VacuSIP，对改进的方法INEX<em&gt;原位</em&gt;颗粒物与测量溶解的化合物加工后主动悬挂给料机

摘要

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

摘要

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

引言

底栖食悬浮在海洋生态系统¹的功能发挥重要作用。通过筛选大量的水^2,3，它们捞出分泌颗粒（浮游生物和碎屑）和溶解的化合物^1（和参考文献），并底栖中上层耦合^4,5和养分循环^6,7的重要代理人。精确测量的微粒和溶解的化合物除去由底栖悬浮馈线（如海绵，海鞘，多毛，和双壳类）排泄是基本了解他们的生理，代谢和摄食生态。连同泵送率测量，这也使得能够通过这些生物体和水质以及对生态系统规模的过程及其生态影响介导的养分通量的定量。

选择测量颗粒去除和生产率和溶解融为一体适当的方法英镑由悬挂滤食性是获得关于它们的觅食活动⁸可靠的数据至关重要。如通过Riisgård和其他不适当方法偏压结果指出，扭曲的实验条件下，产生摄取和某些物质排泄的不正确的估计，并能导致由这些生物处理的养分通量的错误的定量。

两个最频繁使用的方​​法来测量滤食微粒和溶解养分通量涉及要么孵化（间接技术）或环境的同时收集和呼出的水（直接技术）。孵化技术基于测量的变化率中的颗粒在温育水的浓度和溶解的营养物，并估计生产或除去速率相比充分控制^8。然而，在孵育室包围生物体可以改变其还精g且泵送行为由于自然流动状态的变化，是由于在氧和/或在食物浓度，或由于在孵化水中^7,9-排泄化合物（和其中的参考文献）的积累减少。除了 ​​分娩和改性水供给的影响，温育技术的重大偏差，从重新过滤效果（参见例如^10）的茎。虽然其中一些方法问题已经通过使用合适的体积和形状的孵化容器¹¹的或在原位 ¹²引入再循环钟罩系统克服，这种技术经常低估去除和生产率。量化溶解化合物如溶于有机氮（DON）和碳（DOC）或无机营养素的代谢，已被证明是特别容易引起孵化技术¹³偏见。

在60年代末和70年代初，亨利·Reiswig^9,14,15开创了直接技术的应用巨加勒比海海绵，量化通过单独采样，原位生物体吸入呼出的水粒子去除。由于施加在较小悬浮馈线和在更具挑战性的水下条件Reiswig的技术难度，研究在本领域的大部分仅限于实验室（体外 ）使用大多间接孵化技术^16。 Yahel和同事改装Reiswig的直接原位技术，规模较小的条件下工作。他们的方法，被称为INEX ^16，是基于原状生物吸入（In）和呼出（出）水的同时水下采样。不同浓度的一对样品（INEX）之间的物质（ 例如 ，细菌）的提供由动物的该物质的保持率（或生产）的量度。该INEX技术采用开放式的管依赖于所研究的生物体的泵送活动产生被动替换环境中的水收集管中的出水管喷射。而Yahel和同事在15种以上不同的悬浮液的研究已经成功地应用这种技术进料器类群（ 例如 ^，17），该方法是由所需的高级别实践经验的制约，一些出水管孔的微小的尺寸，并通过海况。

为了克服这些障碍，我们开发的基础上，通过细管的水样的吸控制（外径<1.6毫米）的替代技术。我们的目标是创造一种简单，可靠，廉价的设备，允许清洁和从一个非常具体的点， 在原位水采样控制如底栖悬浮馈线的出水管孔口。是有效的，该方法具有以非侵入以免影响周围流动状态或修改将b所研究的生物ehavior。这里介绍的设备被称为VacuSIP。它是由Yahel 等人开发的SIP系统的简化。 （2007年^）18在深海ROV基于点采样。该VacuSIP是比原来的SIP相当便宜，它已被改编为根据SCUBA工作。该系统是根据用于实验室环境提出并通过Wright和斯蒂芬^（1978）19和Møhlenberg和^{Riisgård（1978）20}测试原理设计。

