VacuSIP, um método melhorado para Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

Resumo

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Resumo

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introdução

Alimentadores de suspensão bentônicos desempenham um papel essencial no funcionamento dos ecossistemas marinhos ^1. Ao filtrar grandes volumes de água ^2,3, eles removem e excretar partículas (plâncton e detritos) e compostos dissolvidos ¹ (e referências) e são um importante agente de acoplamento de ^4,5 bentônica-pelágica e ciclagem de nutrientes ^6,7. Com precisão medir a partículas e compostos dissolvidos removidos e excretados pelos alimentadores de suspensão bentônicas (como esponjas, ascídias, poliquetas, e bivalves) é fundamental para compreender a sua fisiologia, metabolismo e ecologia alimentar. Juntamente com bombeamento medições da taxa, ele também permite a quantificação dos fluxos de nutrientes mediadas por estes organismos e seu impacto ecológico na qualidade da água, bem como em processos de escala do ecossistema.

Escolhendo o método adequado para medir as taxas de remoção e produção de partículas e com dissolvidalibras por filtradores de suspensão é fundamental para a obtenção de dados fiáveis ​​sobre a sua atividade alimentar ^8. Como apontado por Riisgård e outros, inadequadas metodologias viés resultados, distorcer as condições experimentais, produzir estimativas incorretas de ingestão e excreção de certas substâncias, e pode levar à quantificação errônea dos fluxos de nutrientes processados ​​por esses organismos.

Os dois métodos mais utilizados para medir partículas e fluxos de nutrientes dissolvidos em alimentadores do filtro envolver a incubação (técnicas indiretas) ou cobrança simultânea de ambiente e água expirado (técnicas diretas). Incubação técnicas baseiam-se na medição da taxa de alteração da concentração de partículas e nutrientes dissolvidos na água incubadas, e estimar as taxas de produção ou remoção comparação com os controlos adequados ^8. No entanto, encerrando um organismo em uma câmara de incubação pode alterar a sua feeding e comportamento de bombagem devido a alterações no regime de fluxo natural, devido a uma diminuição em oxigénio e / ou na concentração de alimentos, ou devido à acumulação de compostos excreção na água de incubação ^7,9 (e suas referências). Em adição aos efeitos de confinamento e de abastecimento de água modificado, uma grande tendência de técnicas de incubação decorre de efeitos de re-filtração (ver por exemplo ^10). Embora alguns destes problemas metodológicos foram superadas, utilizando o volume direito e forma do recipiente de incubação ¹¹ ou com a introdução de um sistema de redoma de recirculação ¹² in situ, esta técnica muitas vezes subestima taxas de remoção e de produção. A quantificação do metabolismo de compostos dissolvidos tais como o azoto orgânico dissolvido (DON) e o carbono (DOC) ou nutrientes inorgânicos, tem provado ser especialmente propensos a erros causados ​​por técnicas de incubação ^13.

No final dos anos 60 e início dos anos 70, Henry Reiswig^9,14,15 foi pioneira na aplicação de técnicas diretas para quantificar remoção de partículas por esponjas Caribe gigantes, por amostragem separadamente a água inspirado e expirado pelos organismos in situ. Devido à dificuldade de aplicar a técnica de Reiswig em alimentadores de suspensão menores e em condições submarinas mais desafiadoras, a maior parte da investigação neste campo foi restrito ao laboratório (in vitro) empregando principalmente técnicas de incubação indiretos ^16. Yahel e colegas reaparelhado Reiswig do direta técnica in situ a trabalhar em condições de menor escala. Seu método, denominado Inex ^16, é baseado em amostragem subaquática simultânea da água inalado (In) e expirado (Ex) por organismos não perturbadas. A concentração diferente de uma substância (por exemplo, bactérias) entre um par de amostras (iNEX) proporciona uma medida da retenção (ou produção) de substância que pelo animal. A técnica Inex emprega tubos abertas ebaseia-se no jacto excurrente produzido pela actividade de bombeamento do organismo estudado para substituir passivamente a água ambiente no tubo de recolha. Enquanto Yahel e colegas aplicaram com sucesso esta técnica no estudo de mais de 15 suspensão alimentadores diferentes taxa (por exemplo, ^17), o método é limitado pelo alto nível de prática e experiência necessários, pelo tamanho minúsculo de alguns orifícios excurrentes, e por condições do mar.

Para superar esses obstáculos, desenvolvemos uma técnica alternativa baseada na sucção controlada da água amostrada através de tubos hora (diâmetro externo <1,6 mm). Nosso objetivo era criar um dispositivo simples, confiável e de baixo custo que permitiria limpo e controlado de amostragem de água situ a partir de um ponto muito específico, como o orifício excurrent de alimentadores de suspensão bentônicos. Para ser eficaz, o método tem de ser não-intrusivo, de modo a não afectar o regime de fluxo ambiente ou modificar o behavior dos organismos estudados. O dispositivo apresentado aqui é denominado VacuSIP. É uma simplificação do sistema desenvolvido pelo SIP Yahel et ai. (2007) ¹⁸ para amostragem por pontos baseado em ROV no fundo do mar. O VacuSIP é consideravelmente mais barato do que a SIP original e foi adaptado para o trabalho baseado em mergulho. O sistema foi projetado de acordo com os princípios apresentados e testados por Wright e Stephens (1978) ¹⁹ e Møhlenberg e Riisgård (1978) ²⁰ para ambientes de laboratório.

Embora o sistema VacuSIP foi concebido para estudos in situ do metabolismo dos alimentadores de suspensão bentônicos, ele também pode ser usado para os estudos de laboratório e onde é necessária, uma amostra de água de ponto fonte controlada e limpo. O sistema é especialmente útil quando a integração ao longo de períodos prolongados (mínimo de-horas) ou em filtrações in situ são obrigatórios. O VacuSIP tem sido utilizado com sucesso no laboratório Yahel desde 2011, e tem tambémsido empregado em dois estudos recentes de fluxos de nutrientes mediadas por espécies de esponjas das Caraíbas e Mediterrâneo ²¹ (Morganti et al. apresentado).

O uso de samplers específicas, a duração de amostragem prolongada, e as condições de campo, em que VacuSIP é aplicado, implicará alguns desvios protocolos oceanográficos padrão para coletar, filtrar, analisar e armazenar amostras de analitos sensíveis. Para reduzir o risco de contaminação pelo sistema VacuSIP ou o risco de modificação da água amostrada por actividade bacteriana após a recolha, foi testada em vários procedimentos de filtração e de armazenamento in situ. Diferentes dispositivos de filtragem, recipientes de recolha, armazenamento e procedimentos foram examinados a fim de alcançar a técnica mais adequada para a análise de dissolvido inorgânico (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ e orgânico (DOC + DON) compostos e ultra-plâncton (<1081; m) e partículas orgânicas (POC + PON amostragem). Para reduzir ainda mais o risco de contaminação, especialmente em condições de campo, o número de passos de manipulação foi reduzida ao mínimo. O formato visual no qual o método é apresentado é orientada para facilitar a reprodutibilidade e a reduzir o tempo necessário para aplicar a técnica de forma eficiente.

Visão geral do sistema

Para obter a amostra em água in situ bombeada de alimentadores de suspensão com orifícios exhalant tão pequenas quanto 2 mm, a actividade de bombagem de cada espécime é primeiramente visualizada através da libertação filtrada fluoresceína tingido água do mar junto ao orifício de inalação (s) e observando-se o seu fluxo a partir da abertura excurrente ¹⁶ (ver também a Figura 2B em ^18). A água inspirado e expirado pelo espécimen do estudo (incurrent e excurrentes) são então amostrados simultaneamente com a utilização de um par de tubos instalados na hora manipulador-construído sob encomenda ou em dois dos "ARMS "de um tripé portátil flexível de cabeça para baixo (Figura 1 e suplementares Vídeo 1). A água inalado pelo organismo estudo é recolhido por posicionando cuidadosamente a extremidade proximal de um tubo no interior ou perto da abertura de inalação do organismo estudo. Um idêntico tubo é então posicionado no interior do orifício excurrente. Esta operação requer o cuidado de evitar o contacto ou perturbação do animal, por exemplo, por ressuspensão do sedimento. para iniciar a amostragem, um mergulhador perfura um septo no recipiente de recolha com uma agulha de seringa ligado à extremidade distal de cada tubo, permitindo que a pressão de água externa para forçar a água amostrada para dentro do recipiente através do tubo de amostragem. a sucção é iniciada pelo vácuo criado previamente nos frascos e pela diferença de pressão entre a água externa e o recipiente da amostra evacuada .

Para garantir uma coleção de água limpa exalado e evitar aspiração acidental de ambiágua ent ^16, a taxa de amostragem da água deve ser mantida a uma taxa significativamente mais baixa (<10%) do que a taxa de fluxo excurrent. A taxa de sucção é controlada pelo comprimento do tubo e o seu diâmetro interno (ID). O diâmetro interno pequeno também garante um volume morto insignificante (<200 ul por metro de tubo). Recolha de amostras durante períodos prolongados (minutos a horas) faz com que seja possível integrar o patchiness inerente da maioria das substâncias de interesse. Para garantir que as amostras sejam adequadamente preservadas em sessões de amostragem subaquáticas prolongadas, bem como para o transporte para o laboratório, uma filtração em situ é recomendado para analitos sensíveis. A seleção dos vasos de amostragem, montagem de filtração, e tubos são ditadas pelos organismos de estudo e a questão de pesquisa específica. O protocolo descrito abaixo assume que um perfil metabólico completo é de interesse (para um resumo ver Figura 2). No entanto, a natureza modular do protocolo permite Fou modificação fácil para acomodar esquemas de amostragem simples ou até mesmo muito diferentes. Para um perfil metabólico completo, o protocolo de amostragem deve incluir os seguintes passos: (1) A visualização de fluxo; (2) alimentação amostragem ultra-plâncton (plâncton <10 mm); (3) A amostragem absorção de nutrientes inorgânicos e excreção (usando filtros em linha); (4) Amostra dissolvida absorção orgânica e excreção (usando filtros em linha); (5) a alimentação de partículas e excreção (usando filtros em linha); (6) Repita o passo 2 (alimentação ultra-plâncton como verificação de qualidade); (7) O fluxo de visualização.

Quando logisticamente viável, recomenda-se que as medições de perfil metabólicas são combinados com a taxa de bombeamento (por exemplo, o método a velocidade da frente de corante, em ^16), bem como com as medições de respiração. Estas medições são as melhores tomadas no início e no final da sessão de amostragem. Para a medição da respiração, optodes subaquáticas ou micro-eletrodos são preferíveis.

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Protocolo

1. Passos de preparação e limpeza Procedimentos

1. Solução de limpeza
   1. Usar equipamento de proteção, um jaleco e luvas em todos os momentos. Realizar estas etapas preparatórias em um espaço limpo livre de poeira e fumaça.
   2. Preparar uma solução clorídrico 5-10% de ácido (HCl) com frescos, de alta qualidade, água bidestilada.
   3. Prepare a 5% de mistura de base altamente solúvel da solução de surfactante aniónico e não iónico (Veja Lista de Materiais) com frescos, de alta qualidade, água bidestilada.
   4. Armazenar todas as soluções em limpo, lavado com ácido recipientes.
2. Etapas preparatórias e procedimentos de limpeza (no laboratório)
   NOTA: Se os compostos de fósforo não são de interesse, a lavagem de HCl pode ser substituído pelo ácido fosfórico alta qualidade (H ₃ PO ₄₎ lavagem (8% de H ₃ PO ₄ a concentração final).
   1. Usar equipamento de proteção, um jaleco e luvas em todos os momentos.
   2. lavaro aparelho de amostragem (excluindo de aço inoxidável porta-filtro in-line Swinney) com uma ampla quantidade de água de alta pureza. Deixar o aparelho de imersão em solução de HCl a 5-10% durante a noite. Lavar o aparelho novamente com uma ampla quantidade de alta qualidade de água bidestilada.
   3. Lave os aço inoxidável porta-filtros Swinney em linha com uma ampla quantidade de água de alta pureza. Deixar os porta-filtros de imersão em 5% mistura básica altamente solúvel da solução de tensoativos aniônicos e não iônicos durante a noite. Lave-os novamente com amplo alta qualidade de água bidestilada.
   4. Secar todo o aparato de amostragem, envolvê-los em papel alumínio e manter em uma caixa limpa até à sua utilização.
3. Controle de taxa de sucção
   1. Controlar a taxa de amostragem, ajustando o comprimento e o diâmetro interno do tubo de entrada de acordo com a profundidade de trabalho planeado e temperatura da água. Utilizar a seguinte equação (derivado a partir da equação de Hagen-Poiseuille usado para totalmente desenfluxo laminar tubo de desen-) como um guia: em que F = caudal (cm ³ min ^-1), AP = Pressão diferencial (bar), r = raio interno da tubagem de entrada (cm), K = 2,417 x 10 ^-9 (seg ^-2), L = comprimento do tubo (cm ), v = viscosidade da água (g ^{cm-1 seg-1).} Ver Tabela 1 para obter mais detalhes.
   2. Manter a taxa de amostragem inferior a 1% do caudal de bombagem do animal estudado.
      NOTA: Usando recipientes evacuados, às vezes com vácuo desconhecida coloca complicações adicionais. Portanto, um teste de campo é altamente recomendado. Aos 10 m de profundidade e 22 ° C, a água do mar ~ (40 PSU), um tubo de entrada de 50 cm com um diâmetro interno de 254 uM proporciona uma taxa média de sucção de ~ 26 seg ^-1 ul (1,56 mL min ^-1).
4. vasos de amostragem
   1. Para amostras de pequeno volume (3-20 ml, por exemplo, ultra-plâncton para cit fluxoometry) usam tubos de plástico pré-aspirado estéreis.
      NOTA: Pré-aspirado tubos de plástico estéril, que são rotineiramente utilizados para exames de sangue padrão em seres humanos; certifique-se de usar os tubos estéreis, sem aditivos. Estes tubos plásticos estéreis aspirados são mais bem amostrado com o uso do suporte tubo estéril, de uso único com off-center Luer. Embora este seja o aparelho de amostragem mais segura e mais eficiente, que tem um volume morto ligeiramente maior em comparação com uma agulha simples.
   2. Para amostras de água maiores, como nutrientes e matéria orgânica dissolvida, use 40 ou 60 ml frascos de vidro que atendem aos critérios Environmental Protection Agency (EPA) para análises orgânicos voláteis. Estes frascos incluem uma tampa de polipropileno com um septo de silicone com cara de PTFE.
   3. Para volumes ainda maiores, usar garrafas de penicilina com tampas de borracha ou garrafas térmicas.
   4. Use frascos de polietileno de alta densidade (HDPE) frascos para amostras de sílica.
   5. Para aumentar o volume da amostra e para reduzir o risco de desalojar o bujãodurante a subida, evacuar itens (vácuo) 1.4.2-1.4.4 antes do mergulho com uma bomba de vácuo. Vácuo manualmente, utilizando uma bomba de vácuo ou até mesmo lado sugando o ar com uma seringa. No entanto, para obter os melhores resultados, uma boa bomba de vácuo é recomendada. liofilizadores padrão fornece alto vácuo.
      NOTA: Preste atenção especial ao usar grandes frascos aspirado para garantir que a taxa de sucção mais rápido inicial não iria contaminar as amostras de água exalados.
5. Procedimentos de limpeza navio
   1. Para orgânicos dissolvidos e NH ₄ ⁺ análise, utilizar novos frascos pré-limpas EPA.
   2. Lavar os frascos (vidro e PEAD) para a análise de outros nutrientes como segue:
      1. Lavar os frascos (vidro e PEAD) e as tampas de polipropileno com alta qualidade de água bidestilada. Instale um novo septo de silicone.
      2. Mergulhe os frascos (em vidro e PEAD) em 10% dos HCl por pelo menos 3 dias e enxaguar com amplo alta qualidade da água bidestilada.
      3. Combust os frascos de vidro a 450 ° C durante 4 horas e deixa-se arrefecer no forno. Instale a tampa e embrulhe em papel alumínio até o uso.
6. filtros
   1. Use filtros de fibra de vidro sem pasta para a filtragem de todas as amostras orgânicas dissolvidas (por exemplo, DOC, DON) e para a recolha de orgânicos particulados (eg, POC, PON). Embale cada filtro de vidro em um envelope de papel alumínio separado. Combustão a 400 ° C durante 2 horas para volatilizar resíduos orgânicos e armazenar em um recipiente limpo e seco até a sua utilização.
   2. Use um filtro de fibra de vidro sem aglutinantes como acima, ou membranas de policarbonato de 0,2 um para amostragem nutrientes inorgânicos (por exemplo, PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+). Limpar o último, uma vez instalado no suporte do filtro, como explicado abaixo (1.7.3).
   3. Use 0,2 mm filtros membranas de policarbonato para a amostragem de sílica. Limpá-los uma vez installed no suporte do filtro, como explicado abaixo (1.7.3).
7. Preparação de conjunto de filtração
   1. Filtra-se a mistura de base altamente solúvel aniónico e de solução de agente tensioactivo não iónico e a água bidestilada alta qualidade através de um filtro de 0,2 um antes de os usar para limpar o conjunto de filtração.
   2. conjunto de filtração de nutrientes e outros que a sílica orgânicos dissolvidos:
      1. Coloque um queimados filtros de fibra de vidro sem pasta no interior de aço inoxidável porta-filtro limpo em linha Swinney.
      2. Usar uma seringa limpa-ácido para executar 100 ml de 5% de mistura de base altamente solúvel aniónico e de solução de agente tensioactivo não iónico e, em seguida, 100 ml de alta qualidade da água destilada duas vezes através de todo o conjunto.
   3. Conjunto de filtração para SiO _4:
      1. Coloque o filtro de policarbonato dentro do porta-filtro de policarbonato a limpas (porta-filtro PC).
      2. Use uma seringa limpa-ácido para run 30 ml de HCl 5% e 30 ml de água de alta qualidade destilada duas vezes através de todo o conjunto.
8. montagem do sistema
   1. Montar o sistema para o trabalho debaixo de água utilizando tubagem de PEEK (poliéter éter cetona) com um diâmetro externo (OD) de 1,6 mm e um diâmetro interno (ID) de 254 uM ou 177 uM.
   2. Com uma faca ou PEEK cortador afiada para cortar os tubos para o comprimento requerido.
   3. Na sua extremidade distai (lado do recipiente da amostra), encaixam cada tubo com um conector Luer macho ligado a uma agulha de seringa. Certifique-se de que você siga as instruções do fabricante e alinhe o lado liso azul ferrolho flange com a extremidade do tubo antes de apertar a porca verde.
   4. Conecte o tubo PEEK ao tripé "braços" ou manipulador custom-built, utilizando uma fita isolante.
   5. Anexar uma agulha de seringa descartável ao conector Luer macho. Mantenha a agulha com a tampa de protecção para evitar ferimentos.
   6. Claramente rotular o código da arte de amostragem e cor todos os componentes inalados e exalados (por exemplo, verde = In, vermelho = Ex).
   7. Da mesma forma código de cor os vasos de amostragem com conjuntos de vasos de amostragem emparelhados numeradas sequencialmente.

2. Underwater Trabalho

1. A preparação do local de trabalho
   1. Levantamento preliminar e seleção de espécimes
      Nota: Devido à natureza complexa do protocolo de amostragem subaquática, dedicando o tempo necessário para a preparação irá garantir um mergulho de amostragem eficiente.
      1. O levantamento do local de trabalho e fazer os preparativos necessários antes do tempo.
      2. Selecionar e marcar organismos visados ​​adequados que podem ser acessados ​​de forma relativamente fácil. Como nem todos os organismos podem necessariamente ser ativo no momento do mergulho de amostragem, prepare mais postos de trabalho do que o esperado para amostra.
   2. A instalação de suportes de base
      1. wheN trabalhando no substrato nivelado:
         1. Montar o clipe de liberação rápida original do tripé flexível em 1 pesos kg de mergulho e simplesmente posicioná-lo próximo ao animal-alvo.
      2. Ao trabalhar em paredes verticais:
         1. Montagem de placas de suporte de base para o sistema VacuSIP, ganchos para engrenagem acessório, e cabides para o recipiente de recolha levando a bandeja durante a fase de local de trabalho de preparação (2.1.1).
         2. Quando são usados ​​tripés portáteis flexíveis, utilize parafusos ou resina epóxi bi-componente para fixar placas de 10x10 cm de PVC ao lado de cada animal-alvo. Cada placa tem de ter um buraco para anexar os clipes de liberação rápida do tripé portátil flexível.
         3. Uma vez que a resina curada e as placas de base estão solidamente fixado à parede, o parafuso nos clipes de libertação rápida, que serve como um ponto de fixação firme para o tripé flexível portátil para o sistema VacuSIP.
2. Instalando o VaCUSIP
   1. Verificar se o espécime é de bombagem através da libertação de corante de fluoresceína filtrado ao lado do orifício de inalação e confirmar que o corante está a emergir através do orifício exhalent como descrito no Yahel et al. (2005) ^16.
   2. Instalar o dispositivo VacuSIP e colocar o tubo de inalantes (IN) amostragem dentro do orifício de inalação ou simplesmente ao lado dele (dentro de ~ 5 mm). Certifique-se de que o tubo de inalação não está na proximidade de um outro orifício exhalant.
   3. Cuidadosamente dirigir o tubo de amostragem exhalant (EX) para o osculum / sifão exhalant e muito gentilmente insira-o, até que ele seja posicionado 1-5 mm dentro do osculum / sifão exhalant (ver Figura 1 e Suplementar Video 1). Tome muito cuidado para não fazer contato com ou interrompa o organismo amostrados.
   4. Antes e durante a amostragem verifique a localização de ambos os tubos.
   5. Após a verificação de amostragem se o espécime ainda está bombeando como descrita acima (2.2.1).
      Observação: Como o movimento de um braço do tripé ao manipular o outro pode ocorrer, certifique-se de colocar em primeiro lugar o tubo de amostragem inalantes e em segundo lugar o tubo exhalant, o que exige a manipulação mais precisa. Seguindo esta ordem, mesmo se a manipulação do tubo de amostragem exhalant pode fazer com que o movimento do tubo de inalação, que não afectará a amostragem.
3. Procedimento de amostragem subaquática Modular
   NOTA: Na pendência na questão de pesquisa, cada uma das etapas experimentais abaixo podem ser realizados como uma experiência stand-alone. O protocolo de amostragem perfil metabólico completo descrito abaixo é um processo demorado, exigindo até 8 horas por amostra (para uma visão geral veja a Figura 2 e Tabela 2). Como as condições e regulamentos de mergulho diferentes entre locais de amostragem, regiões e instituições, planos de mergulho não estão incluídos neste protocolo. No entanto, dedicar um cuidado extremo e metiplanejamento culous para o plano de mergulho. Preste especial atenção para evitar saturação e yoyo perfis de mergulho. Quando possível, é conveniente realizar estas experiências a pouca profundidade (<10 m). rebreathers de circuito fechado pode ser muito útil para tais esquemas de amostragem prolongados.
   1. Antes de amostragem real começa, certifique-se há traços visíveis de resíduo de fluoresceína permanecem e que sedimentos em suspensão foram resolvidos ou têm flutuou para longe.
      
   2. Ultra-plâncton, (sem filtro é instalado nesta etapa!)
      1. Use a agulha para perfurar a IN (inalada) e EX (exalado) aspirado tubos de plástico estéril septos. Verifique se a água está pingando na à taxa planejada e recolher amostras 2-6 ml de água.
      2. Em recuperação, manter as amostras em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, preservar com paraformaldeído a 1% + 0,05% de glutaraldeído grau EM (concentração final), ou 0,2% de glutaraldeído grau EM. Congelar criotubos em azoto líquido e armazenar a -80 &# 176; C até à análise.
   3. Silicato de amostragem e armazenamento
      1. Instalar o suporte de filtro de PC pré-limpos em-linha de aço inoxidável contendo uma membrana de policarbonato de 0,2 um entre a agulha e o conector Luer macho na extremidade distai do tubo.
      2. Pierce a tampa de septo de os frascos de polietileno de alta densidade pré-limpeza (frascos de HDPE) para iniciar a amostragem. Verificar se ambos os amostradores são gotejamento e recolher 15 ml de água em cada frasco.
      3. Manter as amostras refrigerado (4 ° C) até à análise. Se a análise não pode começar dentro de duas semanas, armazenar a -20 ° C. Para a análise, certifique-se de que as amostras são descongeladas a 50 ° C durante pelo menos 50 min para dissolver o gel de sílica.
         NOTA: A membrana pode ser preservado por microscopia ou análise de DNA, conforme necessário.
   4. Inorgânicos dissolvidos (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ⁺⁾
      1. Substitua tele conjunto de filtro PC com um suporte de filtro pré-limpos em-linha de aço inoxidável, que contém um filtro de vidro pré-combustão.
      2. Antes da amostragem, assegurar que, pelo menos, 20 ml de amostras de água do mar foram passados ​​através de todo o sistema de filtração através da utilização de EPA, frascos de polietileno de alta densidade ou outro recipiente de vácuo a iniciar a sucção. Medir o volume da água recolhida antes de serem descartados.
      3. Pierce a tampa de septo dos frascos de vidro da EPA apropriadas para iniciar a amostragem, verifique se ambos os samplers estão pingando, e recolher 25-30 ml de nitrato e fosfato análise.
      4. Mudar para novos frascos de vidro EPA para análise de amônia, verifique se ambos os samplers estão pingando, e recolher 20 ml em cada frasco.
      5. Manter as amostras em um quadro de frio em gelo e armazenar a -20 ° C até a análise.
         NOTA: Se apenas o filtrado é de interesse, filtros de seringa descartáveis ​​pode ser usado para passos 2.3.3 e 2.3.4.
   5. Orgânicos dissolvidos amostragem e st (DOC + DON)o anel
      NOTA: Mantenha as amostras o mais vertical possível em toda a manipulação de modo que a água amostra não entram em contato com os septos de silicone.
      1. Continue a utilizar o conjunto de filtro de aço inoxidável e recolher 20 ml de amostras de água do mar em novos frascos de vidro de EPA, tal como descrito acima.
      2. Após a recuperação, manter as amostras em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro pré-combustão para fixar as amostras com ácido ortofosfórico (adicionar 5-6 gotas de ácido de grau de vestígios metálicos em 25% a 20 ml da amostra, concentração final 0,04%) ou ácido clorídrico (2 gotas adicionar de metais traço grau concentrada em ácido de uma amostra de 20 ml, concentração final 0,1%) e manter refrigerado.
      3. Manter as amostras refrigerado (4 ° C) até à análise. Se as amostras não são analisadas dentro de uma semana de recolha, armazenar a -20 ° C até a análise.
   6. Partículas de matéria orgânica (POC, PON, POP)
      1. Continue usando o stainless conjunto de filtro de aço e filtro de pelo menos 500 ml de água do mar em um balão de 250 ml de vácuo evacuados. Substitua frascos, se necessário.
      2. Em recuperação, use uma seringa cheia de ar para evacuar toda a água do mar restante do suporte do filtro, envolvê-la em papel de alumínio e guarde em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, remover os filtros a partir dos suportes de filtro e armazenar a -20 ° C até a análise.

Figura 1. Um exemplo de instalações correctas do VacuSIP: (a) A amostragem da ascídia Polycarpa mytiligera (Golfo de Aqaba, Mar Vermelho), utilizando um manipulador custom-built com o código de cores usado verde para inalado e amarelo para amostras de água no ar exalado (foto por Tom Shelizenger e Yuval Yacobi); (B) a amostragem dos oroides esponja Agelas (NW MediterrâneoMar) com uma largura osculum de 3 mm, usando o dispositivo VacuSIP. O código de cores usado é amarelo por inalação e vermelho para amostras de água no ar exalado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Vista geral da técnica VacuSIP descrito na secção protocolo. O trabalho de laboratório é representado em caixas amarelas, o trabalho de campo em caixas azuis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. As taxas de amostragem média global (ml min ^-1) obtido com recipientes diferentesusados ​​para conjuntos de água e diferentes níveis de vácuo: os balões não foram aspirado (nenhum); frascos de vidro de EPA e frascos de PEAD foram aspirado metade do seu volume (½ volume); tubos de plástico estéreis já foram aspirados pelo fabricante. Trabalhando a 5-8 m de profundidade, temperatura da água de 18-22 ° C, utilizando tubos PEEK de comprimento 79 cm, e de 25 um diâmetro interno.

Tabela 2. Resumo do recipiente de amostragem, do conjunto do filtro fixador, em linha, de armazenamento e métodos analíticos descritos na secção protocolo. Os compostos analisados ​​são: abundância ultra-plâncton (plâncton <10 mm), silicato (SiO _4), fosfato (PO ₄ ^3-), nitrito + nitrato (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-), dissolvido matéria orgânica (DOM), de amónio _(NH4 ⁺⁾ e matéria orgânica em partículas(POM). Todos os utensílios de amostragem têm tampa de septo de silicone e são aspirados antes da amostragem. Os fixadores são: paraformaldeído + glutaraldeído (Glut + Parafor), ácido ortofosfórico (H ₃ PO ₄₎ e ácido clorídrico (HCl). Os conjuntos de filtro in-line utilizados são: suportes de filtros de policarbonato e policarbonato de membrana de 0,2 mm filtros (porta-filtro PC + membrana PC) e suportes de filtros de aço inoxidável e fibra de vidro livre de ligante filtros GFF.

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Resultados

Otimização dos métodos de coleta de água do mar

Seleção de frascos de coletor e procedimento de limpeza

vasos de coleta VacuSIP compatíveis devem ter um septo que permite amostragem a ser iniciada por perfuração com uma agulha de seringa. Eles devem suportar a pressão debaixo d'água elevada (2-3 bares no scub...

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Discussão

etapas preparatórias

Frascos de colector para os DOM e análise de nutrientes

Uma vez que os navios de colector podem interagir com micro-constituintes dissolvidos e as paredes do amostrador pode ser um substrato para as bactérias de crescimento ^30-34, diferentes frascos de DOM e recolha de nutrientes foram testados. Borosilicato não é recomendado para a quantificação de sílica ^33,35, uma vez...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (254 µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13 mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution	Decon Labs	1002	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100 g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2 ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500 g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump