마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

요약

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

초록

대 식세포와 수지상 세포 (DC가)는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 담당 조직과 림프 기관에서 발견되는 선천성 면역 세포이다. 그러나 따라서, 시험 관내 모델이 개발되었으며, 자세하게 공부 충분한 수의 분리하기가 어렵다. 골수 유래 대 식세포 및 수상 세포의 체외 배양 면역 연구 노포 가치있는 방법이다. 여기서, 배양 및 사이토킨 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용하여 기본 마우스 골수 세포의 단일 배양액으로부터 수지상 세포 및 대식 세포를 모두 식별하기위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 제 루츠 동부 등에 의해 개발 된 기존의 방법에 기초한다. 골수 유래 수지상에 대한 1천9백99인치 문화는 이질적이며, MHCII 및 형광 표지 히알루 론산 (FL-HA)의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구분하는 데 사용됩니다. 이러한 GM-CSF는 유래 대 식세포 프로밀접하게 표현형과 기능 모두에서 폐포 대 식세포 유사 체외 파생 된 대 식세포의 편리한 소스를 제공해 줄.

서문

몇몇 시험 관내 배양 방법은 골수 유래 대 식세포 (BMDMs) 및 하나 이상의 성장 인자의 조합을 사용하여 골수 - 유래 수지상 세포 (BMDCs)를 생성하기 위해 설명되었다. BMDMs는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 또는 ^{GM-CSF, 2를} 사용하여 골수 세포를 배양하여 생성 될 수있다. BMDCs를 들어, 골수 문화 FLT3 리간드의 추가 (B220 ⁺ 각각의 CD11c ^높은 / MHCII ^높이의 CD11c ^보라)을 문화 ^3,4 9 일 후 비 부착 클래식 형질 수지상을 발생시킨다. 대조적으로, 비 - 부착 세포는 GM-CSF 단독 ^5,6- 함께 배양 7 내지 10 일 후에 생성, GM-CSF 및 IL-4 ⁷ 또는 GM-CSF 및 FLT3 리간드 ^8,9 BMDCs 더 자세히 염증성 수지상 닮은 생성 (중 CD11c ^높은, MHCII ^높은 CD11b를 ^{+) 10.} 이러한 시험 관내 배양 물 식세포를 생성하는데 사용되는 동안 또는각각의 문화는 순수한 인구를 초래하는 경우 DC가, 그것은 명확하지 않다. 예를 들면, GM-CSF에 부착 배양 세포가 동질 및 관찰 가변성 인 추정 식세포 ⁵ 수지상 ^6,11-13로 사용되는 것과 동일한 배양에서 비 부착 세포 인 것으로 설명되었지만 때문에 개발 ^{14, 15의} 다른 단계에. 또한, 연구는 생체 ^16,17 폐포 대 식세포 현상에 필수적인 성장 인자로 GM-CSF를 발견하고, 폐포 대 식세포 ^{16,17,18 형상을} 생성하는 시험 관내에서 사용될 수있다.

접착 이외에, GM-CSF 치료 골수 배양에서 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하기위한 절차는 GM-CSF 골수 배양 물 내에 존재하는 이질성 제안 매우 유사하다. 이것은 참으로이 논문은 BMDC 문화의 비 접착 부분에 BMDMs의 존재를보고 같은 경우 것으로 보인다. 한 논문에서, 그들은 identifiED 가장 밀접 폐포 대 식세포를 닮은 및 T 세포 ^(19)를 활성화하기 위해 환원 능력을 가진 유전자 발현 특성을 발현하는 CD11c ^+를,는 CD11b ^+, MHCII ^미드, MerTK ⁺ 및 CD115 ^+와 같은 세포 집단. MHCII 및 FL-HA 사용되는 두 번째 종이는 폐포 대 식세포와 같은 인구를 식별하는 (중 CD11c ^+를, MHCII ^{중간 / 낮음,} FL-HA ^고) 미숙 구별했다 (중 CD11c ^+를, MHCII ^중반, FL-HA ^낮음) 성숙 DC가 (중 CD11c ^+를, MHCII ^고), 모두 표현형 및 기능 ^18. 이 논문 모두는 대 식세포와 BMDC 문화에서 데이터를 해석 할 때주의해야 그 치료를 나타내는 DC 인구를 모두 포함, GM-CSF BMDC 문화가 이질적인 것을 보여줍니다.

이 프로토콜은 골수, GM-CSF에서 배양 골수 세포를 분리하고, 폐포 대 식세포 등을 식별하는 방법을 설명바인딩 및 MHCII 식 FL-HA를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 골수 문화의 미성숙과 성숙 수지상에서 인구. .이 절차는 루츠 등 ^(6)의 설정 순서에 기초하여, 5 생성 할 수있다 - 10 ㎖의 배양 7 일째에 10 × ¹⁰⁶ 비 - 부착 세포. 문화는 일에서 7 ~ 10에 사용할 수 하루 7이 성장하고 대량으로 체외 폐포와 같은 식세포를 분리하는 간단한 방법을 제공에서 대 식세포, 미성숙과 성숙 수지상뿐만 아니라 일부 전구 세포의 이종 인구를 산출한다.

프로토콜

마우스는 브리티시 컬럼비아 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인 절차에 의한 윤리적 인 동물 연구를위한 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 안락사시켰다.

1. 마우스 대퇴골과 경골에서 단일 세포 골수 서스펜션 취득

1. 생물 안전 캐비닛 (BSC) 70 % 에탄올로, 다음 청소 / 스프레이 B​​SC 표면을 캐비닛 공기를 제거하고 공기 흐름의 안정화를 허용하는 과정의 시작에 앞서 15 분에 전환합니다. 프로토콜의 전체에 대한 가능한 한 무균 모든 것을 유지. 비 멸균 상태에서 뼈를 절단하지 마십시오.
2. 70 % 에탄올에 몸을 담근에 의해 해부 도구를 준비, 5 % 소 태아 혈청 (HBSS-FCS), 멸균 페트리 접시 (100mm X 15mm), 1 행크의 균형 소금 솔루션 (해부 가위, 집게 2 쌍의 1 쌍) BSC에있는 ML의 주사기 26½ 게이지 바늘 원추형 수집 튜브 (15 ml를 50 ml)에 용해시키고, 종이 타월.
3. 사용하여 마우스를 안락사기관의 동물 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜. 상기 BSC로 가져와 하나 또는 두 종이 수건 위에 배치하고 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.
4. 뚜껑에 2 ml의 - BSC에에서 나누어지는,베이스에 HBSS-FCS 10 ml의 1을 멸균 페트리 접시에 무균를 엽니 다.
5. 이 위를 향하도록 뒷면과의 뱃속에 마우스를 놓고 비 지배적 인 손의 손가락으로 가슴 부분 주위의 피부를 들어 올립니다. 피부가 상승 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다.
6. 위의 절개 대회의이 끝날 때까지 당겨 계속 위장 뒤쪽에서 마우스 주위의 피부를 떨어져 당겨 조심스럽게 잘라 양쪽 끝, 각각의 손으로 한쪽 끝을 잡아와.
7. 이 위를 향하도록 위장에 마우스를 플립, 그리고 한 손으로 아래로 다리쪽으로 피부의 아래쪽을 당겨 다리가 노출 될 때까지 피부를 뒤로 당겨 유지한다.
8. 마우스까지의 발을 잡고 발목 관절 위의 아킬레스 힘줄을 잘라근육 접속 인대 위 경골의 하단부에 발한다. 이 다리 뼈에서 발을 느슨하게.
9. 발에서 다리를 들고 있지만, 낮은 다리에서 허벅지 근육을 절단하는 대퇴골의 하단부에 모든 무릎 관절 주위에 가위로 근육과 인대를 잘라. 부드럽게 떨어져 비골과 대퇴 표면에서 느슨하게 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 무거운 출혈을 방지하기 위해 대퇴 동맥을 절단하지 않도록주의하십시오.
10. 한 손으로는 발에 들고, 고관절에서 대퇴골의 상단에서 아래로 눌러 열린 가위, 다리를 회전하고 무료로 마지막 컷을 만들기 위해 가위를 사용하는 동안 고관절에서 대퇴골을 분리 부드럽게 당겨 몸에서 다리.
11. 이후이 시점에서, 전용 살균 집게로 조직을 개최합니다. 일단 다리에 잡고 다른 쪽 다리를 잡아 당깁니다.
    참고 : 연결하는 인대 단계에서 절단으로이 많은 힘을 필요가 없습니다1.9. 또한, 단지 뼈가 융합 발목 위의 경골을 잘라.
12. 한 집게 세트와 서로 경골과 비골의 기단부와 대퇴골의 말단에 의해 다리를 잡고 조심스럽게 대퇴골과 슬개골에서 그들을 분리하는 무릎 관절의 반대 방향으로 경골과 비골을 구부.
13. 여전히 낮은 다리 뼈에 부착 남아있는 인대와 근육을 당겨 집게를 사용합니다. 이 골수 세포를위한 플러시 너무 작아 여기, 집게 결합 조직과 함께 제거 비골. 반전 페트리 접시 뚜껑에 청소 경골를 놓습니다.
14. 한 집게 세트와 서로 슬개골과 대퇴골의 하단을 잡고 제거를위한 공동의 반대 방향으로 슬개골과 주변 조직을 구부리십시오. 그리고 대퇴골에서 결합 조직을 나머지 닦아; 집게와 함께 그들을 떼어과 반전 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다. 슬개골을 폐기하십시오.
15. 1.7 반복- 다른 다리와 1.13이 필요합니다. 필요한 경우 교통 1 ml의 멸균 HBSS - FCS를 포함하는 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 뼈를 전송합니다.
16. 1, 반전 페트리 접시 뚜껑에 뼈를 배치 - HBSS-FCS 2 ㎖ 여전히 경골과 대퇴골에 연결된 모든 잔여 조직을 청소 집게를 사용하여 다음 HBSS- 10 ㎖를 포함하는 페트리 접시의 바닥에 뼈를 전송 FCS. 대안 적으로, 뼈를 세척하고 70 % 에탄올 불린 조직을 사용하여 부착 근육 조직을 제거한다.
17. 가위로 반으로 뼈의 각을 잘라. 뼈가 접시에 머물 수 있도록 절단하면서 부분적으로 멸균 뚜껑 페트리 접시를 보호. 대안으로, 다음 단계에서 세척 할 수 있도록 각각의 뼈의 단부를 잘라.
18. 1 ML의 주사기에에 26½ G 바늘을 부착하고, 페트리 접시에서 1 ml의 HBSS-FCS를 그립니다. 뼈 조각의 끝 부분에 바늘의 끝을 삽입하고 골수 세포 (뼈 안에 부드러운 빨간색 조직)를 세척하십시오. 머리에 바늘을 삽입뼈와 구단의 모든 적색 골수가 제거 될 때까지. 색 흰색으로 뼈를 관찰합니다.
19. 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 주사기를 통해 몇 번 골수의 눈에 보이는 덩어리를 전달합니다.
20. 플러시 뼈를 폐기하십시오. 잘 세포 현탁액을 혼합하고 포집 관에 전송하는 데 10 ml를 피펫을 사용합니다. 접시에 잔류 세포를 수집하는 HBSS-FCS의 5 ㎖로 한 번 페트리 접시를 씻어. 얼음에 세포를 놓습니다.
    주 :이 저장되면 골수 세포 현탁액은 아직 실행 가능 - 39 ° C에서 3 시간.

골수 세포의 2. 도금 및 배양 (골수)

1. 다음 시약 및 소모품을 준비합니다.
   1. 2 mM 트리스 pH를 7.2의 최종 용액에 0.84 %의 염화 암모늄함으로써 적혈구 (RBC) 용해 완충액을 준비하고, 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하여 멸균.
   2. 10 % FCS, 20 mM의 HEPES, 1X 비 필수 아미노산, 55 #를 추가하여 BMC 매체를 준비181; RPMI 배지 1640 M 2- 머 캅토 에탄올, 50 U / ㎖ 페니실린 및 스트렙토 마이신, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 2 mM L- 글루타민.
   3. 시중에서 판매하는 재조합 GM-CSF를 구하거나 GM-CSF 유전자 ^(20)로 형질 Ag8.653로 융합 시킴으로 수 수득 골수종 세포에서 뜨는을 포함하는 GM-CSF를 사용합니다. ELISA에 의해 상층 액에서 GM-CSF의 농도를 결정하고 BMC 미디어에 20 ng를 / ㎖의 등가를 추가합니다.
2. 5 분 동안 314 XG에서 골수 세포를 스핀 다운. 펠렛을 적혈구에 의한 적색이다. BSC에에서, 흡입 진공 활용하여 펠렛을 푼 다음 RBC의 용해 버퍼 10 ㎖를 추가 부착 된 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 뜨는을 대기음. 소용돌이 세포를 재현 탁하고 실온에서 5 분간 RBC 용해 완충액에서 배양.
3. HBSS-FCS 후 5 분 동안 314 XG에서 세포를 회전하고 뜨는을 대기음의 10 ML을 추가합니다. 화이트 색상으로 세포 펠렛을 준수하십시오. BMC 미디어의 원하는 볼륨에서 세포를 재현 탁.
4. resu를 계산0.4 % 트리 판 블루와 죽은 세포를 염색 후 혈구를 사용하여 spended 세포.
   참고 한 다리 (단일 경골 및 대퇴골)에서 골수를 사용하는 경우, BMC 배지 5 ㎖에 재현 탁 세포 현탁액 10 μL를 가지고 블루 0.4 % 트리 판 70 μL로 희석하여 잘 혼합하고 10 μl를 전송할 혈구 챔버 1/8 셀 희석. 사분면 내 생존 세포 수 : 네 사분면 카운트의 평균 희석 계수 × ¹⁰⁴ = mL의 세포 수를 X. RBC 용해 후 4 × 10 ⁷ 세포 - 대퇴골과 한쪽 다리에서 경골은 일반적으로 약 2를 얻을 것입니다.
5. 배양이 끝날 때 실험을 위해 필요한 총 세포 수에 기초하여 하류 실험에 필요한 골수 배양 물 10 ㎖ 접시의 수를 추정한다.
   주 : 각 접시는 2 × 10 ⁶ 골수 초기 시딩에서 세포와 수익률 5 필요 - 7 일에서 10 × 10 ⁶ 세포를.
   1. 알리5 분 동안 314 XG에서 스핀 다운 새 튜브에 도금을위한 셀의 총 개수를 quot 상등액을 흡인하고, BMC 배지에서 4 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁.
6. BMC 매체의 9.5 ml의 GM-CSF (재조합 또는 상층 액을 포함하는 GM-CSF)에서 200 NG를 포함하여 새로운 멸균 100mm X 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 10ml에 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 최종 농도 페트리 접시의 중앙에 4 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖의 골수 세포 500 μl를 추가한다.
   주 : 멸균 페트리 접시가 아닌 조직 배양 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 세포를 추가 할 때 또한, 세포가 중앙에 집중 남아 보장하고 파종 후 미디어를 변경하는 동안 요리에 방해를 최소화 할 수 있습니다. 37 ° C와 5 % CO _2에서 세포를 품어. 이것은 문화의 날 0입니다.
7. 3 일에, 세포의 각 접시에 GM-CSF의 200 NG를 포함하는 신선한 BMC 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 방해 O를 최소화하기 위해주의서스펜션에 집중 세포 F. 세포 배양의 총 부피는 이제 20 ㎖이다.
8. 100X 배율의 광학 현미경 하에서 세포를 관찰한다. 다수의 비 부착 세포 (원형)과 몇 부착 세포 (평면)를 관찰한다. 꽃의 서너 닮은 꽃잎 군에서 세포 증식을 나타내는 볼 수있다.
9. 하루 6 일 반 용지 변경을 수행합니다. 조심스럽게 5 분, 흡인에 대한 314 XG에 스핀 다운, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 10 ㎖를 제거하고 상층 액을 버린다.
10. GM-CSF, 부드럽게 선회 및 20 ㎖ 총 부피의 원래 세포 배양 접시에 20 ng를 추가 / ㎖을 함유하는 신선한 BMC 배지 10 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁. 현미경으로 세포를 관찰한다.
    참고 : 7 일 문화는 70 %에 있거나 부착 평면 셀 라운드 비 부착 세포의 밀도 구름 포화 상태에 더해야한다.

3. 수집 및 유동 세포 계측법에 대한 BMDC와 BMDMs 준비

<리> 4 ° C에서 모든 버퍼를 유지합니다.
1. 셀, 50 ML 원뿔 포집 관에 배양 상등액의 제 1 이송 10ml를 수확하기 위해 하루 10으로 7 일에서 세포를 수확 후 약 30도에 의해 수직으로 접시를 기울이고 나머지 10 ml를 피펫 팅하여 요리를 씻어 요리의 상단에서 문화. 이 세척 5 회, 1/3 접시를 회전 할 때마다 반복합니다.
2. 동일 수집 튜브에 세포의 나머지 10 ml의 이동 플레이트 및 부착 세포를 버린다.
   주 : 세척 비 부착 느슨하게 부착 세포를 제거합니다; 평탄 부착 세포의 세척에 저항. 일반적으로, 5 사이 - 10 × 10 ⁽⁶⁾ 비 부착 세포는 하루 7과 2에 하나의 플레이트에서 예상 -, 10 일에 5 × 10 ⁶ 셀 루츠 외 있지만. 하루에 10에서보고 된 10 × 10 ⁶ 세포를 부착 세포는 정상적으로 수행되지 않습니다. 그러나, 이들 세포는 필요하다면 비 - 부착 세포와 비교 될다음, 그들은 제거 될 수있다. 1X PBS, 비 부착 세포를 제거한 후 접시 pH 7.4의 0.7 mM의 EDTA 5 mL를 추가 분리 튜브에 부착 세포를 제거하고 수집하도록 상하로 5 분, 피펫, 37 ° C에서 배양한다.
3. 5 분 314 XG에서 수집 된 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 5 ml의 멸균 BMC 매체에 재현 탁은, 소용돌이 부드럽게 혼합하고, 트리 판 블루와 혈구를 사용하여 계산합니다.
   참고 : 5 얻을 것입니다 각 접시 - 하루 7 문화 10 × 10 ⁽⁶⁾ 비 부착 세포를. 지금부터, 4 ° C에서 모든 단계를 수행합니다.
4. 유세포 분석, 5 ㎖ 폴리스틸렌 둥근 바닥 튜브에 2 × ¹⁰⁵ 세포를 각각의 샘플에 대한 전달은 각 4 ° C (1X 인산 완충 식염수, 2 mM의 EDTA, 2 % 소 혈청 알부민)로 FACS 완충액 300 μL를 추가 견본.
5. 5 분 314 XG에서 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 상기 보이는 흰색, 불투명 한 펠렛을 관찰튜브의 바닥.
6. 표지 된 Ab의 Fc 수용체 100 ㎕에 재현 탁 된 세포 (골수종 세포주의 제조에서 사용 2.4G2 1/10 뜨는) Fc 수용체 결합을 차단하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양. 그런 다음 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운, 각 샘플 부드럽게 소용돌이에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가하고 뜨는을 대기음.
7. 0.2 ㎍ / ㎖의에서의 CD11c-PeCy7 100 ㎕에 재현 탁 세포, 0.25 ㎍ / ㎖의에서 GR1 - 퍼시픽 블루, 0.05 ㎍ / ㎖의에서 MHCII-APC 및 FL-HA는 약 / ㎖ 2 μg의는 대 식세포와 수지상 세포를 식별합니다.
   주 : FL-HA는 형광 및 닭 빗 히알루 론산 나트륨을 사용하여 집으로 준비는 이전에 설명 ^21.
8. 세포 표면에 결합 할 수 있도록 39 ° C에서 20 분 동안 인큐베이션. 각 샘플에 FACS 버퍼의 300 μl를 추가, 부드럽게 소용돌이 후 4 ° C에서 5 분 동안 314 XG에 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 대기음 참고 :. 바이오 경우형광 스트렙 타비 딘과 9 - tinylated 항체 3.8에 사용되는 3.8를 반복합니다.
9. 혼합 5 분 동안 314 XG에서 세포를 스핀 다운 FACS 버퍼의 또 다른 300 μl를 부드럽게 소용돌이와 세포를 씻으십시오. 뜨는을 대기음 0.1 포함 FACS 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁 - 생존 할 셀 라벨을 프로피 디움 아이오다 이드 또는 DAPI 1 ㎖ 당 0.2 μg의합니다. 셀은 유세포 분석 ^(22)에 대한 준비가되어 있습니다.
   결과를 참조하고, 인구의 자세한 내용은 그림 3과 세포를 어떻게 게이트했다 : 주.

결과

이 방법의 주요 단계를 요약하는 흐름도가도 1에 도시되어있다. 배양 여러 번 골수 배양의 밀도 및 형태가도 2에 도시되어있다. 제 1 일에, 세포가 작은 저밀도이지만 날 (3)이다 거기에 더 많은 세포는 몇 가지 큰하고 몇 준수하기 시작했다. 6 일 일정한 부착 성 및 비 - 부착 부분 (도 2A)가 존재한다. 배양은 7 일부터 수확 될 수있는 - 일...

토론

이 논문에서는 루츠 외. ^(6)로부터 구성되는 단일 마우스 골수 배양 물에서 GM-CSF 유도 된 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 이 문화의 미성숙 수지상 세포와 대 식세포을 구별 결합 MHCII 표현과 FL-HA 이전에 곤란 하였다 (그림 3C 참조). 이것은, 함께 Helft 등. ^(19)에 의해 다른 보고서로, 이전에는 수지상 것으로 생각되었다 GM-CSF 유도 BMDC...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometer	BD	LSR-II
Automated Inverted Microscope	Leica	DMI4000 B
Centrifuge	Thermo Fisher	ST-40R
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600
Syringe 1 ml	BD	309659
26 1/2 Gauge Needle	BD	305111
50 ml Conical Tube	Corning	357070	*Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Corning	MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes	Corning	352052
Dissection Tools	Fine Science Tools	*Various	*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep
Hemocytometer	Richert	1490
Sterile 100 x 15 mm Petri Dish	Corning	351029	*Falcon brand
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Ammonium Chloride	BDH	BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1600-1
Brefeldin A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	16000-044
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine	Sigma	G8540-100G
LPS Ultrapure	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermo Fisher	15140-122
Potassium Phosphate Monobasic	BDH	BDH0268-500G
Potassium Chloride	BDH	BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF	Peprotech	315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate	Sigma	H5388-1G	*Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.
Sodium Chloride	Fisher	5271-10
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	50876-1Kg
Sodium Pyruvate	Sigma	P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Fisher Bioreagents	BP152-5
Trypan Blue	Sigma	T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant	N/A	N/A	Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK	Abcam	BAF591	Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE	eBioscience	12-4317-87
Propidium Iodide	Sigma	P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-5MG