虽然VacuSIP系统是在海底悬浮馈线的代谢的原位研究设计用于，它也可用于实验室研究和任何需要控制和清洁，点源的水样。需要在延长的时间段（最小-小时） 或原位抽滤集成系统时是特别有用的。该VacuSIP已在2011年以来Yahel实验室成功地使用，并且还在最近的两个由加勒比和地中海海绵²¹种营养介导通量研究被使用（莫尔甘蒂等人提交）。

使用特定的采样器，该延长取样持续时间，和现场条件下，在被施加VacuSIP，而承受从标准海洋学协议一些偏差，收集，过滤，并存储样本敏感的分析物。由VacuSIP系统或水样的变形例的由收集后细菌活性的风险降低污染的风险，我们测试原位过滤和存储程序的各种。不同的过滤器，收集容器，并存储程序，以实现溶解无机（PO ₄ ^3-，NO _x的^- ，NH ⁺ ₄的SiO _4）的分析中最适合的技术进行了检查，有机（DOC +，DON）化合物，和超浮游生物（<1081 M）和颗粒有机（POC + PON）采样。为了进一步减少污染的风险，尤其是在野外条件下，处理步骤的数量减少到最低限度。其中提出的方法的可视格式被定向，以促进再现性并减少以有效地应用该技术所需的时间。

系统总览

在从具有小到2毫米exhalant孔悬浮液供料器原位泵送水样，每个试样的泵送活性首先通过释放过滤荧光染色海水可视的吸入口（S）和观察从出水管孔¹⁶其流动旁（也参见图2B中^18）。在研究样品（incurrent和出水管）吸入和呼出的水，然后同时通过使用一对安装在定制操纵分钟管的或在两个所述"芳的采样毫秒"倒置柔性便携式三角架的（ 图1和补充视频1）。在研究有机体吸入的水通过一管的近端仔细定位的内部或附近的研究生物的吸入孔收集。一个恒然后管被定位在出水管孔口内。此操作需要良好小心，以避免接触或动 ​​物的干扰， 例如 ，通过沉淀再悬浮。为了开始采样，潜水员刺穿在收集容器与连接到注射针的隔膜每个管的远端，允许外部水压力迫使采样水进入通过采样管的容器中。抽吸通过先前在小瓶中产生的真空和通过外部水和抽空样品容器之间的压力差启动。

为确保呼出的水干净收集和避免AMBI意外吸耳鼻喉科水¹⁶时，水的采样速率需要被保持在比所述出水管流速的显著降低率（<10％）。抽吸速率由管的长度和它的内直径（ID）的控制。小内径也保证了可以忽略不计的死体积（<每管200米微升）。采样过长时间的（几分钟到几小时）使得有可能感兴趣的大多数物质的固有斑块集成。以确保样品充分保留在延长的水下采样会话以及用于运输到实验室， 在原位过滤推荐用于敏感的分析物。取样容器，过滤组件和管道的选择是通过研究生物和具体的研究问题所决定的。下面描述的协议假定一个完整代谢分布是感兴趣（查看概述参见图2）。然而，协议的模块化特性允许˚F否则容易修改，以适应更简单，甚至非常不同的抽样方案。对于一个完整的代谢分布，采样协议应该包括以下步骤:（1）流量可视化; （2）取样超浮游生物馈送（浮游生物<10微米）; （3）采样无机养分的吸收和排泄（使用在线过滤器）; （4）采样溶解有机的吸收和排泄（使用在线过滤器）; （5）颗粒喂养和排泄（使用在线过滤器）; （6）重复步骤2（超浮游生物喂养的质量检查）; （7）流量的可视化。

当后勤可行的，则建议的代谢分布测量用泵送速率组合（ 例如，染料前端速度的方法，在^16）以及与呼吸测量。这些测量是在取样会话的开始和结束时最好服用。为呼吸测量，水下光极或微电极是优选的。

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研究方案

1.预备步骤和清洁程序

1. 清洗液
   1. 穿戴护具，白大褂和手套在任何时候。开展无烟尘一个干净的空间，这些准备步骤。
   2. 使用新鲜的，高品质，双蒸水5-10％的盐酸（HCl）解决方案。
   3. 制备5％的阴离子和非离子表面活性剂溶液的高度可溶基本混合物（见材料清单）用新鲜的，高品质，双蒸水。
   4. 存放在干净的所有解决方案，酸洗容器。
2. 预备步骤和清洗程序（在实验室）
   注意:如果磷化合物不感兴趣，盐酸洗可以通过高质量的磷酸（H ₃ PO _4）洗涤（8％ _的 H ₃ PO ₄的最终浓度）来代替。
   1. 穿戴护具，白大褂和手套在任何时候。
   2. 洗取样装置（不包括在行不锈钢Swinney过滤器支架）与高纯度的水足量。留在5-10％的HCl溶液中浸泡过夜装置。以高品质的双蒸水足量再次冲洗设备。
   3. 用的高纯度的水足量清洗直列不锈钢Swinney滤波器持有者。离开过滤器托架，在5％浸泡的阴离子和非离子表面活性剂溶液高度可溶性碱性混合物过夜。充足的高品质双蒸水再次冲洗。
   4. 干所有的取样装置，包裹在铝箔中并保持在清洁箱，直到使用。
3. 吸率控制
   1. 通过调整长度，并根据计划的工作深度和水温的吸入管的内径控制采样速率。使用下面的等式（与用于充分DEVEL的泊肃叶定律导出OPED层管流），作为指导: 其中，F =流速（厘米³分钟^-1），ΔP=差压（巴）中，r =进口管内部半径（厘米），K = 2.417×10 ^-9（秒^-2）中，L =管的长度（厘米），V =水的粘度（G ^-1秒^-1）。请参阅表1的更多细节。
   2. 保持低于所研究的动物的泵送速率的1％，采样率。
      注意:使用撤离容器，有时有未知的真空造成额​​外的并发症。因此，强烈建议现场试验。以10米的深度和〜22℃的海水（40 PSU），具有254微米的内径在50cm入口管提供26微升秒^-1（1.56毫升分钟^-1）的〜平均吸速率。
4. 采样船
   1. 对于小体积样品（3-20毫升， 例如，超浮游生物流量CYTometry）使用预先抽真空的无菌塑料管中。
      注意:预抽真空的无菌塑料试管常规用于人类标准血液测试;确保无添加剂使用无菌试管中。这些抽真空的无菌塑料试管最好使用无菌，单次使用的管保持架的偏离中心的Luer采样。虽然这是最安全和最有效的采样装置，它有一个稍大死体积相比简单的针头。
   2. 对于较大的水样，如营养物和溶解的有机物，使用符合挥发性有机分析环境保护署（EPA）的标准40或60毫升的玻璃小瓶中。这些小瓶包括聚四氟乙烯，硅面临隔膜的聚丙烯盖。
   3. 对于更大的体积，使用带有橡皮塞或保温瓶瓶青霉素。
   4. 使用高密度聚乙烯瓶（HDPE瓶）的二氧化硅样品。
   5. 为了增加样本容量和减小塞子撞出的风险在上升过程中，用真空泵在潜水前撤离（真空）项目1.4.2-1.4.4。真空手动使用手真空泵或者甚至通过用注射器抽吸空气。然而，为了获得最佳效果，建议了良好的真空泵。标准冻干机提供高真空。
      注意:使用大抽真空烧瓶时，确保了更快的初始吸率将不会污染呼出水样要特别注意。
5. 容器清洗程序
   1. 对于溶解的有机物和NH ₄ ⁺的分析，采用新的预清洁的EPA瓶。
   2. 漂洗等营养成分的分析小瓶（玻璃和HDPE）如下:
      1. 冲洗小瓶（玻璃和HDPE）和高品质的双蒸水的聚丙烯盖。安装新的硅隔膜。
      2. 浸泡小瓶（玻璃和HDPE）在10％的HCl至少3天，并拥有充足的高品质双蒸水冲洗。
      3. 燃烧该玻璃小瓶在450℃下进行4小时，并允许在炉中冷却。安装帽，并在铝箔包裹直到使用。
6. 过滤器
   1. 使用无粘合剂的玻璃纤维过滤器对所有溶解的有机样品过滤（ 例如 ，DOC，DON），并为粒状有机物的集合（ 例如 ，POC，PON）。包在一个单独的铝箔信封中的每个玻璃过滤器。燃烧在400℃2小时以挥发在干净和干燥的容器中的有机残基和储存，直到使用。
   2. 使用一个无粘合剂的玻璃纤维过滤器如上述，或0.2微米的聚碳酸酯膜的用于进行采样的无机营养物（如 PO ₄ ^3-，NO _x的^- NH ₄ ^+）。清洁一旦安装过滤网架下方（1.7.3）作为解释后者。
   3. 使用0.2微米的石英采样聚碳酸酯膜过滤器。清洁它们一旦installed。在过滤网架下方（1.7.3）的解释。
7. 过滤组件的研制
   1. 使用它们来清洁过滤组件之前过滤通过0.2微米的过滤器阴离子和非离子表面活性剂溶液和高品质的双蒸水的高度可溶性基本组合。
   2. 对营养和二氧化硅以外溶解性有机物过滤组件:
      1. 将清洁后在线不锈钢Swinney过滤器支架内燃烧无粘合剂的玻璃纤维过滤器。
      2. 使用酸清洗注射器穿过整个组件来运行百毫升阴离子和非离子表面活性剂溶液的5％的高度可溶性碱性混合物，然后加入100毫升的高品质的双蒸水。
   3. 一氧化硅₄过滤组件:
      1. 将清洁后的聚碳酸酯过滤器固定架（PC过滤器支架）内的聚碳酸酯过滤器。
      2. 使用酸清洗注射器于r未30毫升5％盐酸，并通过整个组件30毫升高品质的双蒸水。
8. 系统组装
   1. 组装系统使用PEEK（聚醚醚酮）油管为1.6毫米的外径（OD）和254微米或177微米的内径（ID）的水下工作。
   2. 用锋利的刀或PEEK切割器管切割成所需的长度。
   3. 在其远端（样品容器侧），适合每个管连接到注射器针一凸形Luer连接头。请务必遵循制造商的指示，并拧紧螺母绿色对准前用管的末端蓝色兰套圈的侧扁。
   4. 通过使用绝缘胶带连接PEEK管到三脚架"武器"或定制的机械手。
   5. 附加一次性注射器针头注射器阳连接器。保持针头的保护盖，以防受伤。
   6. 清楚标示采样齿轮和色码所有吸入呼出组件（ 例如 ，绿色= IN，红色=例）。
   7. 同样颜色代码组成对采样管的采样管按顺序编号。

