VacuSIP، وتحسين أسلوب INEX ل<em&gt; في الموقع</em&gt; قياس الجسيمات والمذاب المركبات التي تتم معالجتها بواسطة مغذيات تعليق النشطة

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

مغذيات تعليق القاعية تلعب أدوارا أساسية في أداء النظم الإيكولوجية البحرية ^1. من خلال تصفية كميات كبيرة من المياه ^2،3، وإزالة وتفرز الجسيمات (العوالق والمخلفات) والمركبات الذائبة ¹ (والمراجع فيها) والتي تشكل عاملا مهما من بين القاعية البحرية اقتران ^4،5 والمغذيات الدراجات ^6،7. قياس بدقة الجسيمات وحلت المركبات إزالتها والتي تفرز مغذيات تعليق القاعية (مثل الإسفنج، المزقييات، الأشواك، وذوات الصدفتين) هو أمر أساسي لفهم علم وظائف الأعضاء، والتمثيل الغذائي، والبيئة التغذية الخاصة بهم. جنبا إلى جنب مع ضخ قياسات معدل، فإنه يمكن أيضا تقدير حجم تدفقات المواد الغذائية بوساطة هذه الكائنات والتأثير البيئي على نوعية المياه فضلا عن العمليات على نطاق والنظام البيئي.

اختيار الطريقة المناسبة لقياس إزالة والإنتاج معدلات الجسيمات وكوم المنحلجنيه فلتر مغذيات تعليق أمر حاسم للحصول على بيانات موثوق بها بشأن نشاط التغذية من ^8. كما أشار Riisgård وغيرها، غير لائقة النتائج منهجيات التحيز وتشويه ظروف تجريبية، إنتاج تقديرات غير صحيحة من الابتلاع وإفراز مواد معينة، ويمكن أن يؤدي إلى تقدير خاطئ لتدفقات المواد الغذائية المصنعة من قبل هذه الكائنات.

طريقتين المستخدمة في معظم الأحيان لقياس جسيمات وتدفقات المغذيات الذائبة في مغذيات الترشيح تنطوي إما حضانة (تقنيات غير المباشرة) أو جمع في وقت واحد من المحيط والمياه الزفير (تقنيات المباشرة). وتعتمد تقنيات الحضانة على قياس معدل التغير في تركيز الجسيمات والمواد الغذائية الذائبة في الماء المحتضنة، وتقدير معدلات الإنتاج أو إزالة مقارنة مع الضوابط الكافية ^8. ومع ذلك، أرفق كائن حي في غرفة الحضانة يمكن أن يغير feedin لهاز وضخ السلوك نتيجة للتغيرات في النظام التدفق الطبيعي، وذلك بسبب انخفاض الأكسجين و / أو في تركيز المواد الغذائية، أو بسبب تراكم مركبات افرازه في ^7،9 المياه الحضانة (والمراجع فيها). بالإضافة إلى آثار الولادة وإمدادات المياه المعدلة، وجود تحيز كبير من التقنيات حضانة ينبع من آثار إعادة الترشيح (انظر على سبيل المثال ^10). على الرغم من أن بعض هذه المشاكل المنهجية التي تم التغلب عليها باستخدام حجم المناسب وشكل سفينة الحضانة ¹¹ أو مع إدخال نظام جرس جرة إعادة تدوير في الموقع ^12، هذا الأسلوب غالبا ما يقلل إزالة والإنتاج أسعار الفائدة. قياس استقلاب المركبات الذائبة مثل النيتروجين المذاب العضوية (DON) والكربون (DOC) أو المواد الغذائية غير العضوية، وقد ثبت أن تكون عرضة بشكل خاص لالتحيزات الناجمة عن تقنيات الحضانة ^13.

في أواخر 60s و 70s في وقت مبكر، هنري Reiswig^9،14،15 رائدا في تطبيق تقنيات المباشرة لتحديد إزالة الجسيمات من الإسفنج العملاقة في منطقة البحر الكاريبي، عن طريق أخذ عينات بشكل منفصل الماء استنشاق والزفير من قبل الكائنات الحية في الموقع. نظرا لصعوبة تطبيق تقنية Reiswig على مغذيات تعليق أصغر وفي ظروف تحت الماء أكثر تحديا، واقتصر الجزء الأكبر من البحوث في هذا المجال إلى المختبر (في المختبر) استخدام تقنيات حضانة غير المباشرة في الغالب ^16. أصلحت ياهيل وزملاؤه مباشرة في Reiswig في تقنية الموقع على العمل في ظروف نطاق أصغر. طريقتهم، وصف INEX ^16، يقوم على أخذ العينات تحت الماء في وقت واحد من الماء استنشاقه (في) والزفير (خروج) من قبل الكائنات الحية دون عائق. وتراكيز مختلفة من مادة (على سبيل المثال، والبكتيريا) بين زوج من عينات (INEX) يوفر قدرا من الاحتفاظ (أو الإنتاج) من هذه المادة من قبل الحيوان. تقنية INEX توظف أنابيب مفتوحة وتعتمد على طائرة إفراغي التي تنتجها النشاط ضخ الكائن درس ليحل محل سلبي على المياه المحيطة في أنبوب جمع. في حين ياهيل وزملاؤه طبقت بنجاح هذه التقنية في دراسة شملت أكثر من 15 تعليق مختلف مغذيات الأصناف (على سبيل المثال، ^17)، يتم تقييد طريقة من مستوى عال من الممارسة والخبرة اللازمة، حسب حجم ضئيلة من بعض فتحات إفراغي، و حالة البحر.

للتغلب على هذه العقبات، قمنا بتطوير تقنية بديلة تقوم على شفط رقابة من الماء عينات من خلال أنابيب دقيقة (القطر الخارجي <1.6 مم). وكان لدينا هدف إلى إنشاء جهاز بسيط وموثوق بها، وغير مكلفة من شأنها أن تسمح نظيفة وتسيطر عليها في عينات المياه خارج الوضع من وجهة نظر محددة جدا، مثل فتحة إفراغي من مغذيات تعليق القاعية. أن تكون فعالة، وطريقة يجب أن يكون غير تدخلية حتى لا تؤثر على نظام تدفق المحيطة أو تعديل بehavior من الكائنات التي شملتها الدراسة. ويطلق على الجهاز المعروضة هنا VacuSIP. هو تبسيط نظام SIP التي وضعتها ياهيل وآخرون. (2007) ¹⁸ لأخذ العينات نقطة أساس ROV في أعماق البحار. وVacuSIP هو أرخص بكثير من SIP الأصلي وتم تكييفه للعمل على أساس الغوص. وقد صمم هذا النظام وفقا للمبادئ التي قدمت واختبارها من قبل رايت وستيفنز (1978) ¹⁹ وMøhlenberg وRiisgård (1978) ⁽²⁰⁾ لبيئة معملية.

وعلى الرغم من تصميم نظام VacuSIP لفي دراسات الموقع من عملية التمثيل الغذائي للمغذيات تعليق القاعية، ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسات مخبرية وحيثما هو مطلوب، عينة المياه نقطة مصدر التحكم ونظيفة. هذا النظام هو مفيد خصوصا عندما يطلب من التكامل على فترات طويلة (مين ساعة) أو في الفلترة الموقع. وقد استخدم VacuSIP بنجاح في المختبر ياهيل منذ عام 2011، ولديه أيضااستخدمت في اثنين من الدراسات التي أجريت مؤخرا من تدفقات المواد الغذائية بوساطة أنواع الإسفنج البحر الكاريبي والبحر الأبيض المتوسط ^​​21 (مورجانتي آخرون المقدمة).

استخدام عينات محددة، ومدة أخذ العينات لفترات طويلة، والظروف الميدانية، التي يتم تطبيقها VacuSIP، يستلزم بعض الانحرافات من بروتوكولات المحيطات القياسية لجمع وتصفية وتخزين العينات لمدة التحاليل الحساسة. للحد من مخاطر التلوث من قبل النظام VacuSIP أو احتمال تعديل المياه عينات من النشاط البكتيري بعد جمع، نحن اختبار مختلفة في إجراءات الترشيح وتخزين الموقع. تم فحص الأجهزة المختلفة الترشيح، والسفن جمع، وإجراءات تخزين من أجل تحقيق هذه التقنية الأكثر مناسبة لتحليل حل غير العضوية (PO ₄ ^3-، أكاسيد _{النيتروجين} ^- NH ₄ ^+، شافي ₄₎ والعضوية (DOC + DON) مركبات، وفائقة العوالق (<1081؛ م) والجسيمات العضوية (POC + PON) أخذ العينات. لمزيد من خفض خطر التلوث، خاصة في ظل الظروف الميدانية، تم تخفيض عدد من الخطوات التعامل إلى الحد الأدنى. يتم توجيه شكل البصرية التي يتم عرضها في طريقة لتسهيل التكاثر ويقلل من الوقت اللازم لتطبيق كفاءة هذه التقنية.

نبذة عن النظام

لأخذ عينات من الماء في الموقع التي يتم ضخها من مغذيات تعليق مع فتحات زافر صغيرة مثل 2 مم، هو تصور النشاط ضخ كل عينة لأول مرة عن طريق الإفراج عن تصفيتها فلوريسئين مصبوغ مياه البحر بالقرب من فتحة المستنشق (ق) ومراقبة التدفق من إفراغي الفتحة ¹⁶ (انظر أيضا الشكل 2B في ^18). الماء استنشاق والزفير من قبل عينة الدراسة (incurrent وإفراغي) ثم يتم أخذ عينات في وقت واحد باستخدام زوج من أنابيب دقيقة مثبتة على مناور مبنية خصيصا أو على اثنين من "عالسيدة "لترايبود المحمولة مرنة رأسا على عقب (الشكل 1 والتكميلية فيديو 1). ويتم جمع المياه استنشاقه من قبل كائن الدراسة عن طريق وضع بعناية نهاية القريبة من أنبوب واحد داخل أو بالقرب من فتحة المستنشق للكائن الحي الدراسة. متطابقة ثم يتم وضع أنبوب داخل فتحة إفراغي. وتتطلب هذه العملية رعاية جيدة لتجنب الاتصال أو اضطراب الحيوان، على سبيل المثال، من خلال إعادة تعليق الرواسب. للبدء في أخذ العينات، غطاس يخترق الحاجز في وعاء جمع بإبرة حقنة تعلق على النهاية البعيدة من كل أنبوب، والسماح للضغط المياه الخارجية لإجبار المياه عينات في الإناء من خلال أنبوب أخذ العينات. وتبدأ شفط من فراغ إنشاؤها مسبقا في قارورة واختلاف الضغط بين الماء الخارجي وعاء العينة إجلاء .

لضمان جمع نظيفة من المياه الزفير وتجنب شفط عرضي AMBIوالأنف والحنجرة المياه ^16، يحتاج معدل أخذ العينات الماء إلى أن يبقى على معدل أقل بكثير (<10٪) من معدل تدفق إفراغي. يتم التحكم في معدل الامتصاص من طول الأنبوب وقطره الداخلي (ID). كما يضمن القطر الداخلي صغير حجم القتلى لا يكاد يذكر (<200 ميكرولتر لكل متر من الأنابيب). أخذ العينات على فترات طويلة (دقائق إلى ساعات) يجعل من الممكن دمج patchiness المتأصل في معظم المواد المثيرة للاهتمام. للتأكد من أن العينات يتم الاحتفاظ بشكل كاف في جلسات أخذ العينات تحت الماء لفترات طويلة فضلا عن النقل إلى المختبر، وهو في الترشيح الموقع يستحب للالتحاليل الحساسة. وأملت اختيار السفن أخذ العينات، والتجمع، والترشيح، وأنابيب من الكائنات دراسة ومسألة بحثية محددة. البروتوكول هو موضح أدناه يفترض أن ملف تعريف التمثيل الغذائي الكامل هو من مصلحة (لمحة عامة انظر الشكل 2). ومع ذلك، فإن طبيعة وحدات من هذا البروتوكول يسمح وأو تعديل من السهل استيعاب مخططات أخذ العينات أبسط أو حتى مختلفة جدا. لمحة التمثيل الغذائي الكامل، ينبغي أن يتضمن بروتوكول أخذ العينات الخطوات التالية: (1) التصور التدفق. (2) التغذية أخذ العينات فائقة العوالق (العوالق <10 ميكرون). (3) أخذ العينات غير العضوية المغذيات امتصاص وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (4) أخذ العينات حل امتصاص العضوية وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (5) التغذية الجسيمات وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (6) كرر الخطوة 2 (فائقة العوالق التغذية كما فحص الجودة)؛ (7) تدفق التصور.

عندما يكون ذلك ممكنا من الناحية اللوجستية، فمن المستحسن أن القياسات الشخصية الأيضية هي مجتمعة مع معدل الضخ (على سبيل المثال، الأسلوب سرعة صبغ الجبهة، في ¹⁶⁾ وكذلك مع القياسات التنفس. من الأفضل أخذ هذه القياسات في بداية ونهاية الدورة أخذ العينات. لقياس التنفس، optodes تحت الماء أو الأقطاب الكهربائية الصغيرة هي الافضل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خطوات التحضيرية وتنظيف إجراءات

1. محلول تنظيف
   1. ارتداء ملابس واقية، معطف المختبر، والقفازات في جميع الأوقات. تنفيذ هذه الخطوات التحضيرية في مساحة نظيفة خالية من الغبار والدخان.
   2. إعداد الهيدروكلوريك حل 5-10٪ حمض (حمض الهيدروكلوريك) مع الطازجة، والجودة العالية، والماء المقطر مزدوجة.
   3. إعداد 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من انيوني وغير الأيونية حل السطحي (انظر قائمة المواد) مع الطازجة، والجودة العالية، والماء المقطر مزدوجة.
   4. تخزين جميع الحلول في نظيفة، وغسلها حمض الحاويات.
2. الخطوات التحضيرية وإجراءات التنظيف (في المختبر)
   ملاحظة: إذا مركبات الفوسفور ليست ذات فائدة، ويمكن استبدال غسل حمض الهيدروكلوريك من نوعية عالية من حمض الفوسفوريك (H ₃ PO ₄₎ غسل (8٪ H ₃ PO ₄ التركيز النهائي).
   1. ارتداء ملابس واقية، معطف المختبر، والقفازات في جميع الأوقات.
   2. غسلجهاز أخذ العينات (باستثناء الفولاذ المقاوم للصدأ Swinney حامل المرشح في الخط) مع كمية وافرة من المياه عالية النقاء. ترك الجهاز تمرغ في 5-10٪ من محلول حمض الهيدروكلوريك بين عشية وضحاها. شطف الجهاز مرة أخرى مع كمية وافرة من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
   3. غسل الفولاذ المقاوم للصدأ أصحاب Swinney مرشح في خط مع كمية وافرة من المياه عالية النقاء. ترك أصحاب مرشح تمرغ في 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية والسطحي غير أيوني الحل بين عشية وضحاها. شطف لهم مرة أخرى مع وافرة المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
   4. تجف كل جهاز أخذ العينات، والانتهاء منها في رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في علبة نظيفة حتى الاستخدام.
3. السيطرة على معدل شفط
   1. السيطرة على معدل أخذ العينات عن طريق ضبط طول والقطر الداخلي للأنابيب تناول وفقا لعمق العمل المخطط له ودرجة حرارة الماء. استخدام المعادلة التالية (مشتقة من المعادلة هاجن-بوازوي تستخدم لجمعة كاملاطورت تدفق أنابيب الصفحي) كدليل: حيث F = معدل التدفق (سم ³ دقائق ^-1)، ΔP = فرق الضغط (بار)، ص = أنابيب مدخل دائرة نصف قطرها الداخلي (سم)، K = 2.417 × 10 ^-9 (ثانية ^-2)، L = طول الأنبوب (سم )، V = اللزوجة المياه (ز سم ^-1 ثانية ^-1). انظر الجدول رقم 1 لمزيد من التفاصيل.
   2. حافظ على معدل أخذ العينات أقل من 1٪ من معدل ضخ الحيوان دراستها.
      ملاحظة: استخدام حاويات اجلاء، وأحيانا مع فراغ مجهول تشكل تعقيدات إضافية. لذلك، ينصح بشدة اختبار ميداني. في 10 م عمق و~ 22 درجة مئوية مياه البحر (40 PSU)، وهو الأنبوب 50 سم مدخل مع القطر الداخلي من 254 ميكرون يسلم متوسط ​​معدل شفط ~ 26 ميكرولتر ثانية ^-1 (1.56 مل دقيقة ^-1).
4. سفن أخذ العينات
   1. للحصول على عينات صغيرة الحجم (3-20 مل، على سبيل المثال، فائقة العوالق لCYT تدفقometry) استخدام أنابيب بلاستيكية معقمة بالمكنسة الكهربائية قبل.
      ويعمل ما قبل بالمكنسة الكهربائية أنابيب بلاستيكية معقمة بشكل روتيني لاختبارات الدم القياسية في البشر، ملاحظة: تأكد من استخدام أنابيب معقمة دون أي إضافات. من الأفضل أخذ عينات من هذه الأنابيب بلاستيكية معقمة بالمكنسة الكهربائية مع استخدام المعقم، حامل أنبوب تستخدم مرة واحدة مع خارج مركز لور. في حين أن هذا هو الجهاز الأكثر أمانا والأكثر كفاءة أخذ العينات، ولها حجم القتلى أكبر قليلا بالمقارنة مع إبرة بسيطة.
   2. لعينات المياه الكبيرة مثل المواد الغذائية والمواد العضوية الذائبة، واستخدام 40 أو 60 مل قارورة من الزجاج التي تلبي معايير وكالة حماية البيئة (EPA) لتحليل العضوية المتطايرة. وتشمل هذه القوارير غطاء من مادة البولي بروبيلين مع سيليكون الحاجز تواجهها PTFE.
   3. لكميات أكبر من استخدام زجاجات البنسلين مع سدادات المطاط أو قوارير فراغ.
   4. استخدام قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة (HDPE قارورة) للعينات السيليكا.
   5. لزيادة حجم العينة والحد من خطر تهجير سدادةأثناء الصعود، إخلاء (فراغ) البنود 1.4.2-1.4.4 قبل الغوص مع مضخة فراغ. فراغ يدويا باستخدام مضخة فراغ اليد أو حتى عن طريق مص الهواء مع حقنة. ومع ذلك، لتحقيق أفضل النتائج، ينصح مضخة كهربائية جيدة. lyophilizers القياسية توفر فراغ عالية.
      ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص عند استخدام قوارير بالمكنسة الكهربائية الكبيرة لضمان أن معدل الامتصاص أسرع الأولي لن تلوث عينات المياه الزفير.
5. إجراءات التنظيف سفينة
   1. لالعضوية الذائبة وNH ₄ ⁺ تحليل، استخدم قارورة تنظيفها قبل وكالة حماية البيئة الجديدة.
   2. شطف قارورة (الزجاج وHDPE) لتحليل المواد المغذية الأخرى على النحو التالي:
      1. شطف قارورة (الزجاج وHDPE) والبولي بروبيلين والقبعات ذات جودة عالية الماء المقطر مزدوجة. تثبيت الحاجز السيليكون الجديد.
      2. نقع قوارير (زجاج وHDPE) في 10٪ من حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 أيام على الأقل وشطف مع وافرة المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
      3. حرق قارورة زجاجية في 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات والسماح لتبرد في الفرن. تثبيت الغطاء، والتفاف في رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام.
6. مرشحات
   1. استخدام مرشحات الألياف الزجاجية الخالية من الموثق لترشيح من جميع العينات العضوية الذائبة (على سبيل المثال، DOC، DON) ولجمع المواد العضوية الجسيمات (على سبيل المثال، POC، PON). حزمة كل مرشح الزجاج في رقائق الألومنيوم مظروف منفصل. حرق على 400 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتطيير المخلفات العضوية وتخزينها في وعاء نظيف وجاف حتى الاستخدام.
   2. استخدام إما خالية من الموثق مرشحات الألياف الزجاجية على النحو الوارد أعلاه، أو 0.2 ميكرون الأغشية البولي لأخذ عينات المواد الغذائية غير العضوية (على سبيل المثال، PO ₄ ^3-، أكاسيد _{النيتروجين} ^- NH ₄ ^+). تنظيف الأخير مرة واحدة تركيبها في حامل مرشح كما هو موضح أدناه (1.7.3).
   3. استخدام 0.2 ميكرون الأغشية المرشحات البولي لأخذ العينات السيليكا. تنظيفها مرة واحدة تركيبهاد في حامل مرشح كما هو موضح أدناه (1.7.3).
7. إعداد التجمع الترشيح
   1. تصفية المزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية وحل السطحي غير الأيونية والجودة العالية الماء المقطر مزدوجة من خلال مرشح 0.2 ميكرون قبل استخدامها لتنظيف التجمع الترشيح.
   2. التجمع الترشيح على المواد الغذائية والمواد العضوية الذائبة أخرى من السيليكا:
      1. وضع حرقها مرشحات الألياف الزجاجية الخالية من الموثق داخل الفولاذ المقاوم للصدأ تصفية حامل Swinney في خط تنظيفها.
      2. استخدام حقنة حمض تنظيفها لتشغيل 100 مل من 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية وحل السطحي غير الأيونية ثم 100 مل من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج من خلال التجمع بأكمله.
   3. التجمع الترشيح لشافي _4:
      1. وضع مرشح البولي داخل حامل تصفية البولي تنظيف (PC مرشح حامل).
      2. استخدام حقنة حمض تنظيفها لصالامم المتحدة 30 مل من 5٪ حمض الهيدروكلوريك و 30 مل من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج من خلال التجمع بأكمله.
8. نظام الجمعية
   1. تجميع نظام للعمل تحت الماء باستخدام نظرة خاطفة (بولي الأثير كيتون) الأنابيب التي يبلغ قطرها الخارجي (OD) من 1.6 ملم وقطرها الداخلي (ID) من 254 ميكرومتر أو 177 ميكرون.
   2. استخدام سكين حاد أو نظرة خاطفة القاطع لقطع الأنابيب إلى الطول المطلوب.
   3. في النهاية البعيدة لل(عينة جانب حاوية)، وتناسب كل أنبوب مع موصل لور الذكور تعلق على إبرة حقنة. تأكد من اتباع تعليمات الشركة المصنعة ومحاذاة الجانب المسطح من اللون الأزرق الطويق flangeless مع نهاية الأنبوب قبل تشديد الجوز الأخضر.
   4. إرفاق أنابيب نظرة خاطفة إلى ترايبود "الأسلحة" أو تتلاعب مبنية خصيصا باستخدام الشريط العازلة.
   5. نعلق إبرة الحقنة إلى الموصل لور الذكور. الحفاظ على إبرة مع الغطاء الواقي لتفادي وقوع إصابات.
   6. تسمية بوضوح والعتاد أخذ العينات ورمز اللون جميع مكونات استنشاق والزفير (على سبيل المثال، أخضر = في والأحمر = السابق).
   7. وبالمثل رمز اللون الأوعية أخذ العينات مع مجموعات من السفن أخذ العينات يقترن مرقمة بشكل تسلسلي.

2. تحت الماء العمل

1. إعداد موقع العمل
   1. مسح أولي واختيار العينات
      ملاحظة: نظرا للطبيعة المعقدة للبروتوكول أخذ العينات تحت الماء، وتكريس الوقت اللازم لإعداد وضمان الغوص أخذ العينات كفاءة.
      1. مسح موقع العمل واتخاذ الاستعدادات اللازمة قبل الموعد المحدد.
      2. حدد ووضع علامة الكائنات المستهدفة المناسبة التي يمكن الوصول إليها بسهولة نسبيا. لأن ليس كل الكائنات الحية قد تكون بالضرورة نشطة في وقت الغوص أخذ العينات، وإعداد المزيد من محطات العمل مما كنت أتوقع أن عينة.
   2. تركيب دعامات قاعدة
      1. عرجن العمل على الركيزة وجهت:
         1. جبل الأصلي مقطع سرعة الافراج عن ترايبود مرونة في 1 الأوزان كجم الغوص ومجرد وضعه بجانب الحيوانات المستهدفة.
      2. عند العمل على الجدران الرأسية:
         1. جبل لوحات قاعدة الدعم لنظام VacuSIP، والسنانير لمعدات الإكسسوارات، والشماعات للسفينة جمع تحمل صينية أثناء مرحلة إعداد موقع العمل (2.1.1).
         2. عندما تستخدم حوامل المحمولة مرنة، واستخدام مسامير أو راتنجات الايبوكسي اثنين من المكونات لإصلاح اللوحات 10X10 سم PVC بجانب كل حيوان الهدف. كل لوحة يحتاج الى حفرة لنعلق لقطات الافراج عنهم بسرعة من ترايبود المحمولة مرنة.
         3. مرة واحدة وقد شفي الراتنج ولوحات قاعدة ترد بقوة على الحائط، والمسمار في لقطات الافراج عنهم بسرعة، بمثابة نقطة ارتباط حازمة لترايبود المحمولة مرنة لنظام VacuSIP.
2. تثبيت فرجينياCUSIP
   1. تحقق ما إذا كانت العينة يضخ عن طريق الإفراج عن تصفيتها فلوريسئين الصبغة بجانب فتحة الاستنشاق والتأكد من أن الصبغة في الظهور من خلال فتحة exhalent كما هو موضح في ياهيل وآخرون (2005) ^16.
   2. تثبيت الجهاز VacuSIP ووضع أنبوب المستنشق (IN) أخذ العينات داخل فتحة الاستنشاق أو فقط لأنها المقبل (داخل ~ 5 ملم). تأكد من أن أنبوب نشوق ليس على مقربة من فوهة زافر آخر.
   3. بعناية توجيه أنبوب أخذ العينات زافر (EX) نحو فويهة / سيفون زافر وأدخله بلطف شديد، وذلك حتى يتم وضعه 1-5 ملم داخل فويهة / سيفون زافر (انظر الشكل 1 والتكميلية فيديو 1). الحرص على عدم اجراء اتصالات مع أو تعكير صفو الحي عينات.
   4. قبل وأثناء أخذ العينات المزدوج تحقق من موقع من كل من الأنابيب.
   5. بعد فحص العينات ما إذا كانت العينة لا تزال تضخ كما ديسcribed فوق (2.2.1).
      ملاحظة: نظرا لأن حركة الذراع واحدة من ترايبود عند التعامل مع الآخر قد تحدث، تأكد من أن تضع أولا أنبوب أخذ العينات نشوق وثانيا أنبوب زافر، الأمر الذي يتطلب معالجة أكثر دقة. تتبع هذا النظام، حتى لو كان التلاعب في أنبوب أخذ العينات زافر قد يسبب حركة أنبوب نشوق، فإنه لن يؤثر على أخذ العينات.
3. وحدات إجراءات أخذ العينات تحت الماء
   ملاحظة: قيد على سؤال البحث، لا يمكن أن يؤديها كل خطوة من الخطوات التجريبية أدناه كتجربة قائمة بذاتها. بروتوكول أخذ العينات الشخصي التمثيل الغذائي الكامل هو موضح أدناه هو عملية طويلة، تتطلب ما يصل إلى 8 ساعات في العينة (لمحة عامة انظر الشكل 2 والجدول 2). كما تختلف شروط وضوابط الغوص بين مواقع أخذ العينات والمناطق والمؤسسات، لا يتم تضمين خطط الغوص في هذا البروتوكول. ومع ذلك، تكريس العناية القصوى وميتىالتخطيط culous لخطة الغوص. دفع عناية خاصة لتجنب التشبع وملامح الغوص يويو. عندما يكون ذلك ممكنا، فإنه من المستحسن لإجراء هذه التجارب على عمق ضحل (<10 م). يمكن rebreathers دائرة مغلقة يكون مفيد جدا لمثل هذه المخططات أخذ العينات لفترات طويلة.
   1. قبل أن تبدأ المعاينة الفعلية، تأكد من تبقى أي آثار واضحة على بقايا فلوريسئين وقد تم تسويتها أن الرواسب العالقة أو قد فاحت بعيدا.
      
   2. فائقة العوالق، (يتم تثبيت أي مرشح في هذه الخطوة!)
      1. استخدام إبرة لاختراق IN (الاستنشاق) وEX (الزفير) بالمكنسة الكهربائية أنابيب بلاستيكية معقمة الحاجز. تحقق من أن الماء يقطر في بسعر التخطيط وجمع عينات 2-6 مل من الماء.
      2. على استرجاع، والحفاظ على العينات في مربع الباردة على الجليد. في المختبر، والحفاظ على 1٪ امتصاص العرق + 0.05٪ EM الصف غلوتارالدهيد (تركيز النهائي)، أو 0.2٪ EM الصف غلوتارالدهيد. تجميد cryovials في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 &# 176؛ ج حتى التحليل.
   3. أخذ العينات السيليكات وتخزين
      1. تثبيت المقاوم للصدأ حامل المرشح الكمبيوتر قبل تنظيفها في السطر الذي يحتوي على غشاء البولي 0.2 ميكرون بين الإبرة وموصل ذكر لور في نهاية البعيدة للأنبوب.
      2. بيرس الغطاء الحاجز من قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة تنظيفها مسبقا (قارورة HDPE) لبدء أخذ العينات. تحقق من أن كل من العينات ويقطر وجمع 15 مل من الماء في كل قارورة.
      3. الحفاظ على عينات المبردة (4 درجة مئوية) حتى التحليل. إذا التحليل لا يمكن أن تبدأ في غضون أسبوعين، مخزن في -20 درجة مئوية. لتحليلها، تأكد من أن العينات يتم إذابة عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة على الأقل لإذابة المواد الهلامية السيليكا.
         ملاحظة: الغشاء يمكن الحفاظ عليها للفحص المجهري أو تحليل الحمض النووي حسب الحاجة.
   4. غير العضوي المذاب (أ ف ب ₄ ^3-، أكاسيد _{النيتروجين} ^- NH ₄ ⁺⁾
      1. استبدال رانه مرشح PC التجميع مع حامل المرشح قبل تنظيفها في خط الفولاذ المقاوم للصدأ التي تحتوي على فلتر الزجاج قبل حرقها.
      2. قبل أخذ العينات، وضمان أن صدرت لا يقل عن 20 مل من عينات مياه البحر من خلال نظام الترشيح بأكمله باستخدام وكالة حماية البيئة، قوارير البولي أو غيرها من السفن فراغ لبدء شفط. قياس حجم المياه التي تم جمعها قبل أن يتم التخلص منها.
      3. بيرس الغطاء الحاجز من قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة المناسبة لبدء أخذ العينات، والتحقق من أن كل من العينات ويقطر، وجمع 25-30 مل النترات والفوسفات تحليل.
      4. التبديل إلى قارورة EPA الزجاج جديدة لتحليل الأمونيا، تحقق من أن كلا من العينات ويقطر، وجمع 20 مل في كل قارورة.
      5. الحفاظ على العينات في مربع البارد على الجليد ومخزن في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
         ملاحظة: إلا إذا الترشيح هو من مصلحة، والمرشحات الحقنة يمكن أن تستخدم لخطوات 2.3.3 و 2.3.4.
   5. العضوية المذابة (DOC + DON) أخذ العينات والحادي والعشرينأورينج
      ملاحظة: الحفاظ على العينات وتستقيم ممكن في جميع أنحاء التعامل مع ذلك لا يأتي أن الماء عينة في اتصال مع الحاجز السيليكون.
      1. الاستمرار في استخدام المقاوم للصدأ مرشح التجمع الصلب وجمع 20 مل من عينات مياه البحر في قوارير جديدة الزجاج وكالة حماية البيئة، كما هو موضح أعلاه.
      2. على استرجاع، والحفاظ على العينات في مربع الباردة على الجليد. في المختبر، واستخدام الزجاج ماصة باستير حرقها قبل لإصلاح عينات مع صحيح حامض الفوسفوريك (إضافة 5-6 قطرات من 25٪ المعادن النزرة حمض الصف إلى 20 مل عينة، وتركيز النهائي 0.04٪) أو حامض الهيدروكلوريك (إضافة 2 قطرات من المعادن النزرة الصف يتركز حامض إلى عينة 20 مل، وتركيز النهائي 0.1٪) ويحفظ في الثلاجة.
      3. الحفاظ على عينات المبردة (4 درجة مئوية) حتى التحليل. إذا لم يتم تحليل العينات في غضون أسبوع من جمع وتخزين في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
   6. الجسيمات العضوية (POC، ثمة حاجة ملحة، POP)
      1. الاستمرار في استخدام الواحدainless مرشح التجمع الصلب ومرشح لا يقل عن 500 مل من مياه البحر إلى إجلاء 250 مل قارورة فراغ. استبدال قوارير إذا لزم الأمر.
      2. على استرجاع، استخدم حقنة مليئة بالهواء لاجلاء كل مياه البحر المتبقية من حامل تصفية، ألفه في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في صندوق الباردة على الجليد. في المختبر، وإزالة مرشحات من أصحاب تصفية وتخزين في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

الشكل 1. مثال على المنشآت الصحيحة للVacuSIP: (أ) أخذ عينات من ascidian Polycarpa mytiligera (خليج العقبة والبحر الأحمر) باستخدام مناور مبنية خصيصا لرمز اللون المستخدمة الأخضر للاستنشاق والأصفر لعينات المياه الزفير (الصورة توم Shelizenger ويوفال يعقوبي)؛ (ب) أخذ عينات من oroides الإسفنج Agelas (شمال غرب البحر الأبيض المتوسطالبحر) مع عرض فويهة من 3 ملم، وذلك باستخدام جهاز VacuSIP. رمز اللون المستخدم هو الأصفر لالاستنشاق والأحمر لعينات المياه الزفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. نظرة عامة على تقنية VacuSIP الموضحة في قسم البروتوكول. ويمثل العمل في المعمل في صناديق صفراء، والعمل الميداني في الصناديق الزرقاء. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. الشاملة متوسط ​​معدلات أخذ العينات (مل دقيقة ^-1) الحصول مع حاويات مختلفةتستخدم لجمع المياه ومستويات فراغ مختلفة: كانت قوارير لا فراغ فضاء (لا شيء)؛ والمكنسة الكهربائية وكالة حماية البيئة قوارير زجاجية وقوارير البولي نصف حجمها (نصف حجم)؛ والمكنسة الكهربائية وأنابيب بلاستيكية معقمة بالفعل من قبل الشركة المصنعة. العمل في 5-8 م في العمق، درجة حرارة الماء 18-22 درجة مئوية، وذلك باستخدام أنابيب نظرة خاطفة من طول 79 سم ومن 25 ميكرون قطرها الداخلي.

الجدول 2. نظرة عامة على السفينة أخذ العينات، مرشح التجمع تثبيتي، في خط والتخزين وطرق التحليل الموضحة في قسم البروتوكول. المركبات تحليلها هي: فائقة العوالق وفرة (العوالق <10 ميكرون)، سيليكات (شافي ₄₎ والفوسفات (أ ف ب ₄ ^3-) والنتريت + نترات (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-)، والمواد العضوية الذائبة (DOM)، الأمونيوم (NH ₄ ⁺⁾ والمواد العضوية الجسيمية(بوم). جميع آنية أخذ العينات تحتوي السيليكون غطاء الحاجز وبالمكنسة الكهربائية قبل أخذ العينات. ومثبتات هي: امتصاص العرق + غلوتارالدهيد (تخمة + Parafor)، صحيح حامض الفوسفوريك (H ₃ PO ₄₎ وحمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك). المجالس مرشح في خط المستخدمة هي: أصحاب مرشح البولي والبولي غشاء 0.2 ميكرون مرشحات (PC تصفية حامل + غشاء PC) وأصحاب مرشح الفولاذ المقاوم للصدأ والألياف الزجاجية الخالية من الموثق مرشحات مهرجان الخليج السينمائي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحسين أساليب جمع مياه البحر

اختيار قارورة جامع وإجراء التنظيف

يجب أن يكون السفن جمع VacuSIP المتوافقة مع الحاجز الذ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات التحضيرية

قارورة جامعي لDOM وتحليل المواد الغذائية

منذ السفن جامع قد تتفاعل مع حل المكونات الدقيقة والجدران العينات قد تكون ركيزة لنمو البكتيريا ^30-34، تم ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (254 µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13 mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution	Decon Labs	1002	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100 g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2 ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500 g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump