VacuSIP, un método mejorado para InEx<em&gt; In Situ</em&gt; Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Resumen

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Resumen

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introducción

Suspensívoros bentónicos juegan un papel esencial en el funcionamiento de los ecosistemas marinos ^1. Al filtrar grandes volúmenes de agua ^2,3, se quitan y excretan partículas (plancton y detritus) y los compuestos disueltos ¹ (y las referencias en él) y son un importante agente de acoplamiento pelágico-bentónico ^4,5 y ^6,7 ciclo de nutrientes. La medición precisa de las partículas y compuestos disueltos retirados y excretados por suspensívoros bentónicos (tales como esponjas, ascidias, poliquetos y bivalvos) es fundamental para entender su fisiología, metabolismo, y la ecología de la alimentación. Junto con el bombeo de medidas de la velocidad, sino que también permite una cuantificación de los flujos de nutrientes mediadas por estos organismos y su impacto ecológico sobre la calidad del agua, así como en los procesos a escala del ecosistema.

Elegir el método adecuado para la medición de las tasas de extracción y producción de partículas y disuelto comlibras por organismos filtradores suspensión es crucial para la obtención de datos fiables en cuanto a su actividad de alimentación ^8. Como ha señalado Riisgård y otros, inapropiadas resultados metodologías de polarización, distorsionar las condiciones experimentales, producir estimaciones incorrectas de la ingestión y excreción de ciertas sustancias, y puede conducir a la cuantificación errónea de los flujos de nutrientes procesados ​​por estos organismos.

Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia para medir partículas y los flujos de nutrientes disueltos en filtradores implicar la incubación (técnicas indirectas) o la recogida simultánea de ambiente y agua exhalado (técnicas directas). Técnicas de incubación se basan en la medición de la tasa de cambio en la concentración de partículas y nutrientes disueltos en el agua se incubaron, y la estimación de las tasas de producción o la extracción en comparación con controles adecuados ^8. Sin embargo, encierra un organismo en una cámara de incubación puede alterar su feeding y el bombeo de comportamiento debido a los cambios en el régimen de flujo natural, debido a una disminución de oxígeno y / o de la concentración de la comida, o debido a la acumulación de compuestos de excreción en el ^7,9 agua de incubación (y sus referencias). Además de los efectos de confinamiento y de suministro de agua modificada, un importante sesgo de técnicas de incubación se debe a efectos de re-filtración (véase, por ejemplo ^10). Aunque algunos de estos problemas metodológicos se han superado mediante el uso de el volumen y la forma correcta de la recipiente de incubación ¹¹ o con la introducción de un sistema de campana de vidrio de recirculación in situ ^12, esta técnica a menudo subestima velocidades de eliminación y de producción. Cuantificar el metabolismo de los compuestos disueltos tales como nitrógeno orgánico disuelto (DON) y el carbono (DOC) o nutrientes inorgánicos, ha demostrado ser especialmente propensos a sesgos provocados por técnicas de incubación ^13.

A finales de los años 60 y principios de los 70, Henry Reiswig^9,14,15 pionero en la aplicación de las técnicas directas para cuantificar la eliminación de partículas por esponjas Caribe gigantes, mediante el muestreo por separado el agua inhalado y exhalado por los organismos en situ. Debido a la dificultad de aplicar la técnica de Reiswig en alimentadores de suspensión más pequeñas y en condiciones bajo el agua más desafiantes, la mayor parte de la investigación en este campo se limita a la de laboratorio (in vitro) empleando técnicas de incubación principalmente indirectos ^16. Yahel y sus colegas volver a montar Reiswig de directa técnica in situ para trabajar en condiciones de menor escala. Su método, denominado InEx ^16, se basa en un muestreo bajo el agua simultánea del agua inhalado (A) y exhalado (Ex) por organismos inalteradas. La diferente concentración de una sustancia (por ejemplo, bacterias) entre un par de muestras (InEx) proporciona una medida de la retención (o producción) de dicha sustancia por el animal. La técnica emplea tubos InEx abiertas yse basa en el chorro excurrent producido por la actividad de bombeo del organismo estudiado para reemplazar pasivamente el agua del ambiente en el tubo de recogida. Mientras Yahel y sus colegas han aplicado con éxito esta técnica en el estudio de más de 15 diferentes de suspensión alimentadores taxones (por ejemplo, ^17), el método está limitada por el alto nivel de la práctica y la experiencia requerida, por el tamaño minúsculo de unos orificios excurrentes, y por las condiciones del mar.

Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aspiración controlada de la muestra de agua a través de tubos minuto (diámetro externo <1,6 mm). Nuestro objetivo era crear un dispositivo simple, fiable y de bajo costo que permitiría limpio y controlado en el muestreo del agua situ a partir de un punto muy específico, como el orificio de excurrente filtradores bentónicos. Para ser eficaz, el método tiene que ser no intrusiva con el fin de no afectar el régimen de flujo ambiente o modificar el behavior de los organismos estudiados. El dispositivo que aquí se presenta se denomina VacuSIP. Es una simplificación del sistema SIP desarrollado por Yahel et al. (2007) ¹⁸ para el punto de muestreo basado en ROV en las profundidades del mar. El VacuSIP es considerablemente más barato que el SIP original y se ha adaptado para el trabajo a base de buceo. El sistema fue diseñado de acuerdo a los principios presentados y probados por Wright y Stephens (1978) ¹⁹ y Møhlenberg y Riisgård (1978) ²⁰ para entornos de laboratorio.

Aunque el sistema VacuSIP fue diseñado para estudios in situ del metabolismo de los alimentadores de suspensión bentónicos, también se puede utilizar para estudios de laboratorio y donde se requiere una, muestra de agua en el punto fuente controlada y limpio. El sistema es especialmente útil cuando se requiere la integración durante períodos prolongados (min-horas) o en filtraciones in situ. El VacuSIP ha sido utilizado con éxito en el laboratorio Yahel desde 2011, y tiene tambiénha empleado en dos estudios recientes de los flujos de nutrientes mediados por especies de esponjas del Caribe y el Mediterráneo ²¹ (Morganti et al. Presentado).

El uso de muestreadores específicas, la duración prolongada de muestreo, y las condiciones de campo, en el que se aplica VacuSIP, implica algunas desviaciones de los protocolos estándar oceanográficos para recoger, filtrar y almacenar muestras de analitos sensibles. Para reducir el riesgo de contaminación por el sistema VacuSIP o el riesgo de modificación de la muestra de agua por la actividad bacteriana después de la recogida, probamos varios en los procedimientos de filtración y de almacenamiento in situ. Diferentes dispositivos de filtrado, recipientes de recogida, y los procedimientos de almacenamiento se examinaron con el fin de lograr la técnica más adecuada para el análisis de inorgánico disuelto (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ y orgánica (DOC + DON) compuestos, y ultra-plancton (<1081; m) y partículas orgánicas (POC + muestreo PON). Para reducir aún más el riesgo de contaminación, especialmente en condiciones de campo, el número de etapas de manipulación se redujo al mínimo. El formato visual en el que se presenta el método está orientada para facilitar la reproducibilidad y de reducir el tiempo necesario para aplicar de manera eficiente la técnica.

Resumen del sistema

Para muestra en agua in situ bombeada desde los alimentadores de suspensión con orificios exhalantes tan pequeños como 2 mm, la actividad de bombeo de cada muestra se visualizó por primera vez por que liberan de forma filtrada fluoresceína teñido de agua de mar al lado del orificio (s) de inhalantes y observar su flujo desde la abertura excurrente ¹⁶ (ver también la Figura 2B en ^18). El agua inhalado y exhalado por la muestra de estudio (incurrente y excurrentes) son entonces muestras de forma simultánea con el uso de un par de tubos hora instalados en manipulador a la medida o en dos de los "arms "de un trípode portátil flexibles al revés (figura 1 y complementario de vídeo 1). El agua inhalado por el organismo estudio se recoge mediante el posicionamiento cuidadosamente el extremo proximal de un tubo en el interior o cerca de la abertura de inhalantes del organismo estudio. Un idéntica tubo se coloca dentro del orificio excurrent. Esta operación requiere un buen cuidado de evitar el contacto o perturbación del animal, por ejemplo, mediante resuspensión de sedimentos. para comenzar el muestreo, un buzo perfora un tabique en el recipiente de recogida con una aguja de jeringa unida a la extremo distal de cada tubo, permitiendo que la presión de agua externa para forzar el agua en la muestra en el recipiente a través del tubo de muestreo. la succión es iniciada por el vacío creado previamente en los viales y por la diferencia de presión entre el agua externa y el recipiente de muestra evacuado .

Para asegurar una colección de agua limpia exhalado y para evitar la aspiración accidental de Ambiagua ent ^16, la tasa de muestreo del agua debe mantenerse a una tasa significativamente más baja (<10%) que el caudal excurrente. La velocidad de aspiración se controla por la longitud del tubo y su diámetro interior (ID). El diámetro interno pequeño también asegura un volumen muerto insignificante (<200 l por cada metro de tubo). El muestreo durante períodos prolongados (minutos a horas) hace que sea posible la integración de la agregación inherente de la mayoría de las sustancias de interés. Para asegurarse de que las muestras se conservan adecuadamente en sesiones de toma de muestras submarinas prolongados, así como para el transporte al laboratorio, una en la filtración situ se recomienda para analitos sensibles. La selección de los vasos de muestreo, conjunto de filtración, y los tubos están dictadas por los organismos de estudio y la pregunta de investigación específica. El protocolo se describe a continuación asume que un perfil metabólico completo es de interés (para una revisión véase la Figura 2). Sin embargo, la naturaleza modular del protocolo permite fo modificación fácil para dar cabida a los planes de muestreo simples o incluso muy diferentes. Para un perfil metabólico completo, el protocolo de muestreo debe incluir los siguientes pasos: (1) la visualización de flujo; (2) El muestreo de alimentación ultra-plancton (plancton <10 micras); (3) El muestreo absorción de nutrientes inorgánicos y excreción (utilizando los filtros en línea); (4) El muestreo disuelto absorción orgánica y excreción (utilizando los filtros en línea); (5) se alimentan de partículas y la excreción (utilizando los filtros en línea); (6) Repita el paso 2 (ultra-plancton alimentación como control de calidad); (7) de flujo de visualización.

Cuando logísticamente factible, se recomienda que las mediciones de perfiles metabólicos se combinan con la velocidad de bombeo (por ejemplo, el método de velocidad frente de colorante, en ^16), así como con las mediciones de respiración. Estas mediciones se toman mejor al principio y al final de la sesión de muestreo. Para la medición de la respiración, optodes bajo el agua o micro-electrodos son preferibles.

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Protocolo

1. Los pasos preparatorios y de limpieza Procedimientos

1. Solución de limpieza
   1. Use equipo de protección, una bata de laboratorio y guantes en todo momento. Llevar a cabo estos pasos preparatorios en un espacio limpio y libre de polvo y humo.
   2. Preparar una solución de ácido clorhídrico al 5-10% (HCl) con productos frescos y de alta calidad, agua doblemente destilada.
   3. Prepare un 5% de mezcla básica altamente soluble de solución de tensioactivo aniónico y no iónico (Ver Lista de Materiales) con productos frescos y de alta calidad, agua doblemente destilada.
   4. Almacenar todas las soluciones de limpieza, lavado con ácido contenedores.
2. Pasos de preparación y procedimientos de limpieza (en el laboratorio)
   NOTA: Si los compuestos de fósforo no sean de interés, el lavado HCl puede ser reemplazado por ácido fosfórico de alta calidad (H ₃ PO ₄₎ de lavado (8% H ₃ PO ₄ concentración final).
   1. Use equipo de protección, una bata de laboratorio y guantes en todo momento.
   2. lavarel aparato de muestreo (excluido el acero inoxidable Swinney soporte del filtro en línea) con una amplia cantidad de agua de alta pureza. Deje el aparato de inmersión en una solución de HCl 5-10% durante la noche. Enjuague el aparato de nuevo con una amplia cantidad de agua destilada doble de alta calidad.
   3. Lavar los soportes de los filtros de acero inoxidable Swinney en línea con una amplia cantidad de agua de alta pureza. Deje los soportes de los filtros que empapan en 5% de mezcla básica altamente soluble de la solución de tensioactivos aniónicos y no iónicos durante la noche. Enjuague de nuevo con un amplio alta calidad del agua doblemente destilada.
   4. Seque todo el aparato de muestreo, envolverlos en papel de aluminio y guardar en una caja limpia hasta su uso.
3. Control de la tasa de succión
   1. Control de la velocidad de muestreo mediante el ajuste de la longitud y el diámetro interno de la tubería de admisión de acuerdo con la profundidad de trabajo previsto y temperatura del agua. Utilice la siguiente ecuación (derivado de la ecuación de Hagen-Poiseuille utilizado para plenamente desadesa- flujo laminar tubería) como guía: donde F = velocidad de flujo (cm ³ min ^-1),? P = presión diferencial (bar), r = entrada de la tubería radio interno (cm), K = 2.417 x 10 ^-9 (sec ^-2), L = longitud del tubo (cm ), V = viscosidad del agua (g cm ^-1 s ^-1). Véase la Tabla 1 para más detalles.
   2. Mantenga velocidad de muestreo por debajo de 1% de la velocidad de bombeo del animal estudiado.
      NOTA: El uso de recipientes evacuados, a veces con un vacío desconocido plantea complicaciones adicionales. Por lo tanto, una prueba de campo es muy recomendable. A 10 m de profundidad y ~ 22 ° C el agua de mar (40 PSU), un tubo de 50 cm de entrada con un diámetro interno de 254 micras ofrece una velocidad de aspiración promedio de ~ sec 26 l ^-1 (1,56 ml min ^-1).
4. vasos de muestreo
   1. Para las muestras de pequeño volumen (3-20 ml, por ejemplo, ultra-plancton para cyt flujogeo-) utilizan tubos de plástico estériles pre-aspiradora.
      NOTA: Pre-aspiradora tubos de plástico estériles se emplean rutinariamente para análisis de sangre estándar en los seres humanos; asegúrese de usar los tubos estériles sin aditivos. Estos tubos de plástico estériles aspiradas son mejor muestreados con el uso de soporte de tubo estéril, de un solo uso con fuera del centro Luer. Si bien este es el aparato de muestreo más segura y eficiente, que tiene un volumen muerto ligeramente más grande en comparación con una aguja simple.
   2. Para las muestras de agua más grandes, tales como nutrientes y materia orgánica disuelta, utilizar 40 o 60 ml viales de vidrio que cumplen con los criterios de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) para análisis orgánicos volátiles. Estos viales incluyen un tapón de polipropileno con un septum de silicona PTFE enfrentado.
   3. Para volúmenes más grandes, incluso, utilizar botellas de penicilina con tapones de goma o termos.
   4. Usar frascos de polietileno de alta densidad (HDPE) frascos para muestras de sílice.
   5. Para aumentar el volumen de la muestra y para reducir el riesgo de que el desprendimiento del tapóndurante el ascenso, evacuar (vacío) artículos 1.4.2-1.4.4 antes de la inmersión con una bomba de vacío. De vacío de forma manual mediante el uso de una bomba de vacío manual o incluso aspirando el aire con una jeringa. Sin embargo, para obtener mejores resultados, se recomienda una buena bomba de vacío. liofilizadores estándar proporciona alto vacío.
      NOTA: Prestar especial atención cuando se utilizan grandes frascos de la aspiradora para asegurar que la velocidad de aspiración inicial más rápida no contaminaría las muestras de agua exhalado.
5. Los procedimientos de limpieza de recipientes
   1. Para orgánicos disueltos y _NH4 ⁺ análisis, utilizar nuevos viales pre-limpiado la EPA.
   2. Enjuagar los viales (vidrio y polietileno de alta densidad) para el análisis de otros nutrientes como sigue:
      1. Enjuague los viales (vidrio y polietileno de alta densidad) y las tapas de polipropileno con agua doblemente destilada de alta calidad. Instalar un nuevo tabique de silicio.
      2. Remojar los viales de vidrio (HDPE) y en el 10% de HCl durante al menos 3 días y enjuagar con abundante agua de alta calidad bidestilada.
      3. Quemar los viales de vidrio a 450 ° C durante 4 horas y se deja enfriar en el horno. Instalar el tapón, y envolver en papel de aluminio hasta su uso.
6. filtros
   1. Utilizar filtros de fibra de vidrio libre de aglutinantes para la filtración de todas las muestras orgánicas disueltas (por ejemplo, DOC, DON) y para la recogida de la materia orgánica en partículas (por ejemplo, POC, PON). Empacar cada filtro de vidrio en un sobre de papel de aluminio por separado. Combustión a 400 ° C durante 2 horas para volatilizar los residuos orgánicos y guardar en un recipiente limpio y seco hasta su uso.
   2. Utilizar un exentos de ligante filtros de fibra de vidrio como anteriormente, o membranas de policarbonato de 0,2 micras para el muestreo de nutrientes inorgánicos (por ejemplo, PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ^+). Limpiar el último una vez instalado en el soporte del filtro tal como se explica a continuación (1.7.3).
   3. Use 0,2 micras filtros de membranas de policarbonato para la toma de muestras de sílice. Limpiarlos una vez installed en el soporte del filtro tal como se explica a continuación (1.7.3).
7. Preparación de conjunto de filtración
   1. Se filtra la mezcla básica altamente soluble de tensioactivos aniónicos y solución de agente tensioactivo no iónico y la alta calidad de agua destilada doble a través de un filtro de 0,2 micras antes de usarlos para limpiar el conjunto de filtración.
   2. conjunto de filtración por los nutrientes y orgánicos disueltos distintos de la sílice:
      1. Coloque unas quemados filtros de fibra de vidrio libre de aglutinantes en el interior del acero inoxidable de soporte del filtro limpiado en línea Swinney.
      2. Utilice una jeringa de limpiarse con ácido para correr 100 ml de 5% de mezcla básica altamente soluble de tensioactivos aniónicos y solución de agente tensioactivo no iónico y, a continuación 100 ml de agua destilada doble de alta calidad a través de todo el conjunto.
   3. Conjunto de filtración de _SiO4:
      1. Coloque el filtro de policarbonato en el interior del soporte del filtro de policarbonato limpiado (portafiltros PC).
      2. Utilice una jeringa de limpiarse con ácido para rONU 30 ml de HCl al 5% y 30 ml de agua destilada doble de alta calidad a través de todo el conjunto.
8. sistema de ensamblaje
   1. Montar el sistema para el trabajo bajo el agua usando un tubo de PEEK (poliéter-éter-cetona) con un diámetro exterior (OD) de 1,6 mm y un diámetro interno (ID) de 254 micras o 177 micras.
   2. Use un cuchillo o PEEK cortador afilado para cortar los tubos a la longitud requerida.
   3. En su extremo distal (lado de recipiente de la muestra), la medida de cada tubo con un conector Luer macho unido a una aguja de la jeringa. Asegúrese de seguir las instrucciones del fabricante y alinear la parte plana del casquillo azul sin pestañas con el extremo del tubo antes de apretar la tuerca verde.
   4. Una el tubo de PEEK al trípode "brazos" o manipulador hecha a la medida mediante el uso de una cinta aislante.
   5. Adjuntar una aguja de jeringa desechable al conector Luer macho. Mantenga la aguja con su tapa protectora para evitar lesiones.
   6. Etiquetar claramente el código de engranajes de muestreo y color todos los componentes inhalados y exhalados (por ejemplo, verde = A, rojo = Ex).
   7. Del mismo modo el código de color de los vasos de muestreo con conjuntos de vasos de toma de muestras pareadas numerada secuencialmente.

2. Submarino de Trabajo

1. La preparación del lugar de trabajo
   1. Estudio preliminar y selección de muestras
      NOTA: Debido a la naturaleza compleja del protocolo de muestreo bajo el agua, dedicando el tiempo necesario para la preparación asegurará una inmersión de muestreo eficiente.
      1. Inspeccionar el lugar de trabajo y hacer los preparativos necesarios antes de tiempo.
      2. Seleccionar y marcar los organismos objetivo adecuados que se pueden acceder con relativa facilidad. Dado que no todos los organismos pueden ser necesariamente activa en el momento de la inmersión de muestreo, preparación de más estaciones de trabajo de lo que espera a la muestra.
   2. La instalación de soportes de base
      1. when trabajando en sustrato estabilizado:
         1. Montar el clip de liberación rápida original del trípode flexible de pesos en 1 kg de buceo y simplemente colocarla al lado del animal diana.
      2. Cuando se trabaja en paredes verticales:
         1. placas de montaje en la base de apoyo para el sistema VacuSIP, ganchos para útiles accesorios, y perchas para el recipiente colector bandeja portadora durante la etapa de preparación del lugar de trabajo (2.1.1).
         2. Cuando se utilizan los trípodes portátiles flexibles, utilizar pernos o resina epoxi de dos componentes para fijar placas de 10x10 cm de PVC junto a cada animal de destino. Cada placa tiene que tener un agujero para colocar los clips de liberación rápida del trípode portátil flexible.
         3. Una vez que la resina ha curado y las placas de base se encuentra rígidamente montada a la pared, el tornillo en los clips de liberación rápida, que sirve como un punto de fijación firme para el trípode portátil flexible para el sistema VacuSIP.
2. Instalación del VaCusip
   1. Compruebe si la muestra está bombeando por la liberación de fluoresceína filtrada al lado del orificio de inhalantes y confirme que el colorante está emergiendo a través del orificio exhalaciones como se describe en Yahel et al. (2005) ^16.
   2. Instalar el dispositivo VacuSIP y colocar el tubo de inhalantes (EN) de muestreo dentro del orificio de inhalantes o simplemente al lado de él (a menos de ~ 5 mm). Asegúrese de que el tubo de inhalantes no está en la proximidad de otro orificio exhalante.
   3. Dirigir con cuidado el tubo de muestreo exhalante (EX) hacia el sifón osculum / exhalante e inserte muy suavemente hacia adentro, hasta que se posicione 1-5 mm en el interior del osculum / sifón exhalante (ver Figura 1 y complementario de vídeo 1). Tenga mucho cuidado de no hacer contacto con o de alguna otra manera el organismo muestreada.
   4. Antes y durante la toma de muestras a comprobar la ubicación de ambos tubos.
   5. Después de la comprobación de muestreo si la muestra está todavía bombeando como described anteriormente (2.2.1).
      NOTA: Debido a que el movimiento de un brazo del trípode cuando la manipulación de la otra podría ocurrir, asegúrese de colocar en primer lugar el tubo de muestreo de inhalantes y en segundo lugar el tubo exhalante, lo que requiere una manipulación más precisa. Después de esta orden, incluso si la manipulación del tubo de muestreo exhalante puede hacer que el movimiento del tubo de inhalantes, que no afectará a la toma de muestras.
3. Procedimiento de muestreo bajo el agua modular
   NOTA: A la espera de la pregunta de investigación, cada una de las etapas experimentales siguientes se puede realizar como un experimento independiente. El protocolo de muestreo perfil metabólico completo que se describe a continuación es un proceso largo, que requiere hasta 8 horas por espécimen (para una revisión véase la Figura 2 y Tabla 2). Como las condiciones y regulaciones de buceo difieren entre los sitios de muestreo, las regiones y las instituciones, los planes de buceo no están incluidos en este protocolo. Sin embargo, dedicar un cuidado extremo y meticulous la planificación del plan de buceo. Prestar especial atención para evitar la saturación y el yoyo perfiles de inmersión. Cuando sea posible, es aconsejable llevar a cabo estos experimentos a poca profundidad (<10 m). respiradores de circuito cerrado puede ser muy útil para este tipo de sistemas de muestreo prolongados.
   1. Antes de que comience el muestreo real, asegúrese de que no hay rastros visibles de residuos de fluoresceína se mantienen y que los sedimentos en suspensión se han resuelto o han wafted de distancia.
      
   2. Ultra-plancton, (sin filtro se instala en este paso!)
      1. Utilice la aguja para perforar la (inhalada) y EX (exhalado) aspiraron tubos de plástico estéril septos. Compruebe que el agua gotea en al ritmo previsto y recoger muestras de agua de 2-6 ml.
      2. En la recuperación, mantener las muestras en una caja fría en hielo. En el laboratorio, preservar con 1% de paraformaldehído + 0,05% de glutaraldehído grado EM (concentración final), o 0,2% de glutaraldehído grado EM. Congelar crioviales en nitrógeno líquido y se almacena a -80 y# 176; C hasta su análisis.
   3. Muestreo de silicato y almacenamiento
      1. Instalar el soporte del filtro PC acero pre-limpiado en línea que contiene una membrana de policarbonato de 0,2 micras entre la aguja y el conector Luer macho en el extremo distal del tubo.
      2. Perforar la tapa del tabique de los viales de polietileno de alta densidad pre-limpiado (frascos de HDPE) para iniciar el muestreo. Compruebe que los dos muestreadores están goteando y recoger 15 ml de agua en cada vial.
      3. Mantener las muestras refrigeradas (4 ° C) hasta su análisis. Si el análisis no puede comenzar dentro de dos semanas, almacenar a -20 ° C. Para el análisis, asegúrese de que las muestras se descongelan a 50 ° C durante al menos 50 minutos para disolver los geles de sílice.
         NOTA: La membrana se puede conservar para microscopía o análisis de ADN según sea necesario.
   4. Inorgánicos disueltos (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ⁺⁾
      1. reemplazar tél conjunto de filtro de PC con un soporte de filtro de acero inoxidable en línea previamente limpiadas que contiene un filtro de vidrio pre-combustión.
      2. Antes del muestreo, aseguran que se pasaron al menos 20 ml de muestras de agua marina a través de todo el sistema de filtración mediante el uso de EPA, viales de polietileno de alta densidad u otro recipiente de vacío para iniciar la succión. Medir el volumen del agua recogida antes de que se descartan.
      3. Perforar la tapa del tabique de los viales de vidrio apropiadas para iniciar el muestreo de la EPA, compruebe que ambas muestras están goteando, y recoger 25-30 ml de nitrato y fosfato de análisis.
      4. Cambiar a nuevos viales de vidrio de la EPA para el análisis de amoniaco, compruebe que ambas muestras están goteando, y recogen 20 ml en cada vial.
      5. Mantener las muestras en una caja fría en hielo y se almacena a -20 ° C hasta el análisis.
         NOTA: Si sólo el filtrado es de interés, filtros de jeringa desechables se pueden utilizar para los pasos 2.3.3 y 2.3.4.
   5. Compuestos orgánicos disueltos de muestreo y ST (DOC + DON)oring
      NOTA: Mantenga las muestras lo más vertical posible durante todo el manejo de modo que el agua de la muestra no entre en contacto con los tabiques de silicio.
      1. Siga utilizando el conjunto de filtro de acero inoxidable y recoger 20 ml de las muestras de agua de mar en nuevos viales de vidrio de la EPA, como se describe anteriormente.
      2. En la recuperación, mantener las muestras en una caja fría en hielo. En el laboratorio, utilizar una pipeta Pasteur de vidrio pre-combustión para fijar las muestras con ácido ortofosfórico (añadir 5-6 gotas de ácido de calidad de metales traza 25% en una muestra de 20 ml, concentración final 0,04%) o ácido clorhídrico (añadir 2 gotas de metales traza de grado ácido concentrado en una muestra de 20 ml, concentración final 0,1%) y mantener refrigerado.
      3. Mantener las muestras refrigeradas (4 ° C) hasta su análisis. Si las muestras no se analizan dentro de una semana de la recogida, se almacena a -20 ° C hasta el análisis.
   6. Materia orgánica particulada (POC, PON, POP)
      1. Seguir utilizando el stainless conjunto de filtro y el filtro de acero al menos 500 ml de agua de mar en un frasco de vacío 250 ml evacuado. Vuelva a colocar los frascos si es necesario.
      2. En la recuperación, utilizar una jeringa llena de aire para evacuar toda el agua de mar remanente del soporte del filtro, envolver en papel de aluminio y guardar en una caja fría en hielo. En el laboratorio, extraer los filtros de los portafiltros y almacenar a -20 ° C hasta el análisis.

Figura 1. Un ejemplo de instalaciones correctas del VacuSIP: (a) el muestreo de la ascidia Polycarpa mytiligera (Golfo de Aqaba, Mar Rojo) usando un manipulador hecha a la medida con el código de color que se utiliza para el verde y amarillo para inhalado muestras de agua exhalado (foto por Tom Shelizenger y Yuval Yacobi); (B) el muestreo de las oroides esponja Agelas (Mediterráneo noroccidentalMar) con una anchura de 3 mm osculum, utilizando el dispositivo VacuSIP. El código de color utilizado es de color amarillo para inhalado y rojo para las muestras de agua exhalado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Descripción de la técnica VacuSIP se describe en la sección de protocolo. El trabajo de laboratorio está representado en cuadros de color amarillo, el trabajo de campo en cajas azules. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Las frecuencias de muestreo promedio generales (ml ^min-1) obtenidos con diferentes contenedoresutilizados para los depósitos de agua y diferentes niveles de vacío: los frascos no aspiraron (ninguno); viales de vidrio y frascos de HDPE EPA aspiraron la mitad de su volumen (½ volumen); tubos de plástico estériles ya aspiraron por el fabricante. Trabajando a 5-8 m de profundidad, temperatura del agua de 18-22 ° C, utilizando tubos de PEEK de 79 cm de longitud y de 25 m de diámetro interno.

Tabla 2. Resumen de la recipiente de muestreo, el conjunto de filtro de fijador, en línea, el almacenamiento y los métodos de análisis descritos en la sección de protocolo. Los compuestos analizados son: la abundancia de plancton ultra-(plancton <10 micras), silicato _(SiO4), fosfato (PO ₄ ^3-), nitritos + nitratos (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-), materia orgánica disuelta (DOM), amonio _(NH4 ⁺⁾ y materia orgánica particulada(POM). Todos los vasos de muestreo tienen tapa de septo de silicio y se aspiran antes del muestreo. Los fijadores son: paraformaldehído + glutaraldehído (GLUT + Parafor), ácido fosfórico (H ₃ PO ₄₎ y ácido clorhídrico (HCl). Los conjuntos de filtros en línea utilizados son: soportes de los filtros de policarbonato y policarbonato membrana de 0,2 micras filtros (filtro de membrana de soporte de PC + PC) y los soportes de filtro de acero inoxidable y fibra de vidrio sin aglutinante Filtros de GFF.

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Resultados

La optimización de los métodos de recolección de agua de mar

Selección de los viales de colección y procedimiento de limpieza

recipientes colectores compatibles con VacuSIP deben tener un tabique que permite el muestreo a ser iniciado por la perforación con una aguja de la jeringa. Deben soportar la presión bajo el a...

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Discusión

pasos preparatorios

Viales de colección para DOM y análisis de nutrientes

Desde vasos colectores pueden interactuar con el micro-constituyentes disueltos y las paredes de toma de muestras puede ser un sustrato para las bacterias de crecimiento ^30-34, se ensayaron diferentes viales para DOM y recogida de nutrientes. Borosilicato no se recomienda para la cuantificación de sílice ^33,35, desde botel...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (254 µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13 mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution	Decon Labs	1002	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100 g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2 ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500 g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump