الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

Summary

علينا أن نظهر، للنقل الدهون نظام تشكيل طبقة ثنائية القابل للتخزين. غشاء الدهون طبقة ثنائية يمكن أن تتشكل داخل 1 ساعة مع معدل نجاح أكثر من 80٪ عندما يتم إحضارها تمهيدا غشاء المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة. وهذا النظام يقلل عمليات شاقة والخبرات ذات الصلة القنوات الأيونية.

Abstract

والدهون طبقة ثنائية مصطنعة، أو أسود الدهون غشاء (بلم)، هو أداة قوية لدراسة القنوات الأيونية والتفاعلات البروتينية، فضلا عن تطبيقات الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك، وتقنيات تشكيل بلم التقليدية لها عدة عيوب وغالبا ما تتطلب خبرة معينة وعمليات شاقة. على وجه الخصوص، BLMs التقليدية تعاني من معدلات نجاح تشكيل منخفضة ويتعارض وقت تشكيل غشاء. هنا، علينا أن نظهر نظام تشكيل بلم القابل للتخزين ونقلها مع سيطرة الوقت ترقق بها وتعزيز معدل تشكيل بلم عن طريق استبدال الأفلام المستخدمة تقليديا (تترافلوروإيثيلين، polyoxymethylene، البوليسترين) إلى (PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان. في هذه التجربة، يتم استخدام البوليمر التي يسهل اختراقها منظم مثل PDMS رقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من المذيبات المستخدمة تقليديا مع اللزوجة المنخفضة، واستخدام السكوالين يسمح للرقابة الوقت رقيق خارجا عن طريق امتصاص المذيبات بطيء من قبل PDMS، وإطالة غشاء مدى الحياة. في الإعلانdition، باستخدام خليط من السكوالين وسداسي، وقد زاد من نقطة التجمد من الحل الدهون (~ 16 درجة مئوية)، بالإضافة إلى ذلك، تم إنتاج السلائف غشاء التي يمكن تخزينها لأجل غير مسمى ونقلها بسهولة. وقد خفضت هذه السلائف غشاء بلم وقت تشكيل <1 ساعة فيما حقق معدل تكوين بلم من ~ 80٪. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب قناة أيون مع الجراميسيدين وجدوى نظام الأغشية.

Introduction

الاصطناعي الدهون غشاء طبقة ثنائية، أو أسود الدهون غشاء (بلم)، هو أداة هامة لتوضيح آليات أغشية الخلايا والقنوات الأيونية، وكذلك لفهم التفاعلات بين القنوات الأيونية وأيونات / جزيئات ^1-7 على الرغم من أن طريقة التصحيح، المشبك وغالبا ما تعتبر المعيار الذهبي للدراسات غشاء الخلية، فمن شاقة وتتطلب مشغلي درجة عالية من المهارة لقياس القناة الايونية. ⁸ بينما ظهرت تشكيلها بشكل مصطنع الأغشية الدهنية طبقة ثنائية كأدوات بديلة للدراسات القناة الايونية، ^9،10 أنها ترتبط أيضا مع شاقة عمليات وخبرات محددة. وعلاوة على ذلك، الأغشية عرضة للاضطرابات الميكانيكية. التطبيقات العملية وبالتالي، تقنيات طبقة ثنائية الدهون وعرض لتاريخ محدودة. ¹¹

من أجل تعزيز متانة وطول العمر من الأغشية الدهنية طبقة ثنائية، كوستيلو وآخرون. ^12، وإيد وياناغيدا 13 وقد وضعت طبقة ثنائية الدهن قائمة بذاتها بدعم من الهلاميات المائية. وعلى الرغم من تعزيز طول العمر ولكن (<24 ساعة)، لم تحسن طبقة ثنائية متانة. جيون وآخرون. ¹⁴ ضعت غشاء مغلف هيدروجيل (HEM) مع الحميم هيدروجيل الدهون طبقة ثنائية الاتصال، مما أدى إلى تعزيز طول العمر (تصل إلى عدة أيام). لزيادة عمر HEM، Malmstadt وجيون وآخرون خلق غشاء مغلف هيدروجيل مع هيدروجيل بالدهون ملزمة عبر في الموقع التساهمية الاقتران (cgHEM). ¹⁵ وفي كلا النظامين، وزيادة عمر غشاء كبير (> 10 يوما) . ومع ذلك، فإن أنظمة تشكيل غشاء يست قوية بما فيه الكفاية، وأنه لا يمكن تخزينها أو تسليمها عند الحاجة لتحرير الخبرة لاستخدام طبقات ثنائية الدهون.

وقد تمحور تطوير منصة الدهون طبقة ثنائية في المقام الأول حول زيادة متانة وطول العمر من BLMs. وبالرغم من أن طول عمر BLMs سوتعزيز bstantially مؤخرا، وقد اقتصرت طلباتهم بسبب عدم وجود قابلية النقل والقدرة التخزينية. للتغلب على هذه القضايا، جون وآخرون خلق نظام الغشاء القابل للتخزين وعرض السلائف غشاء (MP). ¹⁶ لبناء النائبة، وإعداد خليط من ديكان N- وسداسي تحتوي على 3٪ DPhPC (1،2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) للتحكم في درجة التجمد من الحل الدهون بحيث أنها ستجمد في ~ 14 درجة مئوية (تحت درجة حرارة الغرفة، وفوق درجة حرارة الثلاجة العادية). في هذه التجربة، تم نشر النائب خلال فتحة صغيرة على (PTFE) فيلم تترافلوروإيثيلين وجمدت في وقت لاحق في الثلاجة على 4 درجات مئوية. عندما أحضر النائب إلى درجة حرارة الغرفة، وإذابة النائب وتشكلت تلقائيا طبقة ثنائية المادة الدهنية، والقضاء على الخبرات التي ترتبط عادة مع تشكيل غشاء. ومع ذلك، كان معدل نجاح بلم مصنوعة من النائب منخفضة تصل إلى ~ 27٪، والتشكل الغشاءن الوقت كان يتعارض (30 دقيقة إلى 24 ساعة)، يحد من تطبيقاتها العملية.

في هذه الدراسة، تم استخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) رقيقة بدلا من التقليدية لأغشية رقيقة مسعور (PTFE، polyoxymethylene، البوليسترين) إلى (أ) قياس الزمن تلفيق و (ب) زيادة معدل نجاح تشكيل بلم كما ذكرت سابقا من قبل ريو وآخرون. ¹⁷ وهنا، وقد سهلت تشكيل غشاء عن طريق استخراج المذيبات نظرا لطبيعة المسامية من PDMS، والوقت اللازم لتشكيل غشاء تمت السيطرة بنجاح في هذه الدراسة. في هذا النظام، كما استوعبت حل الدهون في الفيلم PDMS رقيقة، تم التوصل إلى ثابت وقت تشكيل غشاء. وعلاوة على ذلك، كان لفترة طويلة العمر الغشاء بسبب امتصاص بطيء من المذيبات في PDMS رقيقة، نتيجة لإضافة السكوالين إلى حل الدهون. أجرينا القياسات البصرية والكهربائية للتحقق من أن الأغشية شكلت باستخدام هذه التقنية هي مناسبة لطعلى دراسات القنوات.

Protocol

1. الحل تحضير

1. إعداد حل العازلة:
   1. لصياغة حل العازلة، حل 1 م بوكل (كلوريد البوتاسيوم)، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (تريس، هيدروكلوريد)، و 1 ملي EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) في الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
   2. تصفية الحل باستخدام فلتر 0.20 ميكرون. لتعقيم، الأوتوكلاف الحل في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. إعداد الحل الدهون لمرحلة ما قبل اللوحة:
   1. لصياغة حل الدهون لمرحلة ما قبل اللوحة، حل 3٪ DPhPC (1،2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) الدهون (ث: ت) في خليط من 2: 8 ن -decane وسداسي (ت: الخامس). يقلب بين عشية وضحاها باستخدام المدورة.
3. إعداد الحل الدهون لتشكيل غشاء:
   1. لصياغة حل الدهون لتشكيل غشاء، ويحل 0.1٪ DPhPC (1، 2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) الدهون (ث: ت) في خليط من 2: 8 متر مربعualene وسداسي (ت: ت). يقلب بين عشية وضحاها باستخدام المدورة.

2. تشكيل لPDMS رقيقة

1. مزيج PDMS وكيل علاج في 9: نسبة 1 (ث / ث) في كوب الخلط لتشكيل prepolymer PDMS. إضافة 5 غرام من PDMS prepolymer إلى طبق بيتري لتشكيل PDMS رقيقة (سمك 200-250 ميكرون). نشر PDMS قبل البوليمر باستخدام المغطي تدور في 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية لتشكيل طبقة رقيقة.
2. وضع طبق بتري في مجفف فراغ عند ضغط 100 mTorr لمدة 2 ساعة لإزالة فقاعات الهواء. لبلمرة طبقة رقيقة قبل البوليمر، يخبز في الفرن لمدة 5 ساعة عند 70 درجة مئوية.
3. من أجل جعل PDMS مربع رقيقة، وقطع PDMS بلمرة رقيقة إلى 2 × 2 سم ² الساحات. استخدام لكمة الدقيقة 500 ميكرون لجعل فتحة في وسط PDMS رقيقة. فتحات قبل الطلاء مع 3٪ حل DPhPC الدهون مختلطة في 2: 8 ديكان N- وسداسي.

3. غرفة تصنيع وAsse وmbly

1. لافتعال غرفة بلم، تصميم مبنيين متماثل من الغرفة باستخدام 3D برامج الرسم مع الأبعاد الخارجية من 4 سم × 1.5 سم × 1 سم وأبعاد داخلية جيدا من 1.5 سم × 1.3 سم × 0.8 سم ^17.
2. صياغة الغرفة باستخدام كتلة PTFE مع آلة التصنيع باستخدام الحاسب الآلي واتبع تعليمات الشركة الصانعة.

4. الجمعية الغرفة

1. لتجميع الغرفة، وضع الفيلم رسمت قبل-PDMS رقيقة بين الكتل PTFE اثنين بحيث الفتحة على PDMS رقيقة يتواءم مع ثقب في الغرفة.
2. ختم الحواف الخارجية للغرفة باستخدام غطاء زجاجي مع الشحوم (تسهيل المراقبة البصرية). شل غرفة تجميعها باستخدام الصواميل والمسامير.
   ملاحظة: تأكد من أن الغرفة بشكل جيد مختومة حتى لا يكون هناك أي تسرب السائل.

5. تشكيل غشاء السلائف مع تشكيل التجميع الذاتي المعجل (MPES)

1. باستخدام ماصة، إيداع 0.5ميكرولتر من 0.1٪ DPhPC الدهون مختلطة في 2: 8 ن -decane: سداسي على الفتحة من PDMS رقيقة تجميعها مع الغرفة.
2. قبل استخدام وتخزين غرفة في الفريزر أو الثلاجة أقل من 10 درجة مئوية.

6. تشكيل غشاء والتأكيد

1. لتشكيل بلم مع MPES، سحب غرفة من الثلاجة وتعليق 2 مل من محلول منظم في كل جانب من الغرفة. تعيين غرفة جانبا ل<10 دقيقة حتى يذوب الغشاء السلائف المجمدة.
2. مكان الغرفة في الصعود إلى micromanipulator إلى التحكم بدقة في الارتفاع مع الاحترام لمصدر الضوء والمجهر. تسليط الضوء على جانب واحد من غرفة كمصدر ضوء استخدام الهالوجين الألياف البصرية إضاءة لسطع الفتحة من PDMS رقيقة للمراقبة البصرية من عملية تشكيل بلم.
3. على الجانب الآخر، ووضع المجهر الرقمي عموديا فيما يتعلق مصدر الضوء لمراقبة تشكيل بلم (تكبير بنسبة 200X).
4. لتأكيد تشكيل بلم، ومراقبة مركز الفتحة حيث يصبح اللون أكثر إشراقا من بالطوق.

7. تسجيل الكهربائية

1. القياسات الكهربائية، وإعداد الأقطاب حج / الكلور باستخدام سلك الفضة 208 ميكرون سميكة والتبييض في هيبوكلوريت الصوديوم ل> 1 دقيقة. وضع الأقطاب حج / الكلورين في كل جانب من الغرفة عميقة بما يكفي لتكون مغموسة في حل العازلة.
2. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت مسرى مكروي. باستخدام برنامج الكهربية، وتطبيق ± 10 فولت الموجي الثلاثي عبر الغشاء في الحصول على موجة مربعة. تعيين تطبيق التيار الكهربائي من خلال النقر على الأسهم المشار إليها في V_clamp (بالسيارات).
3. تسجيل الخواص الكهربائية للغشاء عن طريق النقر على زر التسجيل (النقطة الحمراء رمز). الشروع في تسجيل حتى لوحظ موجة مربع موحدة. إنهاء التسجيل عن طريق النقر على أيقونة مربع أسود.

8. ايون قناة التأسيس

ليسيحدث الجراميسيدين ألف (GA) دمج عفويا على تشكيل بلم، كما يضاف GA مباشرة إلى الحل الدهون: E.

1. لمراقبة أنشطة قناة GA، تطبيق 100 بالسيارات عبر الغشاء بمعدل عينة من 5 كيلو هرتز لقياس عقد إمكانات الغشاء. تعيين تطبيق التيار الكهربائي من خلال النقر على الأسهم المشار إليها في V_clamp (بالسيارات).
2. تسجيل الخواص الكهربائية للدمج GA عن طريق النقر على زر التسجيل (النقطة الحمراء رمز). المضي قدما في تسجيل حتى يلاحظ القفزات الحالية. إنهاء التسجيل عن طريق النقر على أيقونة مربع أسود.
3. بعد الحصول على البيانات الكهربائية وتصفية البيانات مع انخفاض تمرير مرشح بسل في 100 هرتز باستخدام برنامج الكهربية.
4. مراقبة يقفز الحالية في عقد البيانات المحتملة التي تمت تصفيتها (كل قفزة الحالي، ~ 0.15 م، يمثل dimerization من قناة أيون GA) للتحقق GA التأسيس.

النتائج

تعظيم الاستفادة من MPES الحل التركيب
تم اختبار تركيبات مختلفة من الدهون والمذيبات لإعادة بنجاح الأغشية الدهنية طبقة ثنائية من MPES. النظام النائب بمزيج من ديكان N- وسداسي تحتوي على 3٪ DPhPC ¹⁴ عرضت نسبة نجاح منخفضة من تشكيل غشاء (~ 27٪)....

Discussion

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)