需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
Method Article
我们展示了一个可存储,运输的脂质双分子层形成系统。的脂质双层膜可以在1小时内超过80%的成功率,当冷冻膜前体达到环境温度下形成。该系统将减少与离子通道相关的繁琐流程和专业知识。
人工脂质双层,或黑脂质膜(BLM)是用于研究离子通道和蛋白质的相互作用,以及用于生物传感器的应用的有力工具。然而,传统的BLM形成技术具有若干缺点,它们经常需要特定的专门技术和费力的过程。特别是,传统的类脂膜从低形成的成功率和不一致的膜形成时间受到影响。在这里,我们通过替换传统使用的薄膜(聚四氟乙烯,聚甲醛,聚苯乙烯),聚二甲基硅氧烷(PDMS)展示与控制稀疏的时间和提高BLM形成率可存储和运输的BLM形成系统。在这个实验中,使用如PDMS薄膜的多孔构造的聚合物。此外,相对于具有低粘度的常规使用的溶剂,使用角鲨烯的通过溶剂吸收慢允许受控稀疏时间由PDMS,延长膜的寿命。在广告DITION,通过使用角鲨烯和十六烷的混合物中,脂质溶液的凝固点增加(〜16℃),此外,膜前驱体被生产,可以无限期储存和容易运输。这些膜的前体具有降低<1小时的BLM形成时间和达到〜80%BLM形成率。此外,与短杆菌肽A离子通道的实验证实了膜系统的可行性。
人工脂质双层膜,或者黑脂质膜(BLM),为阐明细胞膜和离子通道,机制以及对于理解离子通道和离子/分子之间的相互作用的一个重要工具。1-7虽然膜片钳方法通常被认为是对细胞膜的研究的金标准,它是费力的并且需要对离子通道测量高度熟练的操作人员。8虽然人工重组的脂质双层膜已成为对离子通道的研究替代工具,9,10-它们也与费力相关联流程和具体的专业知识。此外,膜是易受机械扰动。因此,引入到日期脂质双层技术具有有限的实际应用。11
为了增强脂质双层膜,Costello 等人 12,和IDE和柳田的稳健性和寿命 13已经设计出由水凝胶支持一个独立的脂双层。然而,尽管增强长寿(<24小时),双层稳健性没有得到改善。全度等人 14设计了一种水凝胶包封的膜(HEM)与亲密水凝胶的脂双层的接触,从而增强了寿命(长达数天)。为了进一步增加HEM的寿命,Malmstadt和全度等人创建了水凝胶的脂质通过原位共价缀合(cgHEM)。15结合在这两个系统的水凝胶包封的膜,膜的寿命显着增加(> 10天) 。然而,膜形成系统是不足够坚固,并且在必要时以释放专门知识的使用脂双层的不能被存储或传送。
脂质双分子层平台的开发越来越周围的鲁棒性和类脂膜的寿命已初步旋转。虽然类脂膜的寿命一直是苏最近bstantially提高,其应用被限制由于缺乏输送和耐贮性的。为了克服这些问题,全度妍等人创建了一个可存储的膜系统,并推出了隔膜前体(MP)。16要构建MP,他们准备正癸烷和十六烷的含有3%DPhPC(1,2-diphytanoyl-混合SN -glycero -3-磷脂酰胆碱)来控制脂质溶液,使得其将在〜14℃(室温以下,上述典型的冰箱温度)冻结的冰点。在该实验中,在MP被分布在一个小的孔上的聚四氟乙烯(PTFE)膜,并随后在4℃的冰箱中冷冻。当MP被带到室温,在MP解冻和脂质双层中自动形成的,消除了通常与膜形成相关的专门知识。然而,从MP制成BLM的成功率较低,为〜27%,和膜formation个时间不一致(30分钟至24小时),限制了其实际应用。
在这项研究中,如先前通过柳报道聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜来代替传统的疏水性薄膜(聚四氟乙烯,聚甲醛,聚苯乙烯)至(a)控制制造时间和(b)增加BLM形成的成功率等 17在这里,膜的形成是通过溶剂萃取,由于PDMS的多孔性容易,并且对于膜形成所需的时间在本研究中被成功控制。在这个系统中,作为脂质溶液吸收到的PDMS薄膜,一致的膜形成时间达到了。此外,膜的寿命延长,由于溶剂的缓慢吸收进入的PDMS薄膜,相加角鲨烯的到脂质溶液的结果。我们进行了光学和电学测量,以验证使用这种技术形成的膜是合适的对于i对渠道的研究。
1.溶液的制备
2.将PDMS薄膜的形成
3.商会制作和奥丝mbly
4.商会大会
5.前体膜的形成与加急自组装形成(MPES)
6.膜形成和验证
7.电气录音
8.离子通道掺入
不E:短杆菌肽A(GA)自发成立后,发生形成BLM,因为GA直接添加到脂质的解决方案。
MPES解决结构优化
脂质和溶剂的不同组合物进行测试,以从MPES成功重组脂质双层膜。在MP系统用正癸烷和十六烷含3%DPhPC 14的混合物表现出的膜形成(〜27%)的低成功率。另外,作为与PDMS膜连续地抽出脂质溶液,有必要优化溶剂组合物以维持完整的脂质双层膜。因此,角鲨烯,其在20℃具有12厘泊的粘度-C 18代替正-癸烷,其...
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20...
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。