الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

Summary

ووصف وهناك طريقة بسيطة لإنشاء المشيمة الإنسان الأساسية (زغابي) والثقافات الجهاز الساقطة. الثقافات الجهاز زغبي والساقطية هي أدوات لا تقدر بثمن لدراسة المرضية في واجهة الإنسان الأم والجنين. ويتجلى العدوى ببكتيريا الليستيريا الخلايا اللستيريا الاختيارية.

Abstract

تظهر المشيمة على درجة كبيرة من التباين التشريحي بين الأنواع. لفهم أفضل البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية من المشيمة البشرية، لا بد من تصميم التجارب باستخدام الخلايا البشرية والأنسجة. ميزة من الثقافة الجهاز هو الحفاظ على ثلاثي الأبعاد (3D) التنظيم الهيكلي والمصفوفة خارج الخلية. والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو نجاح إنشاء فيفو السابقين الثقافات الحمل هيئة الأنسجة البشرية وعلى صيانة ثقافة صحية لل72-96 ساعة. تفاصيل بروتوكول لمعالجته فورا من البحوث وافق، المشيمة والعينات الساقطية جديدة من جناح التشغيل. هذه هي عينات وفيرة إلا سيتم التخلص منها. تعليمات مفصلة حول جمع عقيمة من هذه العينات، بما في ذلك تفاصيل الشكلية على كيفية اختيار الأنسجة المناسبة لإقامة الثقافات الجهاز 3D، يتم توفيرها. وmicrodissected الأنسجة زغبي والساقطية المشيمة إلى 2-3 مم ³ قطعوضعت بشكل منفصل على مرشحات transwell مبطنة مصفوفة ومثقف لعدة أيام. زغابي والثقافات الجهاز الساقطية مناسبة تماما للدراسة البشري التفاعل المضيف الممرض. بالمقارنة مع الكائنات نموذج أخرى، فإن هذه الثقافات الإنسانية هي مفيدة بشكل خاص لدراسة آلية العدوى لمسببات الأمراض التي تظهر أنماط مختلفة من خصوصية المضيف. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر إصابة الثقافات الجهاز المشيمة والساقطية مع الاختيارية البكتيريا الممرضة المستوحدة الليستيريا ذات الصلة سريريا، داخل الخلايا.

Introduction

العدوى والالتهاب في واجهة الأم والجنين يمثل مصدرا رئيسيا للمراضة والوفيات في النساء والأطفال. فهم كيف تصيب الجراثيم هذه الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات جديدة لمنع وعلاج الأمراض مثل الولادة المبكرة ووفاة الجنين. ومع ذلك، بين الأنواع عالية التباين واجهة الأم والجنين يعقد التحقيق التجريبي. وعلاوة على ذلك، تظهر مسببات الأمراض الأكثر الميكروبية خصوصية العائل، وبالتالي العديد من النماذج الحيوانية لا يمكن أن ألخص تماما الأمراض المعدية الإنسان. بعض الكائنات الحية (المستدمية النزلية، السالمونيلا التيفية، ضمة الكوليرا، والعديد من الآخرين) هي المسببة للأمراض بدقة في البشر، في حين أن البعض الآخر، مثل الليستريا الليستيريا، وعلى مستوى أكثر وسيطة من خصوصية المضيف ^1. وقد تم توثيق خصوصية المضيف في كثير من جوانب المرضية، بما في ذلك الاستعمار ^{2، 3} نشر والتهرب المناعة ⁴ ، واقتناء المواد الغذائية ^5. وبالتالي، فإنه من الأهمية بمكان لتحديد أنظمة نموذج المضيف الأمثل.

يتألف من خلايا الجنين ودم الأم، والمشيمة هي العضو الذي يتطور بسرعة على مدار الحمل ^6. في أبسط شروط، هي التي شيدت المشيمة البشرية هياكل تشبه شجرة "زغبي" الجنين استحم في دم الأم. الغاز وتبادل المغذيات يحدث عبر طبقات الخلايا الجنينية متخصصة تسمى أرومة مغذية التي تبطن السطح من أشجار زغبي. بطانة الرحم المخاطية الأمهات، وصف بطانة الرحم في الأنثى غير الحوامل، يحول هيكليا ووظيفيا في الساقط لاستيعاب وحدة جنيني مشيمي. وترسو الأشجار زغبي إلى الرحم عن طريق أرومة مغذية extravillous (EVT) التي تهاجر من ترسيخ أعمدة خلية في الساقط. واجهة الأم والجنين، وبالتالي، يتكون من الساقط والمشيمة.

ووصفت تقنية زراعة الأعضاء هناوقد استخدمت لدراسة أين وكيف سريريا مسببات الأمراض البشرية ذات الصلة، بما في ذلك L. monocytogene الصورة والتوكسوبلازما، عبور الحاجز المشيمي ^2،7. هذه الثقافات جهاز خارج الجسم الحي تكرار في الهندسة المعمارية أنسجة الجسم الحي، وهي نظم نموذج يمكن القول من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة للغاية لالمشيمة البشرية. وتشمل تقنيات زراعة إضافية إإكسبلنتس كامل الجهاز، شرائح الجهاز، والأنسجة أو وقف organoids خلية جزءا لا يتجزأ في 3D مصفوفة. لمزيد من التفاصيل حول هذه الخيارات، يرجى الرجوع إلى استعراض حديث شامل ^8. يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول هو لثقافة منفصلة من الساقط والزغب المشيمي. لدراسة التفاعل بين الخلايا المشيمة والخلايا الساقطة، قد يكون من المفضل تقنية ثقافة مشتركة. نشير القارئ المهتم إلى تقنية المشارك ثقافة زغابي ساقطي سبق وصفها، وتستخدم من قبل الباحثين الذين يدرسون بوساطة الأرومة الغاذية ساقطي إعادة الأوعية الدموية ^9-11.

Protocol

وأجريت التجارب وفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وافقت هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو (لجنة حقوق الإنسان # 11-05530). جميع المرضى بشرط موافقة خطية مستنيرة لجمع العينات وتحليلها لاحقا. وقد تم جمع الأنسجة كما العينات غير محددة الهوية.
ملاحظة: الباحث يجب أن يحصل على موافقة من مجلس مراجعة المؤسسي المواد البشرية. واستبعاد العينات على أساس التاريخ أو المشيمة الحمل الشذوذ تختلف وفقا لاحتياجات أي دراسة محددة.
ملاحظة: شروط السلامة المناسبة (مستوى السلامة الحيوية 2) ينبغي أن تستخدم لجميع الخطوات في هذا البروتوكول ^12.

1. إعداد، وقبل يوم مجموعة

1. مصافى الأوتوكلاف / ملقط لجمع، ومقص / ملقط لتشريح الصغيرة.
2. إعداد حجم كاف (500 مل لكل عينة) من العازلة غسل (إعادةفر إلى الجدول رقم 1 لصفة).
3. إعداد حجم كاف (100 مل لكل عينة) من 0.22 ميكرومتر وسائل الاعلام جمع العقيمة التي تمت تصفيتها (يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 لصفة).
4. قسامة خارج الخلية مصفوفة (ECM، يرجى الرجوع إلى الجدول من الكواشف للتفاصيل) للتخزين على المدى الطويل.
5. متجر ECM في صورة صلبة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. للحصول على أفضل أداء، وتجنب تكرار ذوبان التجميد. زجاجة ذوبان الجليد إلى حل لزجة عند 4 درجات مئوية، وإعداد 300 مكل في غرفة باردة مع نصائح ماصة المبردة. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.

2. جمع الأنسجة الطازجة

تنبيه: عند العمل مع الأنسجة البشرية الطازجة، ويجب على الباحثين متابعة الاحتياطات العالمية (OSHA) لمنع انتقال مسببات الأمراض المنقولة بالدم، ويجب أن يكون تلقى التدريب المؤسسي السليم. معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، وحماية العين، والمعاطف مختبر ضرورية.

1. المواصلاتتعقيمها، مصافى (واحد لكل عينة)، تعقيمها-ملقط، غسل العازلة (الدامجانة زجاجة)، وسائل الاعلام جمع (25 مل لكل عينة في أنبوب مخروطي 50 مل)، وزجاجة رذاذ، التبييض 10٪، و 70٪ من الإيثانول، علبة جمع الأنسجة، sharpie ودلو الثلج / برودة الى المستشفى / العيادة.
   يتم استلام العينات في الفضاء المخصص للأبحاث منتشرة في غرفة قريبة من جناح التشغيل: ملاحظة. ولا يشترط تقديم غطاء نسيج الثقافة العقيمة، ولكن يجب أن يحدث جمع على وجه السرعة والباحث يجب تعقيم بشكل مناسب السطوح، كما هو موضح أدناه.
2. مكان الدامجانة زجاجة من غسل العازلة المتاخمة لالحوض، ورذاذ حنفية مع التبييض 10٪ و 70٪ من الإيثانول. مكان الزجاج صينية جمع الأنسجة على مصدر للضوء (لوحة خفيفة أو ضوء مربع)، وتعقيم مع التبييض 10٪ و 70٪ من الإيثانول. السماح للهواء الجاف.
3. لديها عينات حمل الأطباء السريريين من جناح التشغيل لغرفة تحضير العينة. في الحوض، من أجل العينة فوق معقمة مصفاة باليد، وشطف الأنسجة عدة مرات في كانعازلة ساعة، ونقل العينة كلها في المخزن لعلبة زجاجية معقمة فوق مصدر الضوء.
   ملاحظة: تقييم الأنسجة من قبل الطبيب هو من الأولوية القصوى، وبالتالي يتم تنفيذ الخطوات التالية إلا بعد أن أشار الطبيب لفظيا أنه / أنها الانتهاء من التقييم.
4. استخدام ملقط معقم لتحديد الزغب المشيمي والساقط (أرقام 2A و 3A) لجمع ونقل لفصل أنابيب مخروطية 50 مل. تسمية أنابيب مع عمر الحمل.
   ملاحظة: يفضل الأعمار الحملية أقل من 9 أسابيع، وأقل من 16 أسبوعا من أجل المشيمة والساقط، على التوالي. في المؤسسة، وشراؤها سوى جزء من كل عينة لأغراض البحث، والأنسجة كافية يجب أن تبقى للتشخيص المرضي السريري.
5. تخزين ونقل العينة على الجليد لمختبر الأبحاث.
6. لجمع عينة أكثر من واحد، تطهير علبة الزجاج كما هو موضح أعلاه مع التبييض 10٪ و 70٪ من الإيثانول بين كوليction من كل عينة.

3. إعداد لوحات ثقافة الجهاز

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في نسيج الثقافة هود. وهو مثالي للمجهر تشريح ليكون موجودا في حقل معقمة. ومع ذلك، هذا ليس ضروريا على الاطلاق طالما يتم تنفيذ تشريح الصغيرة على وجه السرعة، وانخفض الصكوك في كثير من الأحيان في 70٪ من الإيثانول.

1. قارورة ذوبان ECM (ق) على الجليد. تمييع ECM 1: 1 مع وسائل الاعلام جمع الجليد الباردة، مزيج من قبل pipetting. ماصة ببطء لتجنب إدخال فقاعات. كل بئر من 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة يتطلب 100 ميكرولتر من هذا التعليق وسوف تستوعب 3-4 الثقافات الجهاز.
2. إدراج مكان transwell (حجم المسام 0.4 ميكرومتر) في كل بئر من 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة.
3. معطف كل transwell إدراج بطبقة رقيقة (100 ميكرولتر) من ECM / التعليق سائل الإعلام.
4. وضع لوحة على الجليد والشروع فورا في establishmenطن من الثقافات الجهاز. بدلا من ذلك، وإعداد لوحة سابقة لجمع الأنسجة، وفي هذه الحالة التفاف عليه في الفقرة الأفلام وتخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. لا ينصح التخزين لفترة أطول من 6 ساعات كما ECM سوف تجف.

4. إنشاء الثقافات الجهاز

ملاحظة: هذه الخطوة توضح كيفية وضع الثقافات الجهاز الساقطية والثقافات الجهاز زغبي في transwells منفصل. الأنسجة ليست على اتصال. يمكن للباحثين المهتمين في تقنية ثقافة مشتركة حيث الساقط والزغب على اتصال مباشر مع بعضها البعض، والرجوع إلى الأدبيات السابقة ^9،10.

1. شطف العينات مرتين في وسائل الإعلام مجموعة، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج بين كل الشطف. نقل الأنسجة إلى طبق بتري معقمة ومكان على مسرح المجهر تشريح. حافظ على لوحة 6 جيدا على الجليد المتاخمة للالمجهر.
2. الأنسجة الدقيقة تشريح مع عارضة خشبية تشريح مقص وملقط معقم، لإقامة 2-3 ملم الثقافة الجهاز الزغابيالصورة (الشكل 2A).
   ملاحظة: الثقافات الجهاز زغبي صغيرة،-أوعية دموية جيدا "الأشجار" مع 2 أو 3 فروع، ومع بارزة الأرومة الغاذية extravillous (EVT) أعمدة خلية ^11. من المهم الاستفادة من الأنسجة زغبي فقط من <9 الاسبوع العينات الأشهر الثلاثة الأولى، والغزو من أرومة مغذية extravillous إلى ECM أكثر وضوحا في هذه الأعمار الشابة ^(13).
3. تحديد الزوائد-أوعية دموية بشكل جيد مع أبرز أعمدة خلية EVT. وتصور الأعمدة خلية EVT كما بصلي الشكل، "غامض"، "رقيق" نهايات (الرجوع إلى النصال في الشكل 2A).
4. استخدام ملقط معقم لنقل 3 أو 4 أشجار زغبي في كل transwell. ضبط فروع بحيث يتم وضع شجرة شقة فوق ECM وفروع تجمعت منفصلة.
5. الدقيقة تشريح الأنسجة الساقطية مع عارضة خشبية تشريح مقص وملقط معقم، لإنشاء 3 مم ³ الثقافات الجهاز الساقطية (الشكل 3A).
   ملاحظة: عينات تحتوي على اثنين ديسأنواع صبغة الأنسجة الساقطية، الجدارية الساقط وcapsularis الساقط (اليسار واليمين شظايا الأنسجة، على التوالي، الشكل 3A).
6. تقليم مع مقص لإنشاء 3 مم ³ قطع من الجدارية الساقط. لم يتم استخدام الساقط capsularis لهذه الثقافات. استخدام ملقط لندف بعيدا أي دم الأم متخدر.
7. استخدام ملقط معقم لنقل 3-4 قطع من الساقط في كل transwell.
8. إضافة 1ml من وسائل الاعلام مجموعة إلى قاع البئر. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂
9. للتجارب حيث أنه من المهم لتقليد طبيعي الأشهر الثلاثة الأولى توتر الأوكسجين المشيمة، والحفاظ على الثقافات الجهاز زغبي في نقص الأكسجين النسبي (3٪ O _2).
   ملاحظة: تتضمن خيارات مختبر صغير غرف نقص الأكسجة الحاضنة التي تناسب داخل الحاضنات القائمة، أو حاضنة الغاز الثلاثي الذي يقدم خارجي N ₂ الغاز لخفض تركيز الأوكسجين.
10. إضافة 1 مل من زغبي أو المتوسطة ساقطي (علامة التبويبلو 1) إلى أعلى من transwell بعد 12-16 ساعة من ثقافة.
    ملاحظة: إن غياب وسائل الإعلام خلال ليلة وضحاها الأول في ثقافة تسمح الأعمدة خلية الأرومة الغاذية extravillous لغزو (ثقافة زغبي)، والأنسجة (زغابي وساقطي على حد سواء) لتصبح جزءا لا يتجزأ من آمن في ECM. في تجربتنا، تبقى الثقافات الجهاز الساقطية قابلة للحياة لمدة 72 ساعة والجهاز زغابي الثقافات لمدة 96 ساعة. ونحن نوصي النهاية التجريبية التي تقع ضمن هذا الإطار الزمني. انظر الجدول رقم 1 لتكوين زغبي وساقطي المتوسطة. متوسطة زغابي يحتوي على نسبة عالية من FBS، في حين تستكمل المتوسطة ساقطي مع هرمونات الحمل (البروجسترون، 17β استراديول) التي تحافظ على الدولة decidualized (الجدول 1).

5. إعداد L. المستوحدة الثقافات

ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل عن التخزين الطويل الأجل من L. اللستيريا، والثقافة، ونمو ثيالصورة الكائن في ضخ القلب الدماغ (BHI) مرق وأجار، يرجى الرجوع إلى وانغ وآخرون ^(14).

1. اختيار واحد L. المستوحدة مستعمرة من مجزع BHI لوحة أجار وتطعيم 3 مل من مرق بهي.
2. احتضان L. المستوحدة الثقافة بين عشية وضحاها (16 ساعة)، في موقف مائلة، عند 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذه الشروط ثقافة تسمح نمو البكتيريا للوصول إلى مرحلة ثابتة L. وسوطي اللستيريا عند 30 درجة مئوية، مما يزيد من غزو الخلايا المضيفة ^(15).

6. العدوى من الثقافات الجهاز مع L. اللستيريا

1. دافئ برنامج تلفزيوني وزغبي أو المتوسطة ساقطي (الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية.
2. استخدام ملاقط معقمة لإزالة أي قطع ثقافة الجهاز الذي لم غزو في ECM، وبالتالي تطفو في البئر.
3. نضح بعناية وسائل الإعلام من أسفل transwell. شطف transwells العلوي والسفلي مرتين من قبل pipetting بلطف 1 مل من الحربم برنامج تلفزيوني إلى جانب، والشفط بعناية بينهما. ماصة بلطف 1 مل من زغبي أو ساقطي سائل الإعلام الحرة للمضادات الحيوية إلى transwell العلوي والسفلي. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الثقافة الجهاز.
4. دع الأنسجة احتضان في وسائل الإعلام الحرة للمضادات الحيوية لساعة على الأقل لضمان أنه تمت إزالة المضادات الحيوية.
   ملاحظة: في مرحلة ثابتة كثافة L. ثقافة اللستيريا حوالي 1 × 10 ^{9 وحدات} تشكيل مستعمرة (كفو) لكل مل. يجب أن يكون عدد من البكتيريا تستخدم لتصيب الثقافات الجهاز تصميما تجريبيا لتلبية احتياجات التجريبية.
5. لالنوع البري L. اللستيريا التجارب العدوى الروتينية تظهر الغزو قوية مع 1:50 التخفيف من بين عشية وضحاها (4 × 10 ⁷ المستوحدة L. في 1 مل من وسائل الإعلام لكل بئر). Resuspend وعدد مناسب من البكتيريا في خالية من المضادات الحيوية زغبي أو ساقطي المتوسطة.
6. وسائل الإعلام نضح من أعلى transwells. إضافة بلطف 1 مل من اللقاح. احتضان لوحات في 37درجة مئوية في 5٪ CO ₂ للسماح للغزو البكتيري.
7. إزالة البكتيريا خارج الخلية بواسطة الشفط وسائل الإعلام من transwells العلوي والسفلي. شطف الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني الدافئ. إضافة 1 مل من زغبي أو وسائل الإعلام ساقطي تستكمل مع 50 ميكروغرام مل ^-1 جنتاميسين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
   ملاحظة: L. اللستيريا هي نوع من البكتيريا داخل الخلايا الاختياري التي يمكن أن تنمو في المتوسط ​​خارج الخلية، وتنمو داخل الخلايا، وينتشر من خلية إلى خلية دون الوصول إلى الفضاء خارج الخلية. جنتاميسين له تأثير مبيد للجراثيم في الخلية L. اللستيريا، وبالتالي يسمح قياس الخلايا L. المستوحدة النمو والانتشار من خلال الثقافة الجهاز ^16.
   ملاحظة: قابل للإنتاج L. عدوى الليستيريا الثقافات الجهاز زغبي والساقط يحدث مع أوقات حضانة 5 ساعة. الوقت من الحضانة قبل إضافة جنتاميسين يمكن تعديلها بناء على احتياجات التجريبية وأساسهاility الكائن الحي لغزو الأنسجة. من أجل فهم أفضل المواقع التشريحية الأكثر عرضة للإصابة، وأحيانا حضانة أقصر ويمكن استخدام ^2.
8. الحفاظ على لوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة التجربة. تغيير وسائل الإعلام كله في كل بئر يوميا.
   ملاحظة: في تجربتنا، L. المستوحدة تبقى -infected الثقافات الجهاز الساقطية قابلة للحياة لمدة 48 ساعة والجهاز زغابي الثقافات لمدة 72 ساعة.

7. حصاد الجهاز الثقافات عن التشريح

1. يعد حل الطازجة بنسبة 4٪ لامتصاص العرق عن طريق تمييع 10 مل من 16٪ أمبولة الأسهم في 30 مل برنامج تلفزيوني. مخزن 4٪ لامتصاص العرق في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، وتستخدم خلال أسبوع واحد. تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
2. وسائل الإعلام نضح من transwell العلوي والسفلي. شطف بلطف الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. إضافة بلطف 1ML 4٪ امتصاص العرق الى أعلى transwell لتغطية كامل الثقافة الجهاز.
3. احتضانفي 4٪ امتصاص العرق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تجنب مرات حضانة أطول لأن ذلك قد يؤدي إلى الإفراط في تثبيت الأنسجة.
4. امتصاص العرق نضح والآبار شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. تضمين الثقافات الجهاز الثابت في أكتوبر المتوسطة، وتجميد، وقسم على ناظم البرد ( "ثابت تجميد"). بشكل عام، الأنسجة المجمدة الثابتة هو أسهل لقسم من الأنسجة المجمدة دون تثبيت مسبق.
   ملاحظة: للحصول على بروتوكول كامل على أكتوبر التضمين وباجتزاء المجمدة، يرجى الوصول إلى الأقسام ذات الصلة من البروتوكولات نشرت ^17،18. اعتمادا على احتياجات التجريبية ومعدات المختبرات المتاحة والتخزين، قد تكون الأنسجة بدلا من ذلك ومقطوع على مشراح ¹⁹ جزءا لا يتجزأ من البارافين.
5. وعلاوة على ذلك إعداد الشرائح الأنسجة لالروتيني الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ، المناعي، أو ^18،20،21 المناعية.

النتائج

الشكل 1 (معدلة من زيلدوفيتش وBakardjiev ²²⁾ البيانية والمشيمة ذات الصلة وتشريح الرحم ويبين الشكل 2 الإجمالي تمثيلا والصور نسيجية من الزغابات المشيمية، بينما يوضح الشكل (3) الأنسجة الساقطة.

هذا البروتوكول يصف لأول مرة مجموعة من المشيمة الطازجة والأنسجة الساقطية في المستشفى أو العيادة. العينة التي تم جمعها هي خليط من المشيمة الجنين (الزغب) ومكونات الرحم الأمهات (الساقط). بعد الشطف مع العازلة التي تحتوي على المضادات الحيوية واسعة الطيف ومضادات الفطريات، يتم فحص العينة بأكملها عن طريق العين باستخدام مربع الضوء. توضع الزغب والساقط في أنابيب منفصلة ونقل على الجليد إلى المختبر. في المختبر، يتم استخدام مجهر تشريح لتقدير الخصائص الشكلية غرامة من الأنسجة السليمة. الصور التمثيلية للزغابي (الشكل 2A) والأنسجة الساقطية ويبين الشكل (3A) التي تم الحصول عليها مع مجهر تشريح مع اثنين من مصادر الضوء معقوفة الخارجية لتكون مرجعا.

يتم إنشاؤها الثقافات الجهاز زغبي من العينات الأشهر الثلاثة الأولى. تتكون ثقافات الأشجار زغبي محطة صغيرة مع 2-6 فروع. ومن المهم أن تشريح فروع زغبي أن تنتهي في الأعمدة الأرومة الغاذية extravillous وأوعية دموية جيدا. وينظر إلى هذه الميزات كفرع نهايات (السهام) "رقيق" أو "غامض"، وخافت الوردي إلى الأحمر هوى خطية أن الدورات من خلال فروع الشجرة على اليسار في الشكل 2A. في المقابل، الأوعية الدموية وأرومة مغذية extravillous لا تصور بسهولة لشجرة على اليمين من هذه الصورة، والتي ستكون دون المستوى الأمثل للثقافة. خلال اليوم الأول للثقافة وأرومة مغذية extravillous تهاجر إلى ECM، رHUS ترسيخ الأشجار زغبي في مصفوفة على transwell.

يتم إنشاؤها الثقافات الجهاز الساقطية من أول وأوائل العينات الثلاثة أشهر الثانية. يتم تحويل بطانة الرحم بأكمله إلى الساقط قريبا جدا بعد الزرع. وبشكل أكثر تحديدا، وتعرف الساقط القاعدي الغشاء المخاطي في الرحم الكامنة مباشرة في موقع المشيمة / الزرع، الساقط capsularis يعرف الغشاء المخاطي المغطي للجنين، ويشير الساقط الجداري إلى ما تبقى من بطانة الرحم. التصور تحت المجهر تشريح تبين أن العينة الحمل الأولى يتكون إلى حد كبير من الجدارية الساقط وcapsularis الساقط (من اليسار وشظايا الأنسجة المناسبة، على التوالي، في الشكل 3A). وتتميز capsularis الساقط بسهولة عن طريق رقيقة وطبيعتها غشائي. للثقافات الجهاز، يتم قطع الساقط الجداري إلى 3 مم ³ شظايا مع مقص تشريح الصغيرة وadheتتم إزالة الإيجار الدم يتخثر بالملقط.

وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، يصاب الأنسجة مع L. الليستريا. ويستند البروتوكول العدوى المذكورة أعلاه على فحص حماية الجنتاميسين يستخدم لدراسة نمو الخلايا وانتشار البكتيريا داخل الخلايا الاختيارية ^16. يتم تحضين الثقافات الجهاز في المتوسط ​​خالية من المضادات الحيوية مع L. المستوحدة لمدة 5 ساعة. تغسل الثقافات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة البكتيريا من المتوسط. بعد ذلك، يتم إضافة جنتاميسين للقضاء على الكائنات الحية خارج الخلية. الأدب مسبق من مختبرنا تستخدم المناعي والفحص المجهري متحد البؤر لتحديد توطين الأنسجة البكتيرية على مختلف timepoints بعد إصابة ^2. يتم شطف الثقافات الجهاز في برنامج تلفزيوني، ثابتة في 4٪ امتصاص العرق، وإما المجمدة جزءا لا يتجزأ في أكتوبر المتوسطة وتخزينها في -80 درجة مئوية، أو وتخزينها في درجة حرارة الغرفة جزءا لا يتجزأ من البارافين. يمكن أقسام الأنسجة يكون ستاINED لالمناعي (IF) أو المناعى (IHC) تحليل البكتيريا وتوطين خلية حقيقية النواة. الشكل 2B هو ممثل IF صورة لمقطع المجمدة المعدة من 8.3 أسبوع الثقافة الجهاز زغبي في 72 ساعة بعد الإصابة. لاحظ عبئا ثقيلا البكتيري (مخضر) في EVTs في نهايات الفروع زغبي، والنقص النسبي في البكتيريا في الطبقة شجرة بطانة الأرومة الغاذية المخلوية (مضان أحمر). في الأعمال السابقة، كنا مماثلة إذا تلطيخ لتوطين L. اللستيريا في الثقافات الجهاز زغبي في timepoints مختلفة بعد العدوى. أكثر من 72 ساعة، وانتشار العدوى من EVT إلى أرومة غاذية خلوية جنوب المخلوي وسدى زغابي الأساسي. والجدير بالذكر، وطبقة synyctiotrophoblast مقاومة للإصابة ^2.

تمثيلية الصور المجهرية الخفيفة من أقسام الأنسجة الساقطية جزءا لا يتجزأ من البارافين H & E الملون وأعدت من 14.3 الأسبوع specime وترد نانو ثانية في أرقام 3B و 3C. وكان جزءا لا يتجزأ من هذا الغشاء transwell ECM المغلفة لإظهار الثقافة الجهاز في الوضع الطبيعي (الشكل 3B). تظهر الصورة الغدد مبطنة الظهارية (النجمة) والأوعية الدموية مبطنة البطانية (الماس) المتمركزة بتباين داخل مقصورة الخلايا اللحمية الساقطة. بالإضافة إلى ذلك، هناك خلايا مناعية الأمهات المنتشرة في جميع أنحاء سدى ساقطي في مناطق ذات كثافة متغيرة. IHC وإذا يمكن أن تستخدم تلطيخ لتحديد البكتيريا توطين microanatomical، نسبة إلى الخلايا المناعية المقيمين محددة. وكمثال على ذلك، الضامة CD14 ⁺ (مخضر) توطين لبطانة الأوعية الدموية والمنتشرة داخل سدى (الشكل 3D)، في حين أن مجاميع كبيرة من L. ويلاحظ اللستيريا (مضان أحمر) في الغالب في سدى ساقطي في 48 ساعة بعد الإصابة (الشكل 3D).

غسل العازلة	متوسطة جمع	متوسطة الزغابي	متوسطة ساقطي
برنامج تلفزيوني	DMEM / F-12 مع GlutaMAX	DMEM / F-12 مع GlutaMAX	DMEM / F-12 مع GlutaMAX
البنسلين 100 وحدة دولية / مل	مصل بقري جنيني 2.5٪	مصل بقري جنيني 20٪	مصل بقري جنيني 2.5٪
الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل	البنسلين 100 وحدة دولية / مل	البنسلين 100 وحدة دولية / مل	17β استراديول 300 غ / مل
الجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل	الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل	الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل	البروجسترون 20 نانوغرام / مل
أمفوتيريسين ب 1.25 ميكروغرام / مل	الجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل
< / td>	أمفوتيريسين ب 1.25 ميكروغرام / مل

FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">

الجدول 1: وصفات وسائل الإعلام مكونات وتجمعات لإعداد العازلة اغسل والمتوسطة مجموعة، زغبي المتوسطة، وساقطي المتوسطة.

الشكل 1. المشيمة هيكل. (A) هيكل وحدة فيتو المشيمة في الرحم الأمومي، (ب) توسيع صندوق في الفقرة (أ) يسلط الضوء على أن الأرومة الغاذية الجنين (T) واصطف واستحم الزغب المشيمي في دم الأم وترسو في الساقط من قبل أرومة مغذية extravillous (EVT). الواردة في الزغابات هي السفن الجنين (اناث)، الخلايا الليفية، والضامة الجنين. تعديل من زيلدوفيتش وBakardjiev ^22. "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الثقافات الجهاز زغبي - إجمالي الممثل والصور المجهرية (A) اثنين من الأشجار زغبي النهائية مع عمر الحمل 6 أسابيع، وينظر تحت المجهر تشريح. ملاحظة نهايات "رقيق" (السهام) والأوعية الدموية الجنين بارز التعقيب من خلال فروع الشجرة على اليسار التي تجعل هذه القطعة مناسبة للثقافة الجهاز. (ب) المجهري المناعي للثقافة الجهاز (العمر الحملي 8.3 أسابيع) 72 ساعة بعد العدوى مع المستوحدة الليستيريا، وتسليط الضوء عبء ثقيل البكتيرية [الأخضر] في أرومة مغذية extravillous. يظهر دابي باللون الأزرق، وβHCG + أرومة غاذية مخلوية باللون الأحمر. الحانات النطاق = 1 ملم (A)، و 250 ميكرون (B).7 / 54237fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: الثقافة الجهاز ساقطي - إجمالي الممثل والصور المجهرية (A) الساقط الجداري لل[يسار] وcapsularis الساقط [حق] في الحمل عمر 6 أسابيع، وينظر تحت المجهر تشريح. القسم الملون الإلكتروني (B) H & 14.3 الأسبوع الحملي سن الساقط الجداري للثقافة الجهاز يظهر الغدد والأوعية الدموية المنظمة بتباين في جميع أنحاء سدى ساقطي. و(الماس، ◆) و(النجمة *) تسليط الضوء على سفينة التمثيلية والغدة، على التوالي. الخط البني في الحافة السفلى هو transwell غشاء، على حافة الهاوية. (C) H & E الملطخة قسم من 14.3 الأسبوع الساقط عمر الحمل الجداري للثقافة الجهاز في أعلى التكبير دemonstrates الشرايين دوامة العضلات الجدران جزءا لا يتجزأ من سدى ساقطي. الخلايا المناعية الأمهات صغيرة مع نواة مستديرة داكنة، وتوزع بشكل غير منتظم في جميع أنحاء سدى. (D) المناعي المجهري الثقافة الجهاز 48 ساعة بعد الإصابة مع L. اللستيريا، وتسليط الضوء مناطق كبيرة من البكتيريا [الأحمر] في سدى ساقطي، وCD14 ⁺ الأمهات الضامة [الأخضر] بطانة الأوعية الدموية الفضاء متعرج والمنتشرة في سدى. على نطاق والحانات = 1 ملم (A)، و 250 ميكرون (B)، 50 ميكرون (C و D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يمكن الفطرية، المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب سلالات يخدم في النظم التجريبية لاختبار بقوة الآليات. ومع ذلك، على الرغم من الحفظ العام للمادة الوراثية الأساسية، والجينوم وظيفية لدى الفئران والبشر تظهر اختلافات كبيرة في العناصر التنظيمية ^23. وليس من المستغرب، لذلك، وأحيانا لا تلخيصها أن الدراسات قبل السريرية واعدة في النماذج الحيوانية في المرضى من البشر. معارض المشيمة التنوع بين الأنواع عالية جدا، مما يجعل نماذج حيوانية أقل من مثالية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر ^24. يعترف كل من اختلافات ملحوظة في علم المناعة البشرية والفأر ^25، وتطور متباينة وضوحا في علم التشريح المشيمة، فإنه من الحكمة أن تنظر في استخدام خارج الجسم الحي الثقافات الجهاز من أنسجة الحمل الإنسان للتحقيق التجريبي.

والوصف، والصور الفوتوغرافية، والفيديو التعليمي في هذا البروتوكول إرشاد الباحثين علىكيفية إنشاء زغابي والثقافات الجهاز الساقطة على إدراج زراعة الأنسجة transwell ECM المغلفة. وتشمل مزايا هذه التقنية البساطة النسبية للتشريح الصغيرة والميكانيكية نظام الدعم transwell، لا سيما بالمقارنة مع الطرق البديلة مثل المصفوفات جزءا لا يتجزأ 3D أو الثقافات الجهاز شريحة. تعليق الثقافة الجهاز على دعم غشاء يسمح لتبادل المواد الغذائية في جميع الأسطح الأنسجة ويتم الحفاظ على استمرارية للثقافة على المدى القصير (96 ساعة للثقافات زغبي، 72 ساعة للثقافات الساقطية)، وهذا الأسلوب يسمح لدراسة البيولوجيا المشيمة البشري في الأنسجة مستوى، لا يمكن إنكاره أكثر بيولوجيا من النماذج ثقافة الخلية أحادي الطبقة.

الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تشريح الصغير من القطع زغبي والساقطية المناسبة للثقافة الجهاز. وأظهرت قطع المثلى من الأنسجة فوتوغرافيا (الشكل 2A) والشكل (3A) لمساعدة الباحثين الذينالتصور العينات الحمل هو جديد. من المهم بصفة خاصة لتحديد الأشجار زغبي التي تنتهي في الأعمدة EVT الفروع، وهذه الخلايا سوف يهاجر إلى ECM وتساعد على ترسيخ الزغب إلى الغشاء. لكلا النوعين من الثقافات الجهاز مفيد للحد من الاضطرابات في الأنسجة خلال التغييرات وسائل الإعلام من قبل pipetting بطريقة متأنية وتؤدة.

تقدم هذه التقنية سوى الحد الأدنى من الصعوبات. في بعض الأحيان، تظهر العينات التلوث. التلوث هو عادة البكتيري (في بعض الأحيان بولي للميكروبات)، وإلا يصبح واضحا بعد 1-2 أيام في الثقافة. مرة واحدة لوحظ تلوث، ينبغي أن تطبق التبييض، وثقافة التخلص منها، ونسيج الثقافة الحاضنة تعقيمها لمنع مشكلة على المدى الطويل. هناك عدة طرق ممكنة قد تنشأ التلوث: في عدوى الرحم، أثناء الجراحة، خلال العينات الحصاد / المعالجة، أو أثناء الصيانة الثقافة الجهاز. الخطوات الحصاد والتجهيز والوقت على الأرجحومكان للتلوث لإدخالها. وبالتالي، فمن المهم للحد من مقدار الوقت يتم التلاعب العينة خلال جمع وتشريح الصغيرة. وهذا سوف يقلل التعرض العينة إلى المحيط والبيئة غير معقمة. اعتمادا على إعداد المختبر، ومجهر تشريح يمكن أن يكون موجودا داخل المعقم نسيج الثقافة هود.

تحليل الإمراضية الثقافات الجهاز بعد العدوى مع الممرض ذات الصلة طبيا L. اللستيريا، ويظهر هنا كما طلب واحد ممكن من البروتوكول. توطين المناعي من كل من البكتيريا والخلايا المناعية بعد عوائد العدوى رؤى جديدة لاستجابة المضيف الإنسان لمسببات الأمراض. الثقافات الجهاز الساقطية قد تكون بمثابة فيفو السابقين تقنية التجربة مكملة لدراسة البيانات التي تم إنشاؤها من المجراة العدوى الماوس، بما في ذلك تقارير مثيرة للاهتمام تظهر العيوب في وظائف الدفاع بلعم الساقطية الفئران ^26،27. بالإضافة إلى ذلك، غزاله البشريعلى الثقافات يمكن استخدامها في استراتيجيات مختلط العدوى، مثل اللقاح تنافسية تتألف من عدة سلالات إسوي من L. الليستريا. عدوى تنافسية الثقافات الجهاز هو وسيلة حساسة لاختبار مدى ملاءمة عوامل الفوعة داخل المضيف البشري. القيد واحد من هذا الأسلوب هو بقاء الأنسجة، والذي يقتصر على ثقافة على المدى القصير (96 ساعة للثقافات زغبي، 72 ساعة للثقافات الساقطية). هذا هو المثل الأعلى للعدوى بالميكروبات سريعة النمو مثل L. اللستيريا، ولكن الثقافات أطول قد تكون ضرورية لمسببات الأمراض التي يستغرق مزيدا من الوقت لإنشاء وينتشر عن طريق الأنسجة.

للحد من العبء العالمي للمضاعفات الحمل، يجب أن تركز البحوث على فهم الفيزيولوجيا المرضية واجهة الإنسان الأم والجنين. بكتيرية أو فطرية، ومسببات الأمراض الفيروسية التي تعبر من الأم إلى الجنين قضية المدمرة مضاعفات الحمل وعدوى الجنين. التحكم في العدوى فيفو العاني مختبريعتبر ملس عادة المعيار الذهبي لمعالجة كيفية استعمار مسببات الأمراض والعبور بين الأجهزة ^28. لأن التشريح المشيمة يختلف بشكل ملحوظ في كل أنواع الثدييات، فإنه من الأهمية بمكان أن تدمج الأنسجة البشرية في استراتيجيات البحوث. الثقافات الجهاز زغبي والساقطية الإنسان هي أنظمة النموذجية ذات الصلة للغاية لتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. لدراسة هذا الجهاز الحيوي بعد مفهومة، يمكن للباحثين الاستفادة من وفرة من المشيمة البشرية التخلص منها خلاف ذلك، والعينات الساقطة، وذلك باستخدام استراتيجيات الثقافة الجهاز مثل كما هو موضح هنا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterilization pouches	Fisher Scientific	01-812-54	For autoclaving individual dissecting tools
Fine mesh strainer	Cuisinart (Amazon.com)	NA	Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection.
Carboy with spigot	Fisher Scientific	03-007-647	For large volume preparation of Wash buffer.
Ice packs	Nortech labs	GB8818	These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging.
70% Ethanol	VWR	V1001	70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol.
10% Bleach	Waxie Sanitary Supply	CLO 30966	10% solution made by adding dH20.
Light Box	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100)
Micro dissecting forceps	Stoelting	52102-43	4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve
Micro dissecting forceps	Stoelting	52102-06	4 inches, Straight Fine, Sharp
Micro dissecting vannas spring scissors	Stoelting	52130-01P	McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve
Dissecting microscope	Leica Microsystems	MZ16 or M60	We have had success with the listed models.  External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary.
50 ml conical tubes	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Phosphate Buffered Saline	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available.
10x Phosphate Buffered Saline	Teknova	P0195	For preparation of Wash buffer we use 10x PBS
DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX	Gibco (Life Technologies)	10565-018	We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710072	1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100x stock.  Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Amphotericin B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	500x stock.  Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C.
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C.
Bottle-top vaccum filter (0.22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	For sterile filtration of Collection media after preparation
6-well tissue culture plate	BD Falcon	353224	Polystyrene, Tissue culture treated
6-well transwells	Millipore	PICM03050	Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane
Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix)	BD Biosciences	354234	We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS.
Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures)			For some experiments, hypoxia may be preferred.  This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator.
Bench top centrifuge