلخص الخطوات الرئيسية لهذه الطريقة في الشكل 1. كثافة ومورفولوجية ثقافة نخاع العظام في أوقات مختلفة من الثقافة وهو مبين في الشكل (2). وفي يوم 1، وخلايا صغيرة ومتفرقة ولكن بعد يوم 3، هناك المزيد من الخلايا، وبعضها أكبر وبدأت ع...

Discussion

في هذه المخطوطة، ونحن نقدم طريقة لتوليد الضامة والبلدان النامية GM-CSF المستمدة من ثقافة نخاع العظام بالنسبة للفئران واحدة أن يتم تكييف من لوتز وآخرون. 6. MHCII التعبير وFL-HA يميز بين البلدان النامية غير ناضجة والضامة ملزم في هذه الثقافة (انظر الشكل 3C)، ا...

Disclosures

The authors have no financial conflicts of interest.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (MOP-جرانت 119503) والعلوم والهندسة مجلس الطبيعية في كندا (NSERC). NSERC كما دعمت دراسية الصيف ليارد ومعتمد من AA YD من جامعة كولومبيا البريطانية (UBC) مع منح زمالة لمدة 4 سنوات، ويدعم AA من قبل CIHR مع جائزة طالب دراسات عليا ماجستير (كلية الدراسات العليا-M). نشكر كالفين Roskelley للحصول على المساعدة مع الاداة المستخدمة لتوليد الصور في الشكل (2). نحن نعترف أيضا بدعم من جامعة كولومبيا البريطانية الحيوان والتدفق الخلوي المرافق.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Flow CytometerBD LSR-II
Automated Inverted Microscope Leica DMI4000 B
Centrifuge Thermo FisherST-40R
Biosafety CabinetNuaireNU-425-600
Syringe 1 mlBD309659
26 1/2 Gauge NeedleBD305111
50 ml Conical Tube Corning357070*Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml)CorningMCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubesCorning352052
Dissection ToolsFine Science Tools *Various *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer Richert1490
Sterile 100 x 15 mm Petri DishCorning351029*Falcon brand
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
Ammonium ChlorideBDHBDH0208-500G
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1600-1
Brefeldin ASigmaB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KGEthylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine SerumThermo Fisher16000-044
Hank's Balanced Salt SolutionThermo Fisher14175-095 
HEPESThermo Fisher15630-0804-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-GlutamineSigmaG8540-100G
LPS UltrapureInvivogentlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher11140-050
Penicillin/Streptomycin 100xThermo Fisher15140-122
Potassium Phosphate MonobasicBDHBDH0268-500G
Potassium ChlorideBDHBDH9258-500G
Recombinant GM-CSFPeprotech315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate SigmaH5388-1G*Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640 Thermo Fisher21870-076No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. 
Sodium ChlorideFisher 5271-10  
Sodium Phosphate DibasicSigma50876-1Kg
Sodium PyruvateSigmaP5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneFisher BioreagentsBP152-5
Trypan BlueSigmaT8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture SupernatantN/AN/AClone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7eBioscience25-0114-82Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450eBioscience48-5931-82Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APCeBioscience17-5321-82Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTKAbcamBAF591Goat polyclonal IgG
Streptavidin PEeBioscience12-4317-87
Propidium IodideSigmaP4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)SigmaD9542-5MG

References

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112 GM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved