Автоматизированная двухслойной липидной мембраной, Образование Использование тонкой пленки полидиметилсилоксана

Резюме

Мы демонстрируют Storable, транспортабельные липидную систему образования двухслойная. Липидный бислой мембрана может быть сформирована в течение 1 часа с вероятностью успеха более 80%, когда предшественник замороженный мембрана доводят до температуры окружающей среды. Эта система позволит сократить трудоемкие процессы и опыт, связанные с ионными каналами.

Аннотация

Искусственный липидный бислой, или черный липидной мембраны (БЛМ), является мощным инструментом для изучения ионных каналов и белковых взаимодействий, а также для биосенсоров приложений. Однако традиционные методы BLM формирования имеют ряд недостатков, и они часто требуют специальных знаний и трудоемкие процессы. В частности, обычные БЛМ страдают от низких показателей успешности формирования и непоследовательным времени формирования мембраны. Здесь мы демонстрируем сохраняемыми и переносимыми систему BLM пласта с регулируемой прореживания-аут времени и повышения скорости образования BLM путем замены традиционно используемых пленок (политетрафторэтилен, полиоксиметилен, полистирол) для полидиметилсилоксана (PDMS). В этом эксперименте используют пористый структурированный полимер, такой как PDMS тонкой пленки. Кроме того, в отличие от традиционно используемых растворителей с низкой вязкостью, использование сквалена допускается контролируемое разжижающие Расчетный час с помощью медленного поглощения растворителя с помощью ПДМС, увеличить срок службы мембраны. В рекламеусловие, при использовании смеси сквален и гексадекану, точка замерзания раствора липида была увеличена (~ 16 ° C), кроме того, мембранные предшественники были произведены, которые могут быть неограниченно храниться и легко транспортируемой. Эти мембранные предшественники сократили BLM время формирования <1 ч и достиг BLM скорости формирования ~ 80%. Кроме того, эксперименты ионных каналов с грамицидина А продемонстрирована возможность мембранной системы.

Введение

Искусственный липидный бислой мембраны, или черный липидная мембрана (BLM), является важным инструментом для выяснения механизмов клеточных мембран и ионных каналов, а также для понимания процессов взаимодействия ионных каналов и ионов / молекул. ^1-7 Хотя метод пэтч-кламп часто считается золотым стандартом для клеточных мембран исследований, является трудоемким и требует высокой квалификации операторов для измерения ионных каналов. ⁸ в то время как искусственно воссозданных липидный бислой мембраны появились в качестве альтернативных инструментов для исследований ионных каналов, ^9,10 они также связаны с трудоемкими процессов и специальных знаний. Кроме того, мембраны восприимчивы к механическим возмущениям. Следовательно, липидные двухслойные технологии , введенные на сегодняшний день имеют ограниченные практические применения. ¹¹

В целях повышения надежности и долговечности липидный бислой мембран, Костелло и др. , ^12, и язь и Янагида 13 разработали свободно стоящую липидный бислой , поддерживаемый гидрогели. Несмотря на большей продолжительности жизни однако (<24 ч), двухслойная устойчивость не была улучшена. Джеон и др. ¹⁴ разработали гидрогеля инкапсулированный мембрану (подшить) с интимной гидрогель липидной двухслойной контакта, что приводит к большей продолжительности жизни (до нескольких дней). Для дальнейшего увеличения срока службы HEM, Malmstadt и Джеон и др. Создали гидрогель инкапсулированные мембрану с гидрогель-липидных связывания с помощью монолитного ковалентного сопряжения (cgHEM). ¹⁵ В обеих системах, мембранные времена жизни значительно увеличилось (> 10 дней) , Тем не менее, системы формирования мембрана не были достаточно прочными, и не могут быть сохранены или переданы, где это необходимо, чтобы освободить экспертизу для использования липидных бислоев.

Развитие липидной двухслойной платформы имеет в основном вращалась вокруг увеличения прочности и долговечности БЛМ. Хотя долговечность БЛМ был суbstantially усиливается в последнее время, их применение было ограничено из-за недостатка транспортабельности и способности к хранению. Чтобы преодолеть эти проблемы, Джеон и др. Создали Storable мембранную систему и введена мембранный предшественник (МП). ¹⁶ Для построения МП, они приготовили смесь н- деканом и гексадекану содержащей 3% -ную DPhPC (1,2-diphytanoyl- зп глицеро-3-фосфатидилхолин) , чтобы контролировать температуру замерзания липидного раствора таким образом, что она будет замерзать при ~ 14 ° C ( при температуре ниже комнатной, выше типичной температуре холодильника). В этом эксперименте МП растянулось на небольшое отверстие на политетрафторэтилен (ПТФЭ) пленку, а затем замораживают в холодильнике при температуре 4 ° С. Когда МП доводят до комнатной температуры, МП размораживают и липидный бислой был автоматически сформирован, устраняя опыт, как правило, связанный с образованием мембраны. Тем не менее, вероятность успеха BLM сделал из МП составляла всего ~ 27%, а мембраны формирования кп раз был непоследовательным (30 мин до 24 ч), что ограничивает его практическое применение.

В этом исследовании, полидиметилсилоксан (ПДМС), тонкая пленка используется вместо обычного гидрофобных тонких пленок (PTFE, полиоксиметилен, полистирол) до (а) времени, изготовления контроля и (б) увеличить вероятность успеха BLM формации, как сообщалось ранее Рю и др. ¹⁷ в данном случае формирование мембраны облегчается путем экстракции растворителей из - за пористой природы PDMS, и время , необходимое для формирования мембраны успешно контролируется в данном исследовании. В этой системе, как липидный раствор всасывается в тонкой пленке PDMS, последовательное время образования Мембрана была достигнута. Кроме того, срок службы мембраны был продлен из-за медленного поглощения растворителей в PDMS тонкопленочных, в результате добавления сквален к раствору липида. Мы провели оптические и электрические измерения, чтобы убедиться, что мембраны, полученные с помощью этой методики пригодны для гна каналах исследований.

протокол

1. Получение раствора

1. Приготовление буферного раствора:
   1. Сформулировать буферного раствора, растворить 1 М КСl (хлорид калия), 10 мМ Трис-HCl (Трис-гидрохлорид) и 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в дистиллированной воде и доведения рН до 8,0.
   2. Фильтр раствора с использованием фильтра 0,20 мкм. Для стерилизации, автоклав раствор при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
2. Приготовление липидного раствора для предварительной покраски:
   1. Для того, чтобы сформулировать решение липидный для предварительной покраски, растворите 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- зп глицеро-3-фосфатидилхолин) липида (вес: объем) в смеси 2: 8 л -decane и гексадекана (V: V). Перемешивают в течение ночи с помощью поворотного устройства.
3. Получение липидной раствора для формирования мембран:
   1. Для того, чтобы сформулировать решение липидов для формирования мембран, растворяется 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- зп глицеро-3-фосфатидилхолин) липида (вес: объем) в смеси 2: 8 квualene и гексадекан (по объему). Перемешивают в течение ночи с помощью поворотного устройства.

2. Формирование тонкой пленки PDMS

1. Смешайте PDMS и отвердителя в соотношении 9: 1 (вес / вес) в чашку для смешивания с образованием форполимера PDMS. Добавьте 5 г PDMS форполимера в чашку Петри, чтобы сформировать PDMS тонкую пленку (толщина 200 - 250 мкм). Распространение PDMS форполимера с использованием спиновой устройства для нанесения покрытия при 800 оборотах в минуту в течение 10 секунд, чтобы сформировать тонкую пленку.
2. Поместите чашку Петри в вакуум-эксикаторе при давлении 100 мТорр в течение 2 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха. Полимеризоваться преполимера тонкую пленку, испечь в печи в течение 5 часов при 70 ° С.
3. Для того , чтобы сделать квадрат PDMS тонкопленочные, разрезать полимеризованные PDMS тонкую пленку в 2 х 2 см ² квадратов. Используйте 500 мкм микро удар, чтобы сделать отверстие в центре PDMS тонкой пленки. Предварительно лакокрасочные апертур с 3% -ным раствором DPhPC липидов , смешанного в 2: 8 n- деканом и гексадекану.

3. Камера Изготовление и Ассmbly

1. Для того, чтобы изготовить BLM камеру, дизайн два симметричных блоков камеры с использованием 3D - рисования программного обеспечения с внешними размерами 4 см х 1,5 см х 1 см и внутренним ямами размерами 1,5 см х 1,3 см х 0,8 см ^17.
2. Обработайте камеру, используя блок PTFE с ЧПУ и следовать инструкциям производителя.

4. Палата Ассамблеи

1. Для сборки камеры, поместите тонкую пленку предварительно окрашенная-PDMS между двумя блоками ПТФЭ таким образом, что отверстие на PDMS тонкой пленки совмещен с отверстием в камере.
2. Уплотнение внешние края камеры с помощью покровного стекла смазкой (облегчающее оптического наблюдения). Зафиксировать в собранном виде камеры с помощью гаек и болтов.
   Примечание: Убедитесь, что камера хорошо герметизированы таким образом, что нет утечки жидкости.

5. Формирование мембранных Предтечи с Ускорянный самосборка формирования (MPES)

1. С помощью пипетки, депозит 0,5мкл 0,1% DPhPC липида , смешанного в 2: 8 л -decane: гексадекана на раскрыве PDMS тонкой пленки в сборе с камерой.
2. Перед использованием храните камеру в морозильной камере или в холодильнике ниже 10 ° С.

6. Мембрана Формирование и проверка

1. Для формирования БЛМ с MPES, вывести камеру из холодильника и подвесить 2 мл буферного раствора в каждую сторону камеры. Установите камеру в сторону для <10 мин, пока предшественник замороженное мембрана не оттаивает.
2. Поместите камеру на микроманипулятор точно контролировать высоту по отношению к источнику света и микроскопом. Осветить одну сторону камеры в качестве источника света, используя галогенную волоконно-оптический осветитель ярче апертуры PDMS тонкопленочных для оптического наблюдения BLM процесса формирования.
3. С другой стороны, место цифровой микроскоп вертикально по отношению к источнику света, чтобы наблюдать образование BLM (увеличить на 200X).
4. Для подтверждения BLM образования, наблюдать центр отверстия, где цвет становится ярче, чем кольцевое пространство.

7. Электрическая запись

1. Для электрических измерений, подготовки Ag / Cl электродов с использованием 208 мкм толщиной серебряной проволоки и отбеливатель в гипохлоритом натрия в течение> 1 мин. Устанавливая электроды Ag / Cl в каждую сторону камеры достаточно глубоко, чтобы погрузить в буферный раствор.
2. Подключите электроды к усилителю микроэлектродов. Использование ПО электрофизиологии, нанесите ± 10 мВ треугольной формы через мембрану, чтобы получить квадратные волны. Установка приложения напряжения, нажимая на стрелки, указанные на V_clamp (мВ).
3. Запись электрических свойств мембраны, нажав на кнопку записи (красный значок точка). Продолжить с возможностью записи до тех пор, пока наблюдается равномерная прямоугольная волна. Закройте запись, нажав на квадратный значок черный.

8. Включение ионного канала

НЕЕ: грамицидин А (гА) включение происходит спонтанно при образовании BLM, а дА добавляют непосредственно к раствору липида.

1. Для того, чтобы наблюдать за деятельностью канала gå, нанесите 100 мВ через мембрану при частоте дискретизации 5 кГц для измерения потенциала, проведение мембраны. Установка приложения напряжения, нажимая на стрелки, указанные на V_clamp (мВ).
2. Запишите электрические свойства включения gå, нажав на кнопку записи (красный значок точка). Продолжить запись, пока не наблюдается тока скачков. Закройте запись, нажав на квадратный значок черный.
3. После электрического сбора данных, фильтровать данные с фильтром нижних частот Бесселя на частоте 100 Гц с использованием программного обеспечения электрофизиологии.
4. Соблюдайте текущие прыжками в отфильтрованной холдинг потенциальных данных (каждый скачок тока, ~ 0,15 нс, представляет собой димеризацию ионного канала gå) для проверки gå включения.

Результаты

Оптимизация MPES Solution Композиция
Различные композиции липидов и растворителей были протестированы успешно воссоздавать липидный бислой мембран из MPES. Система МП со смесью н - деканом и гексадекану , содержащего 3% DPhPC ¹⁴ проявляли низкий уровень у?...

Обсуждение

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)