דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Summary

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Abstract

המקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCS) הם תאים חיסוניים מולדים נמצא ברקמות ואיברים הלימפה כי לשחק תפקיד מפתח בהגנה מפני פתוגנים. עם זאת, הם קשים לבודד בכמות מספקת כדי ללמוד אותם בפירוט, ולכן, במבחנת מודלים פותחו. בתרבויות במבחנה של מקרופאגים עצם שמקורם במח ותאי דנדריטיים הם ומבוססים ושיטות בעל ערך עבור מחקרים אימונולוגית. כאן, שיטת culturing וזיהוי הוא DCS ו מקרופאגים מתרבה אחת של תאים במח עצם עכבר העיקרי באמצעות גורם מגרת מושבת מקרופאג גרנולוציט ציטוקינים (GM-CSF) מתוארת. פרוטוקול זה מבוסס על ההליך הוקם ראשון שפותח על ידי ואח 'לוץ. בשנת 1999 עבור DCs עצם שמקורם במח. התרבות היא הטרוגנית, הכוללת MHCII ו hyaluronan fluoresceinated (FL-HA) משמשים כדי להבחין מקרופאגים DCs בשלה ובוגרת. GM-CSF אלה מתקבלים מקרופאגים פרוvide מקור נוח של מקרופאגים נגזר במבחנה כי הדומים מקרופאגים מכתשיים בשני הפנוטיפ ותפקוד.

Introduction

כמה בשיטות תרבות במבחנה תוארו ליצור מקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ו DCs עצם שמקורם במח (BMDCs) באמצעות אחד או שילוב של גורמי גדילה. BMDMs יכול להיווצר על ידי culturing תאים במח העצם או באמצעות גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF) או GM-CSF ^1,2. לקבלת BMDCs, תוספת של ליגנד FLT3 לתרבות מח עצם מוליד DCs קלאסית plasmacytoid לא חסיד (CD11c ^גבוה / ^גבוהה CD11c MHCII ^lo, B220 ⁺ בהתאמה) לאחר 9 ימים בתרבות ^3,4. לעומת זאת, תאים שאינם חסידים שנוצרו לאחר 7 עד 10 ימים בתרבות עם GM-CSF לבד ^5,6, GM-CSF ו- IL-4 ^7, או GM-CSF ו FLT3 ליגנד ^8,9 ליצור BMDCs יותר מקרוב דומת DCs הדלקתית ^(גבוה CD11c, MHCII ^גבוהה CD11b ^{+) 10.} בעוד תרבויות חוץ גופית אלה משמשים ליצירת מקרופאגים אוDCS, לא ברור אם כל תרבות מולידה אוכלוסיות טהורות. לדוגמא, אם כי תאים חסידים בתרבויות-CSF GM מתוארים להיות מקרופאגים ^5, התאים לא חסידים מאותה התרבות משמשים DCs ^6,11-13, עם ההנחה כי הם הומוגנית וכל השתנות שנצפתה היא עקב שלבי ההתפתחות השונים ^14,15. יתר על כן, מחקרים מצאו GM-CSF כדי להוות גורם צמיחה חיוני להתפתחות מקרופאג המכתשית in vivo ^16,17, וניתן להשתמש במבחנה כדי לייצר מקרופאגים מכתשיים דמוי ^16,17,18.

מלבד דבקות, הנהלים להפקה מאקרופאגים DCs ממח עצם מטופלים-CSF GM תרבויות דומים מאוד המצביע על ההטרוגניות יכול להתקיים בתוך תרבויות מח עצם GM-CSF. זה אכן נראה את המקרה כפי שני מסמכים לדווח על נוכחות של BMDMs בשבריר לא חסיד של תרבויות BMDC. במאמר אחד, הם identified אוכלוסייה של תאים כמו CD11c ^+, CD11b ^{+, באמצע} MHCII, MerTK ^+, ו CD115 ^+, אשר הביע חתימה ביטוי גנים שדמה יותר מכול מקרופאגים מכתשיים והיה לו יכולת מופחתת להפעיל תאי T ^19. המאמר השני בשימוש MHCII ו FL-HA לזהות אוכלוסייה המכתשית מקרופאג דמוי ⁽⁺ CD11c, MHCII ^{אמצע / נמוך,} FL-HA ^גבוהה) כי היה נבדל לא מפותחים ⁽⁺ CD11c, MHCII ^באמצע, FL-HA ^נמוך) ובוגרת DCS (CD11c ^+, MHCII ^גבוהה), הן phenotypically והן מבחינה תפקודית ^18. שני העיתונים הללו ממחישים כי GM-CSF תרבויות BMDC הן הטרוגניים, המכילים את שני מקרופאג ואוכלוסיות DC המציין טיפול שיש לנקוט כאשר לפרש נתונים מתרבויות BMDC.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד מח עצם, תאי מח עצם התרבות GM-CSF, ולזהות את מכתשי מקרופאג דמויהאוכלוסייה מן DCs בשלה ובוגרת בתרבות מח העצם על ידי cytometry זרימה באמצעות FL-HA מחייב וביטוי MHCII. הליך זה מבוסס על הליך הוקמה של לוץ ואח ⁶ והוא מסוגל לייצר 5 -. 10 x 10 ⁶ תאים לא חסיד ביום 7 של תרבות 10 מ"ל. התרבות היא שמיש מימים 7 עד 10 ומניבת אוכלוסייה הטרוגנית של מקרופאגים, DCS בשלה ובוגרת, כמו גם אבות חלקים ביום 7. זה מספק שיטה פשוטה לגדול ולבודד במבחנה המכתשית דמוי מקרופאגים בכמויות גדולות.

Protocol

עכברים היו מורדמים בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים למחקר בעלי חיים אתיים על ידי נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים קולומביה הבריטית.

1. רכישת השעית מח עצם תא בודד עכבר עצם הירך לבין השוקה

1. הפעל ארון בטיחות ביולוגית (BSC) 15 דקות לפני תחילת ההליך לטהר אוויר ארון ולאפשר ייצוב זרימת אוויר, אז משטח BSC נקיים / הספרים עם אתנול 70%. הקפד שהטקסט יהיה סטרילי ככל האפשר עבור מכלול של הפרוטוקול. אין לחתוך את העצמות בתנאים לא סטריליים.
2. הכינו כלי לנתיחה על ידי השריית באתנול 70% (1 זוג מספריים לנתיחה, 2 זוגות מלקחיים), תמיסת מלח מאוזן של האנק עם 5% נסיוב עגל עוברית (HBSS-FCS), צלחות פטרי סטרילי (100 מ"מ x 15 מ"מ), 1 מזרקים מ"ל, 26½ מחטים מד, צינורות אוסף חרוטי (15 מ"ל או 50 מ"ל), ומגבות נייר של BSC.
3. להרדים את העכבר באמצעותפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה במחקר בבעלי החיים של המוסד. תביא לתוך BSC, למקם על גבי מגבות נייר אחד או שתיים ולרסס את העכבר עם אתנול 70%.
4. ב BSC, לפתוח בסביבה נקייה מחיידקים צלחת סטרילי פטרי, aliquot 10 מ"ל של HBSS-FCS לבסיס 1 - 2 מ"ל אל המכסה.
5. מניחים את העכבר על הבטן שלה עם הגב כלפי מעלה להרים את העור סביב הסעיפים החזה עם האצבעות של היד הלא דומיננטית. השתמש במספריים לעשות חתך שבו העור יוסר.
6. יחזיק בשני הקצוות של החתך, קצה אחד עם כל יד ובזהירות לפרק את העור סביב העכבר מהגב אל הבטן, להמשיך למשוך אותו עד שני קצוות נפגשים החתך ב בבטן.
7. הפוך את העכבר על בטן פונה כלפי מעלה, ועם יד אחת למשוך את החצי התחתון של העור כלפי מטה לכיוון הרגל, לשמור שהפיל את העור עד שהרגליים נחשפות.
8. החזיקו את כף הרגל של העכבר למעלה וחתך את גידי אכילס מעל מפרק הקרסולרצועות חיבור שרירי רגל בקצה התחתון של עצם השוק עם מספריים. זה מרפה את הרגל מעצמות הרגל.
9. בעוד מחזיק את הרגל על ​​ידי כף הרגל, לחתוך את השרירים והרצועות במספריים בכל רחבי מפרק הברך בקצה התחתון של עצם הירך לנתק את שרירי הירך מן הרגל התחתונה. שימוש במלקחיים כדי למשוך התירו שרירים בעדינות הרחק שׁוֹקִיתִי ומשטחי ירך. יש להיזהר שלא לנתק את עורק הירך כדי למנוע דימום כבד.
10. ביד אחת נאחזה ברגל, לחץ כלפי מטה מספריים פתוחים בקצה העליון של עצם הירך במפרק הירך, לסובב את הרגל ומשוכים בעדינות כדי להפריד את הירך מן מפרק הירך תוך שימוש במספריים עוברים את הסינון הסופי חינם הרגל מהגוף.
11. מנקודה זו ואילך, רק להחזיק את הרקמה עם מלקחיים סטרילית. תחזיק את הרגל בקצה אחד לשלוף את הרגל על ​​אחרים.
    הערה: זה לא צריך לדרוש כוח רב, כפי רצועות חיבור נחתכות בשלב1.9. לחלופין, לחתוך את השוקה בדיוק מעל הקרסול שם העצם הוא התמזג.
12. החזק את הרגל עד סוף דיסטלי של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחי סוף הפרוקסימלי של הטיביה שוקית עם אחר, בזהירות לכופף, ועצמות השוק בכיוון ההפוך של מפרק הברך על מנת להפריד אותם מן הירך פיקת הברך.
13. שימוש במלקחיים כדי לנתץ את הרצועות והשרירים הנותרים עדיין מחוברת עצמות הרגל התחתונה. הנה, להסיר את השוקית יחד עם רקמות החיבור עם מלקחיים כפי שהוא קטן מדי כדי להיות סמוק עבור תאים במח עצם. מניח את השוקה ניקתה על מכסת צלחת פטרי ההפוכה.
14. החזק את הקצה התחתון של עצם הירך עם קבוצה אחת של מלקחיים פיקת הברך עם אחר, לכופף את פיקת הברך ואת הרקמות הסובבות בכיוון ההפוך של המפרק להסרה. לאחר מכן לנקות את הנותרים רקמות החיבור של הירך; משייך אותם עם מלקחיים, ומניח אותו על מכסת צלחת פטרי ההפוכה. מחק את פיקת הברך.
15. חזור על 1.7- 1.13 עם הרגל השנייה במידת הצורך. מעבירים את העצמות עד 1.6 מ"ל צינורות microcentrifuge המכילה 1 מ"ל HBSS-FCS סטרילי לתחבורה במידת הצורך.
16. מניחים את העצמות על מכסה צלחת הפוכה פטרי, עם 1 - 2 מ"ל של HBSS-FCS, להשתמש במלקחיים כדי לנקות רקמות שיורית עדיין מחוברת הטיביה הירך, ולאחר מכן להעביר את עצמות לבסיס של צלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של HBSS- FCS. לחלופין, לנקות את העצמות ולהסיר המצורפת רקמות שרירות באמצעות נייר רטוב אתנול 70%.
17. חותכים כל העצמות בחצי במספריים. חלקית להגן על צלחת פטרי עם מכסה סטרילי תוך צמצום כדי להבטיח את העצמות להישאר בצלחת. לחלופין, לחתוך את הקצה של כל עצם לאפשר שטיפה בשלב הבא.
18. צרף 26½ המחט G אל מזרק 1 מ"ל, ותנסחו 1 מ"ל HBSS-FCS מצלחת פטרי. הכנס את קצה המחט לתוך סוף פיסת עצם לשטוף את תאי מח עצם (רקמה אדומה רכה בתוך העצמות). הכנס את המחט לתוך הראששל העצם ואת הקצה הפתוח, עד שכל המח בצבע האדום מוסר. שים את העצמות כמו בצבע לבן.
19. להעביר כל גושים גלויים של מח עצם באמצעות המזרק כמה פעמים כדי ליצור השעית תא בודדת.
20. מחק את העצמות הסמוקות. השתמש פיפטה 10 מ"ל לערבב את ההשעיה תא היטב ולהעביר אל צינור איסוף. יש לשטוף את צלחת פטרי פעם אחת עם 5 מ"ל של HBSS-FCS לאיסוף תאים שיורית בצלחת. מניחים את התאים על הקרח.
    הערה: מח עצם השעית התא עדיין קיימא אם מאוחסן במשך 2 - 3 שעות ב 4 ° C.

ציפוי 2. Culturing של תאים במח העצם (BMCs)

1. כן ריאגנטים והאספקה ​​הבאים.
   1. כן תאי דם אדום (RBC) חיץ תמוגה על ידי ביצוע אמוניום כלוריד 0.84% ​​בתמיסה סופית של 2 מ"מ טריס pH 7.2, ואז לעקר ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרון.
   2. כן תקשורת BMC על ידי הוספת 10% FCS, 20 HEPES מ"מ, חומצת אמינו חיוניות 1x, 55 & #181; M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 1 מ"מ פירובט נתרן, ו -2 מ"מ L- גלוטמין עד בינוני RPMI 1640.
   3. השג זמין מסחרי רקומביננטי GM-CSF או להשתמש GM-CSF המכיל supernatant מן AG8.653 תאי מיאלומה טרנספקציה עם גן GM-CSF ^20. קבע את הריכוז של GM-CSF ב supernatant ידי ELISA ומוסיפים את המקבילה של 20 ng / ml לתקשורת BMC.
2. ספין למטה התאים במח העצם 314 XG במשך 5 דקות. הגלולה היא אדומה, בשל RBCs. ב BSC, לשאוב supernatant באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית מצורף ואקום יניקה, לשחרר את הכדור על ידי הקשה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של חיץ תמוגה RBC. וורטקס כדי resuspend את התאים דגירה במאגר תמוגה RBC בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
3. הוסף 10 מ"ל של HBSS-FCS ואז ספין התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים את התא גלולה כמו צבע לבן. Resuspend תאים בנפח הרצוי של התקשורת BMC.
4. ספירת resuspended-תאים באמצעות hemocytometer לאחר מכתים תאים מתים עם trypan כחול 0.4%.
   הערה: אם מח עצם מאחד הרגל (יחיד הטיביה הירך) משמש, resuspend ב 5 מ"ל של התקשורת BMC, לקחת 10 μl של השעיה התא לדלל אותו עם 70 μl של 0.4% trypan כחול, ומערבבים היטב ולהעביר 10 μl של דילול תא 1/8 לתא hemocytometer. ספירת תאי קיימא ארבעה רביעים: הממוצע של ארבע הספירה ברבע x גורם לדילול x 10 ⁴ = מספר תאים לכל מיליליטר. עצם הירך לבין השוקה מרגל אחת תניב בדרך כלל כ 2 - 4 x 10 ⁷ תאים לאחר תמוגה RBC.
5. להעריך את המספר 10 מ"ל מנות של תרבויות מח עצם דרושי ניסויים המשך המבוססים על מספר התאים הכוללים דרוש לניסויים בסוף התרבות.
   הערה: כל מנה דורשת 2 x 10 ⁶ תאים במח עצם על זריעה ראשונית ותשואות 5 - 10 x 10 ⁶ תאים ביום 7.
   1. עליquot את המספר הכולל של תאים עבור ציפוי לתוך צינור חדש, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend התאים ב 4 x 10 מ"ל ⁶ תאים / מדיה BMC.
6. הכינו צלחת 100 מ"מ x 15 מ"מ פטרי סטרילית חדשה עם 9.5 מ"ל של התקשורת BMC המכיל 200 ng של GM-CSF (רקומביננטי או מ- GM-CSF המכיל supernatant). הוסף 500 μl של 4 x 10 ⁶ תאים / תאים במח העצם מ"ל למרכז של צלחת פטרי עבור ריכוז סופי של 2 x 10 מ"ל ⁵ תאים / 10 מ"ל.
   הערה: חשוב להשתמש בצלחת פטרי סטרילית לא צלחת בתרבית רקמה. כמו כן, בעת הוספת התאים, להבטיח תאים נשארים מתרכזות במרכז ולמזער הפרעה את הכלים אחרי הזריעה ובמהלך שינויי תקשורת. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. זהו יום 0 בתרבות.
7. ביום 3, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הטריה BMC המכילה 200 ng של GM-CSF על כל מנה של תאי. תשמור על עצמך כדי למזער הפרעת of התאים המרוכזים השעיה. הנפח הכולל של תרבית תאים הוא כעת 20 מ"ל.
8. שימו לב התאים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 100X. שים לב רבים שאינם חסידים תאים (עגולה) וכמה תאים חסידים (שטוחים). תאים בקבוצות של שלושה או ארבעה עלי כותרת הדומה של פרח ניתן לראות, המציין שגשוג.
9. ביום 6 לבצע שינוי תקשורת וחצי. מוציאים בזהירות 10 מ"ל של מדיה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי, ספין למטה ב 314 XG במשך 5 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
10. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של התקשורת טריים BMC המכיל 20 ng / ml של GM-CSF, מערבולת בעדינות ומוסיפים לתבשיל תרבית תאים המקורי בנפח כולל של 20 מ"ל. שימו לב התאים תחת המיקרוסקופ.
    הערה: תרבות יום 7 צריכה להיות ב 70% או יותר confluency עם תאים שטוחים חסיד ועננים צפופים של תאים עגולים לא חסידים.

3. איסוף הכנת BMDC ו BMDMs עבור cytometry זרימה

1. שמור את כל המאגרים ב 4 מעלות צלזיוס.
2. קציר תאים מהיום 7 עד היום 10. כדי לקצור את התאים, ההעברה ראשונה 10 מיליליטר של supernatant תרבות צינור איסוף 50 מיליליטר חרוטים, ואז להטות את המנה אנכית בכ -30 מעלות לשטוף את המנה על ידי pipetting 10 מ"ל הנותרים תרבות מהחלק העליון של המנה. חזור על זה לשטוף 5 פעמים, בכל פעם סיבוב הצלחת על ידי שליש.
3. מעביר את 10 מ"ל שאריות תאים לאותו צינור האיסוף וזורק את הצלחת תאים חסידים.
   הערה: השטיפות תסרנה תאים שאינם חסידים חסיד רופף; את התאים החסידים השטוחים עמידים הכביסות. בדרך כלל, בין 5 - 10 x 10 ⁶ תאים לא חסידים צפויים מצלחת אחד בכל יום 7 ו 2 - 5 x 10 ⁶ תאים ביום 10, אם כי לוץ et al. דיווח 10 x 10 ⁶ תאים ביום 10. התאים החסידים לא נלקחים בדרך כלל. עם זאת, אם תאים אלה צריכים להיות לעומת התאים שאינם החסידים, ניתן להסיר הם כדלקמן. הוסף 5 מ"ל של 0.7 mM EDTA ב 1x PBS, pH 7.4 כדי בצלחת לאחר שהתאים לא חסיד יוסרו, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר את התאים חסיד ולאסוף בצינור נפרד.
4. ספין למטה התאים שנאספו 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. Resuspend ב 5 מ"ל מדיה סטרילי BMC ב 4 ° C, מערבולת בעדינות לתערובת, לספור באמצעות כחול hemocytometer trypan.
   הערה: כל מנה תניב 5 - 10 x 10 ⁶ לא חסידי תאים מתרבים יום 7. מעתה ואילך, לבצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס.
5. עבור ניתוח תזרים cytometric, העברה 2 x 10 ⁵ תאים עבור כל דגימה לתוך 5 מיליליטר צינורות קלקר עגול תחתונים, להוסיף 300 μl של חיץ FACS על 4 מעלות צלזיוס (שנאגר פוספט 1x המלוח, 2 EDTA מ"מ ו 2% אלבומין בסרום שור) לכל לִטעוֹם.
6. ספין תאים למטה 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant. שים לב גלולה לבנה, אטום גלויה בביתהחלק התחתון של הצינור.
7. תאים Resuspend ב 100 μl של Ab קולטן Fc ללא תווית לחסום קולטני Fc מחייב (supernatant השתמש 1/10 מ 2.4G2 לייצר קו תא מיאלומה) דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן להוסיף 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ו לשאוב supernatant.
8. תאים Resuspend ב 100 μl של CD11c-PeCy7 על 0.2 מיקרוגרם / מ"ל, כחול Gr1 פסיפיק ברמה של 0.25 מיקרוגרם / מ"ל, MHCII-APC ב 0.05 מיקרוגרם / מ"ל, ו FL-HA בכ 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​לזהות מקרופאגים DCs.
   הערה: FL-HA הוכן בבית באמצעות והעמסה ומלח נתרן חומצה היאלורונית תרנגול מסרק כפי שתוארה לעיל ^21.
9. דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי לאפשר מחייב את פני התא. הוספת 300 μl של חיץ FACS לטעום כל, מערבולת בעדינות, ואז ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant הערה:. אם ביונוגדנים tinylated משמשים 3.8, לחזור 3.8 - 9 עם-streptavidin ניאון.
10. שטפו תאים עם עוד 300 μl של חיץ FACS, מערבולת בעדינות לתערובת ספין למטה התאים ב 314 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התאים 200 μl של חיץ FACS המכיל 0.1 - 0.2 מיקרוגרם לכל מ"ל של יודיד propidium או DAPI לתייג תאים nonviable. תאים מוכנים כעת תזרים cytometric ניתוח ^22.
    הערה: ראה תוצאות ואיור 3 לפרטים של האוכלוסיות וכיצד התאים היו מגודרים.

תוצאות

תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים של שיטה זו מוצגת באיור 1. הצפיפות והמורפולוגיה של תרבות מח עצם בזמנים שונים של התרבות מוצגות באיור 2. באותו יום 1, התאים הם קטנים ודלילים אבל ביום 3, יש יותר תאים, וחלקם גדולים יותר ועוד כמה החלו לד?...

Discussion

בכתב היד הזה, אנו מספקים שיטה להפקת מקרופאגים GM-CSF נגזר DCs מתרבה מח עצם עכבר אחת כי הוא עיבוד לוץ et al. ^6. ביטוי MHCII ו FL-HA מחייב מבחינה בין DCs בשלה מקרופאגים בתרבות זו (ראו איור 3 ג), אשר בעבר כבר קשה. זה, יחד עם דו"ח נוסף על ידי Helft et al. ^19, הדגים הט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometer	BD	LSR-II
Automated Inverted Microscope	Leica	DMI4000 B
Centrifuge	Thermo Fisher	ST-40R
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600
Syringe 1 ml	BD	309659
26 1/2 Gauge Needle	BD	305111
50 ml Conical Tube	Corning	357070	*Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Corning	MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes	Corning	352052
Dissection Tools	Fine Science Tools	*Various	*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep
Hemocytometer	Richert	1490
Sterile 100 x 15 mm Petri Dish	Corning	351029	*Falcon brand
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Ammonium Chloride	BDH	BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1600-1
Brefeldin A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	16000-044
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine	Sigma	G8540-100G
LPS Ultrapure	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermo Fisher	15140-122
Potassium Phosphate Monobasic	BDH	BDH0268-500G
Potassium Chloride	BDH	BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF	Peprotech	315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate	Sigma	H5388-1G	*Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.
Sodium Chloride	Fisher	5271-10
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	50876-1Kg
Sodium Pyruvate	Sigma	P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Fisher Bioreagents	BP152-5
Trypan Blue	Sigma	T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant	N/A	N/A	Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK	Abcam	BAF591	Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE	eBioscience	12-4317-87
Propidium Iodide	Sigma	P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-5MG