2.工作水下

1. 工作现场准备
   1. 初步调查和标本的选择
      注:由于水下取样协议的复杂性，费尽准备必要的时间将保证一个有效的采样跳水。
      1. 调查工作网站，并提前必要的准备。
      2. 选择和标记可相对容易地访问合适的靶生物。由于不是所有的生物体可能一定是活跃在采样潜水的时候，准备多个工作站比您预期品尝。
   2. 基座支架的安装
      1. WHEN个工作水平的基板上:
         1. 安装在1公斤潜水加权柔性三角架的原始快速释放夹子和简单地旁目标动物定位。
      2. 当垂直的墙壁上工作:
         1. 对于VacuSIP系统安装底座支撑板，挂钩附件齿轮和衣架在工作现场准备阶段（2.1.1）携带托盘收集容器。
         2. 当使用柔性的便携式三脚架，使用螺栓或双组分环氧树脂固定旁边的每个目标动物10×10厘米的PVC板。每个板需要有一个孔，以连接所述柔性便携式三角架的快速释放的剪辑。
         3. 一旦树脂固化和底座牢固地贴在墙壁上，拧在快速释放剪辑，作为一个坚定执着点为VacuSIP系统灵活便携三脚架。
2. 安装弗吉尼亚州CUSIP
   1. 检查样品是否通过释放旁边的吸入孔过滤荧光素染料泵送和确认该染料是新兴通过呼出孔口如Yahel 等人所述^{（2005）16。}
   2. 安装VacuSIP设备，并将吸入（IN）采样管吸入剂孔内或只是在旁边（内约5毫米）。确保该吸入管是不是在另一个exhalant孔的附近。
   3. 精心指导exhalant（EX）采样管向吸盘/ exhalant虹吸非常温和地将其插入，直到它被定位在吸盘/ exhalant虹吸（ 见图1和补充视频1）内1-5毫米。请特别注意不要使接触或以其他方式干扰采样的有机体。
   4. 之前和期间的采样双重检查两个管的位置。
   5. 取样检查后是否将标本仍然抽为DEScribed上述（2.2.1）。
      注:由于三脚架的一只手臂的运动操纵其他可能发生的时候，一定要首先放在吸入采样管二来exhalant管，这就需要更精确的操控。按照此顺序，即使exhalant采样管的操作可能会导致吸入管的运动，也不会影响到采样。
3. 模块化水下取样程序
   注:所研究的问题之前，下面的每个实验步骤可以作为一个独立的实验进行。下面描述的完整代谢分布采样协议是一个漫长的过程，需要高达每个试样8小时（对于概述参见图2和表2）。潜水条件和规定采样点，地区和机构之间的不同，潜水计划不包括在此协议。然而，投入非常谨慎和METIculous规划的潜水计划。要特别小心，以避免饱和度和YOYO潜水资料。如果可能，最好是进行这些实验在深度浅（<10米）。闭路循环呼吸器可以这样长时间的抽样方案非常方便。
   1. 实际采样开始之前，确保残留荧光没有明显的痕迹依然和悬浮物已经解决或已经飘荡了。
      
   2. 超浮游生物，（没有过滤器安装在该步骤！）
      1. 用针头刺破IN（吸入的）和EX（呼出）真空无菌塑料管隔。验证水计划的速度滴水，并收集2-6毫升的水样。
      2. 检索时，保持样品中冰冷箱。在实验室中，保持用1％多聚甲醛+ 0.05％的EM级戊二醛（最终浓度），或0.2％的EM等级戊二醛。冷冻在液氮中并储存冷冻管在-80＃176; C，直到分析。
   3. 硅酸盐采样和存储
      1. 安装含有针和在该管的远端的鲁尔阳连接器之间的0.2微米的聚碳酸酯膜的预清洗直列不锈钢的PC过滤器保持器。
      2. 皮尔斯的预清洗的高密度聚乙烯瓶（HDPE瓶）的隔片盖开始采样。验证两个采样器滴落并收集15ml水中的每个小瓶中。
      3. 保持冷藏样品（4℃），直到分析。如果分析不能半个月，卖场内开始在-20°C。为了分析，确保将样品在50℃下解冻，至少50分钟，以溶解硅石凝胶。
         注:根据需要，膜可以保存镜检或DNA分析。
   4. 溶解无机物（PO ₄ ^3-，NO _x的^- ，NH ₄ ^+）
      1. 替代T.他的PC过滤器组件与包含一个燃烧预玻璃过滤器的预清洁直列不锈钢过滤器保持器。
      2. 采样之前，确保至少20毫升海水样品均通过使用EPA，高密度聚乙烯小瓶或其他真空容器以开始抽吸通过整个过滤系统通过。测量所收集的水的体积被丢弃之前。
      3. 皮尔斯适当的EPA玻璃小瓶的隔膜帽开始采样，验证两个采样器滴，收集25-30毫升硝酸盐和磷酸盐的分析。
      4. 切换到新的EPA玻璃瓶中氨的分析，验证两个采样器滴，收集20毫升每个小瓶。
      5. 保持在冰上并存储一个冷箱样品在-20℃，直到分析。
         注意:如果只滤液是所关注的，一次性注射器过滤器，可用于步骤2.3.3和2.3.4。
   5. 溶解的有机物（DOC + DON）采样和STO形圈
      注意:保持的样品一样直立地处理整个使水样不来与硅隔膜接触。
      1. 继续使用不锈钢过滤器组件和收集20毫升海水样品进入新的EPA玻璃小瓶，如上所述。
      2. 经检索，保留样品中冰冷箱。在实验室中，使用预燃烧玻璃巴斯德吸管，修正正磷酸的样品（添加25％的痕量金属级酸5-6滴入20ml的样品，终浓度为0.04％）或盐酸（加2滴痕量金属的级浓酸成20 ml样品，最终浓度0.1％），并保持冷藏。
      3. 保持冷藏样品（4℃），直到分析。如果样品没有在-20°C，直到分析收集，存储的一个星期内进行分析。
   6. 颗粒有机物（POC，PON，POP）
      1. 继续使用STainless钢过滤器组件和过滤器的至少500毫升海水进入抽空250毫升真空烧瓶中。如有必要，更换瓶。
      2. 在检索，使用空气充式注射器从过滤器支架撤出所有剩余的海水，用铝箔纸包起来，然后在冰上冷箱存放。在实验室中，从过滤器托架去除的过滤器，并在-20℃下直到分析存储。

图1. VacuSIP的正确安装的一个例子:用绿色吸入和黄色呼出的水样（照片取样使用带有色码定制的机械手的海鞘桐子mytiligera（亚喀巴湾，红海）（A）由汤姆Shelizenger和尤瓦Yacobi）; （ 二 ）抽样海绵Agelas oroides（NW地中海海）为3毫米的排水孔的宽度，使用VacuSIP设备。使用的颜色代码是黄色为吸入和红色呼出的水样。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.概述协议部分中描述的VacuSIP技术。该实验室的工作是在黄色方框表示，在蓝盒子实地调查。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1.整体平均采样率（毫升分钟^-1），不同的容器获得用于水集合和不同的真空度:烧瓶没有真空（无）; EPA玻璃小瓶和HDPE小瓶抽真空的容积（半体积）的一半;无菌塑料试管已经由生产抽真空。在5-8米深度，18-22℃的水温合作，利用79厘米长度25微米内径的PEEK管。

表2取样容器中，固定剂，在线过滤器组件中，存储的概述和在协议部分中描述的分析方法。所分析的化合物是:超浮游生物丰度（浮游生物<10微米），硅酸盐（氧化硅_4），磷酸盐（PO ₄ ^3-），亚硝酸盐+硝酸盐（NO ₂ ^- + NO ₃ ^{- ），}溶解有机物质（DOM），铵（NH ⁺ _4）和颗粒有机物质（POM）。所有取样容器有硅隔膜帽和取样之前抽真空。所述固定剂是:多聚甲醛+戊二醛（戊二醛+ Parafor），正磷酸（H ₃ PO _4）和盐酸（HCl）。所使用的在线过滤器组件是:聚碳酸酯过滤器固定器和聚碳酸酯膜0.2μm的滤膜（PC过滤器保持器+ PC膜）和不锈钢过滤器固定器和无粘合剂的玻璃纤维过滤器GFF。

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结果

海水收集方法优化

收集瓶和清洗程序的选择

VacuSIP兼容收集容器应具有一个隔膜，允许采样到通过用注射器针头刺入发起。他们应该承受较高压力的水下（2-3条在工作深度潜水典型），并应维持真空。许多（但不是所有品牌）的挥发性有机物的分?...

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讨论

准备步骤

收集瓶的DOM和营养分析

因为集电极船只可与溶解微成分相互作用并采样壁可以是用于生长^30-34，对DOM和养分收集不同小瓶测试细菌的底物。不建议二氧化硅定量^33,35硼硅酸盐，因为玻璃瓶最多可将两折增加二氧化硅的初始浓度如果样品不能迅速冻结^30。我们的结果表明，使用预清洁的EPA小...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (254 µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13 mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution	Decon Labs	1002	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100 g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2 ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500 g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump