Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Riepilogo

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Abstract

I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l'identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l'osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati ​​che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.

Introduzione

Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF ^1,2. Per BMDCs, l'aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi ^(alta CD11c / MHCII ^alta e CD11c ^lo, B220 ⁺ rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura ^3,4. Al contrario, le cellule non aderenti generati dopo 7 a 10 giorni in coltura con solo GM-CSF ^5,6, GM-CSF e IL-4 ^7, o GM-CSF e FLT3 ligando ^8,9 generano BMDCs più da vicino assomiglia DC infiammatorie ^(alta CD11c, MHCII ^alta CD11b ^{+) 10.} Mentre queste colture in vitro sono utilizzati per generare macrofagi oDC, non è chiaro se ogni cultura dà luogo a popolazioni puri. Ad esempio, anche se le cellule aderenti nelle colture GM-CSF sono descritti come macrofagi ^5, le cellule non aderenti dalla stessa cultura vengono utilizzati come DCS ^6,11-13, con la presunzione che sono omogenei e ogni variabilità osservata è a causa di diversi stadi di sviluppo ^14,15. Inoltre, gli studi hanno trovato GM-CSF di essere un fattore di crescita essenziale per lo sviluppo dei macrofagi alveolari in vivo ^16,17, e può essere impiegato in vitro per generare macrofagi alveolari simile ^16,17,18.

Oltre aderenza, le procedure per la generazione di macrofagi e cellule dendritiche da GM-CSF trattata colture di midollo osseo sono molto simili suggerendo eterogeneità possono esistere all'interno di GM-CSF colture di midollo osseo. Questo sembra davvero essere il caso come due documenti segnalare la presenza di BMDMs nella frazione non aderente di culture BMDC. In un articolo, che identified una popolazione di cellule come CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^metà, MerTK ⁺ e CD115 ^+, che ha espresso una firma espressione genica che più assomigliava macrofagi alveolari e aveva una ridotta capacità di attivare le cellule T ^19. La seconda carta utilizzata MHCII e FL-HA per identificare una popolazione macrofago-come alveolare (CD11c ^+, MHCII ^{medio / basso,} FL-HA ^alto), che è stato distinto da immaturi (CD11c ^+, MHCII ^metà, FL-HA ^basso) e maturo DC (CD11c ^+, MHCII ^alto), sia fenotipicamente e funzionalmente ^18. Queste carte entrambe illustrano che le culture GM-CSF BMDC sono eterogenei, contenente sia macrofagi e le popolazioni DC che indicano che si deve prestare attenzione quando si interpretano i dati provenienti da culture BMDC.

Questo protocollo descrive come isolare il midollo osseo, cellule del midollo cultura ossee in GM-CSF, e identificare il alveolari macrofago-likepopolazione dalle DC immature e mature nella cultura midollo osseo di citometria a flusso utilizzando FL-HA vincolante e di espressione MHCII. Questa procedura è basata sulla procedura stabilita Lutz et al ⁶ ed è in grado di generare 5 -. 10 x 10 ⁶ cellule non aderenti il giorno 7 di una cultura 10 ml. La cultura è utilizzabile da 7 a 10 giorni e produce una popolazione eterogenea di macrofagi, cellule dendritiche immature e mature, così come alcuni progenitori al giorno 7. Questo fornisce un metodo semplice per crescere e isolare in vitro macrofagi alveolari simili in grandi quantità.

Protocollo

I topi sono stati sacrificati in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali per la ricerca animale etica da procedure approvate dalla University of Columbia Comitato Animal Care britannico.

1. L'acquisizione di una singola cella di midollo osseo Sospensione dal mouse femore e tibia

1. Accendere una cappa di sicurezza biologica (BSC) 15 minuti prima dell'inizio della procedura per eliminare l'aria mobile e consentire la stabilizzazione del flusso d'aria, quindi pulire / spruzzo superficie BSC con il 70% di etanolo. Tenere tutto sterile come possibile per la totalità del protocollo. Non tagliare le ossa in condizioni non sterili.
2. Preparare strumenti di dissezione da immersione in etanolo al 70% (1 paio di forbici dissezione, 2 paia di pinze), soluzione salina bilanciata di Hank con il 5% di siero fetale bovino (HBSS-FCS), piastre sterili (100 mm x 15 mm), 1 siringhe ml, 26½ aghi calibro, provette per la raccolta coniche (15 ml o 50 ml), e asciugamani di carta del BSC.
3. Euthanize il mouse usandoprotocolli approvati dal comitato etico di ricerca animale dell'istituzione. Portare in BSC, posto in cima ad uno o due asciugamani di carta e spruzzare il mouse con il 70% di etanolo.
4. Nel BSC, aprire una sterile Petri in modo asettico, un'aliquota di 10 ml di HBSS-FCS alla base e 1 - 2 ml al coperchio.
5. Posizionare il mouse sul suo stomaco con il dorso rivolto verso l'alto e sollevare la pelle intorno alle sezioni del torace con le dita della mano non dominante. Usare le forbici per fare un'incisione in cui viene sollevato la pelle.
6. Aggrappati a entrambe le estremità del taglio, una estremità con ogni mano e con attenzione separare la pelle intorno il mouse da dietro allo stomaco, continuare a tirare fino a due estremità dell'incisione incontrano alla stomaco.
7. Capovolgere il mouse per lo stomaco rivolto verso l'alto, e con una mano tirare la metà inferiore della pelle verso la gamba, continuare a tirare indietro la pelle fino a quando le gambe sono esposte.
8. Tenere il piede del mouse e tagliare i tendini di Achille sopra la caviglia ei legamenti che collegano i muscoli di fondo all'estremità inferiore della tibia con le forbici. Ciò allenta il piede dalle ossa delle gambe.
9. Tenendo la gamba dal piede, tagliare i muscoli e legamenti con le forbici tutto il ginocchio all'estremità inferiore del femore per tagliare i muscoli della coscia dal braccio inferiore. Utilizzare pinze per estrarre delicatamente i muscoli allentati dal perone e le superfici femorale. Fare attenzione a non recidere l'arteria femorale per evitare gravi emorragie.
10. Con una mano aggrappata al piede, premere forbici giù aperti all'estremità superiore del femore all'articolazione dell'anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente per separare il femore dall'articolazione dell'anca mentre usando le forbici per fare il taglio finale alla libera la gamba dal corpo.
11. Da questo punto in poi, contenere solo il tessuto con una pinza sterile. Tenere sulla gamba ad una estremità ed estrarre il piede sull'altro.
    NOTA: Questo non dovrebbe richiedere molta forza, come i legamenti di collegamento sono tagliati in fase di1.9. In alternativa, tagliare la tibia appena sopra la caviglia dove si fonde l'osso.
12. Tenere la gamba dalla estremità distale del femore con una serie di pinze e dell'estremità prossimale della tibia e fibula con un altro, piegare accuratamente la tibia e perone nella direzione opposta del ginocchio per separarli dal femore e rotula.
13. Utilizzare pinze per tirare giù i restanti legamenti e muscoli ancora attaccati alle ossa delle gambe inferiori. Qui, rimuovere il perone insieme con i tessuti connettivi con pinze in quanto è troppo piccolo per essere lavata per le cellule del midollo osseo. Posizionare la tibia pulita sul coperchio capovolto piastra di Petri.
14. Tenere l'estremità inferiore del femore con una serie di pinze e rotula con un altro, piegare la rotula e tessuti circostanti nella direzione opposta del giunto per la rimozione. Poi pulire restante tessuto connettivo dal femore; tirando via con una pinza, e posizionarlo sul coperchio capovolto piastra di Petri. Eliminare la rotula.
15. ripetere 1.7- 1.13 con l'altra gamba, se necessario. Trasferire le ossa a 1,6 ml provette da microcentrifuga contenente 1 ml sterile HBSS-FCS per il trasporto se necessario.
16. Posizionare ossa sul coperchio piatto Petri invertita, con 1 - 2 ml di HBSS-FCS, utilizzare pinze per pulire qualsiasi tessuto residuo ancora attaccato alla tibia e femore, quindi trasferire le ossa alla base della piastra Petri contenente 10 ml di HBSS- FCS. In alternativa, pulire le ossa e rimuovere il tessuto muscolare collegata con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo al 70%.
17. Tagliare ciascuna delle ossa a metà con le forbici. Parzialmente schermare la piastra di Petri con un coperchio sterile durante il taglio per garantire le ossa rimangono nel piatto. In alternativa, tagliare l'estremità di ogni osso per consentire lavaggio nel passaggio successivo.
18. Fissare il 26½ ago G alla siringa 1 ml, e redige 1 ml HBSS-FCS dalla piastra di Petri. Inserire la punta di un ago nella fine di un pezzo di osso e scovare le cellule del midollo osseo (tessuti molli rosso all'interno delle ossa). Inserire l'ago nella testadell'osso e l'estremità aperta, fino a quando tutto il midollo colore rosso viene rimosso. Osservare le ossa come di colore bianco.
19. Passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa alcune volte per formare una sospensione di cellule singole.
20. Eliminare le ossa arrossate. Utilizzare una pipetta 10 ml per mescolare la sospensione cellulare bene e trasferire al tubo di raccolta. Lavare la piastra di Petri una volta con 5 ml di HBSS-FCS per raccogliere le cellule residue nel piatto. Mettere le cellule in ghiaccio.
    NOTA: La sospensione di cellule del midollo osseo è ancora valida se immagazzinato per 2 - 3 ore a 4 ° C.

2. placcatura e la coltura di cellule del midollo osseo (BMC)

1. Preparare i seguenti reagenti e materiali di consumo.
   1. Preparare rosso tampone di lisi dei globuli (RBC) facendo cloruro di ammonio 0,84% in una soluzione finale di 2 mM Tris pH 7,2, poi sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micron.
   2. Preparare supporti BMC con l'aggiunta del 10% di FCS, 20 mM HEPES, aminoacido non essenziale 1x, 55 & #181, M 2-mercaptoetanolo, 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1 mM di sodio piruvato, e 2 mM L-glutammina a RPMI medio 1.640.
   3. Ottenere disponibile in commercio ricombinante GM-CSF o GM-CSF usare contenente surnatante da AG8.653 cellule di mieloma trasfettate con il gene GM-CSF ^20. Determinare la concentrazione di GM-CSF nel supernatante mediante ELISA e aggiungere l'equivalente di 20 ng / ml ai media BMC.
2. Centrifugare le cellule del midollo osseo a 314 xg per 5 min. Il pellet è di colore rosso, a causa di globuli rossi. Nel BSC, aspirare il surnatante con una pipetta di vetro sterile Pasteur collegato a vuoto di aspirazione, allentare il pellet toccando, quindi aggiungere 10 ml di tampone di lisi RBC. Vortex per risospendere le cellule e incubare in tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per 5 min.
3. Aggiungere 10 ml di HBSS-FCS poi girare cellule a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare il pellet cellulare come colore bianco. Risospendere le cellule in volume desiderato di supporto BMC.
4. Contare il Resu-cellule trascorsa utilizzando un emocitometro dopo colorazione cellule morte con il 0,4% trypan blu.
   NOTA: Se si usa il midollo osseo da una gamba (tibia singolo e femore), risospendere in 5 ml di mezzi BMC, prendere 10 ml di sospensione cellulare e diluire con 70 ml di 0,4% trypan blu, mescolare bene e trasferire 10 ml di la diluizione 1/8 cella alla camera emocitometro. Contare le cellule vitali in quattro quadranti: la media dei quattro quadranti conteggi x fattore di diluizione x 10 ⁴ = numero di cellule per ml. Un femore e tibia da una gamba generalmente produrrà circa 2 - 4 x 10 ⁷ cellule dopo RBC lisi.
5. Stima il numero di 10 ml piatti di colture di midollo osseo necessari per gli esperimenti a valle in base al numero di cellule totali necessari per esperimenti alla fine della cultura.
   NOTA: Ogni piatto richiede 2 x 10 ⁶ cellule del midollo osseo a seeding iniziale e rendimenti 5 - 10 x 10 ⁶ cellule a giorno 7.
   1. Aliquot il numero totale di cellule per la placcatura in una nuova provetta, centrifugare a 314 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule a 4 x 10 ⁶ cellule / ml in mezzi BMC.
6. Preparare una nuova sterile 100 millimetri x 15 mm piastra Petri con 9,5 ml di mezzi BMC contenente 200 ng di GM-CSF (ricombinante o da GM-CSF contenente surnatante). Aggiungere 500 ml di i / cellule del midollo osseo ml 4 x 10 ⁶ cellule al centro del piatto Petri per la concentrazione finale di 2 x 10 ⁵ cellule / ml in 10 ml.
   NOTA: E 'importante utilizzare un non piastra di Petri sterile un piatto di coltura di tessuti. Inoltre, quando si aggiungono le cellule, affinché le cellule rimangono concentrate al centro e minimizzare il disturbo ai piatti dopo la semina e durante le modifiche di supporto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO _2. Questo è il giorno 0 nella cultura.
7. Il giorno 3, aggiungere 10 ml di mezzi freschi BMC contenente 200 ng di GM-CSF per ogni piatto di cellule. Fare attenzione a minimizzare il disturbo of cellule concentrati in sospensione. Il volume totale di coltura cellulare è ora 20 ml.
8. Osservare le cellule sotto il microscopio ottico a ingrandimento 100X. Osservare numerose cellule non aderenti (rotonde) e un paio di cellule aderenti (piatti). Le cellule in gruppi di tre o quattro petali che ricordano di un fiore può essere visto, indicando la proliferazione.
9. Il giorno 6 eseguire un cambiamento mezzo dei media. Rimuovere con cautela 10 ml di media in un tubo da 50 ml conica sterile, spin down a 314 xg per 5 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di media BMC freschi contenenti 20 ng / ml di GM-CSF, delicatamente vortice e aggiungere al piatto originale coltura cellulare per un volume totale di 20 ml. Osservare le cellule sotto il microscopio.
    NOTA: Giorno 7 cultura dovrebbe essere al 70% o superiore in confluenza con cellule piatte aderenti e nuvole dense di cellule non aderenti rotonde.

3. Raccolta e preparazione BMDC e BMDMs per citometria a flusso

1. Mantenere tutti i buffer a 4 ° C.
2. Raccogliere le cellule dal giorno 7 al giorno 10. Per raccogliere le cellule, primo trasferimento 10 ml del surnatante cultura ad un tubo da 50 ml conica di raccolta, quindi inclinare il piatto in verticale di circa 30 gradi e lavare il piatto pipettando i restanti 10 ml della cultura dalla parte superiore del piatto. Ripetere questo lavaggio 5 volte, ogni volta ruotare la piastra di un terzo.
3. Trasferire i restanti 10 ml di cellule per lo stesso tubo di raccolta e scartare la piastra e cellule aderenti.
   NOTA: I lavaggi saranno rimuovere le cellule non aderenti e vagamente aderenti; le cellule aderenti piatte sono resistenti ai lavaggi. Tipicamente, tra 5 - 10 x 10 ⁶ cellule non aderenti sono attesi da una piastra al giorno 7 e 2 - 5 x 10 ⁶ cellule a giorno 10, anche se Lutz et al. segnalati 10 x 10 ⁶ cellule al giorno 10. Le cellule aderenti non vengono normalmente adottate. Tuttavia, se queste cellule devono essere confrontati con le cellule non aderenti, Possono essere rimossi come segue. Aggiungere 5 ml di 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 al piatto dopo che le cellule non aderenti sono rimossi, incubare a 37 ° C per 5 min, pipetta su e giù per rimuovere le cellule aderenti e raccogliere in un tubo separato.
4. Spin giù le cellule raccolte a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere in 5 ml sterile supporto BMC a 4 ° C, vortice delicatamente per mescolare, e contare utilizzando trypan blu e emocitometro.
   NOTA: Ogni piatto sarà resa 5 - 10 x 10 ⁶ cellule non aderenti da una cultura giorno 7. D'ora in poi, eseguire tutti i passaggi a 4 ° C.
5. Per l'analisi citofluorimetrica, trasferimento 2 x 10 ⁵ cellule per ciascun campione in 5 ml di polistirene provette con fondo arrotondato, aggiungere 300 ml di tampone FACS a 4 ° C (1x tampone fosfato, 2 mM EDTA e 2% di siero albumina bovina) a ciascun campione.
6. Spin le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare bianco, pellet opaca visibile alfondo della provetta.
7. Risospendere le cellule in 100 ml di non marcata recettore Fc Ab per bloccare il recettore Fc vincolante (Usa 1/10 surnatante da 2.4G2 producendo linea cellulare di mieloma) e incubare per 20 minuti a 4 ° C. Quindi aggiungere 300 ml di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante.
8. Risospendere le cellule in 100 ml di CD11c-PeCy7 a 0.2 mg / ml, Gr1-Pacific Blue a 0.25 mg / ml, MHCII-APC a 0,05 mg / ml, e FL-HA a circa 2 mg / ml per identificare i macrofagi e le cellule dendritiche.
   NOTA: FL-HA è stata preparata in casa con fluoresceina e gallo pettine sale sodico dell'acido ialuronico come descritto in precedenza ^21.
9. Incubare per 20 minuti a 4 ° C per consentire il legame alla superficie cellulare. Aggiungere 300 pl di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare celle in basso a 314 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. NOTA: Se bioGli anticorpi tinylated sono utilizzati in 3.8, ripetere 3,8-9 fluorescente-streptavidina.
10. Lavare le cellule con altri 300 ml di tampone FACS, delicatamente vortice di mescolare e centrifugare le cellule a 314 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone FACS contenente 0.1 - 0.2 mg per ml di ioduro di propidio o DAPI per etichettare le cellule non vitali. Le cellule sono ora pronti per l'analisi di citometria di flusso ^22.
    NOTA: vedere i risultati e la Figura 3 per i dettagli delle popolazioni e di come le cellule sono state gated.

Risultati

Un diagramma di flusso che sintetizza le fasi principali di questo metodo è illustrato in Figura 1. La densità e la morfologia della cultura midollo osseo in diversi momenti della coltura sono mostrati in Figura 2. Al giorno 1, le cellule sono piccole e sparse, ma al giorno 3, ci sono più celle, alcuni sono più grandi e alcuni hanno cominciato ad aderire. Di giorno 6 c'è un aderente definito e frazione non aderente (Figura 2A). ...

Discussione

In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati ​​da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. ^6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. ^19, dimostra l'eterogeneità all'interno di GM-CSF culture BMDC in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometer	BD	LSR-II
Automated Inverted Microscope	Leica	DMI4000 B
Centrifuge	Thermo Fisher	ST-40R
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600
Syringe 1 ml	BD	309659
26 1/2 Gauge Needle	BD	305111
50 ml Conical Tube	Corning	357070	*Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Corning	MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes	Corning	352052
Dissection Tools	Fine Science Tools	*Various	*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep
Hemocytometer	Richert	1490
Sterile 100 x 15 mm Petri Dish	Corning	351029	*Falcon brand
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Ammonium Chloride	BDH	BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1600-1
Brefeldin A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	16000-044
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine	Sigma	G8540-100G
LPS Ultrapure	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermo Fisher	15140-122
Potassium Phosphate Monobasic	BDH	BDH0268-500G
Potassium Chloride	BDH	BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF	Peprotech	315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate	Sigma	H5388-1G	*Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.
Sodium Chloride	Fisher	5271-10
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	50876-1Kg
Sodium Pyruvate	Sigma	P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Fisher Bioreagents	BP152-5
Trypan Blue	Sigma	T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant	N/A	N/A	Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK	Abcam	BAF591	Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE	eBioscience	12-4317-87
Propidium Iodide	Sigma	P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-5MG