Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Riepilogo

Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all'80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.

Abstract

Un doppio strato lipidico artificiale, o nero dei lipidi di membrana (BLM), è un potente strumento per lo studio dei canali ionici e le interazioni delle proteine, così come per le applicazioni di biosensori. Tuttavia, le tecniche convenzionali di formazione BLM hanno diversi svantaggi e che spesso richiedono competenze specifiche e processi laboriosi. In particolare, BLM convenzionali soffrono di bassi tassi di successo di formazione e tempo di formazione della membrana incoerente. Qui, dimostriamo un sistema di formazione BLM immagazzinabile e trasportabile con il tempo diradamento controllato e una maggiore velocità di formazione BLM sostituendo film convenzionalmente utilizzati (politetrafluoroetilene, poliossimetilene, polistirolo) di polidimetilsilossano (PDMS). In questo esperimento, viene utilizzato un polimero poroso strutturato come PDMS film sottile. Inoltre, al contrario di solventi convenzionalmente impiegati con bassa viscosità, l'uso di squalene consentito un tempo diradamento controllato tramite assorbimento lento solvente PDMS, prolungando la vita della membrana. in annunciocondizione, usando una miscela di squalene e esadecano, il punto di congelamento della soluzione lipidica è aumentata (~ 16 ° C), in aggiunta, precursori di membrana sono stati prodotti che possono essere indefinitamente immagazzinato e trasportato facilmente. Questi precursori di membrana hanno ridotto BLM tempo formazione di <1 ora e ha raggiunto un tasso di formazione BLM del ~ 80%. Inoltre, gli esperimenti dei canali ionici con gramicidina A hanno dimostrato la fattibilità del sistema a membrana.

Introduzione

Artificial doppio strato lipidico della membrana, o nero membrana lipidica (BLM), è un importante strumento per chiarire i meccanismi di membrane cellulari e canali ionici, nonché per comprendere le interazioni tra canali ionici e ioni / molecole. ^1-7 Sebbene il metodo patch-clamp è spesso considerato il gold standard per gli studi di membrana cellulare, è laborioso e richiede agli operatori altamente qualificati per le misure di canali ionici. ⁸ Mentre ricostituite artificialmente membrane doppio strato lipidico sono emersi come strumenti alternativi per gli studi dei canali ionici, ^9,10 essi sono anche associati con laboriosa processi e competenze specifiche. Inoltre, le membrane sono sensibili alle perturbazioni meccaniche. Applicazioni pratiche Quindi, tecnologie doppio strato lipidico introdotte fino ad oggi hanno limitato. ¹¹

Al fine di migliorare la robustezza e la longevità delle membrane doppio strato lipidico, Costello et al. ^12, e Ide e Yanagida ^{13 ha ideato un doppio strato lipidico free-standing supportato da idrogel. Nonostante una maggiore longevità tuttavia (<24 ore), doppio strato robustezza non è stata migliorata. Jeon et al. 14 ha ideato una membrana incapsulata idrogel (HEM) con contatto intimo doppio strato idrogel-lipidico, con conseguente maggiore longevità (fino a diversi giorni). Per aumentare ulteriormente la durata della HEM, Malmstadt e Jeon et al. Creato una membrana idrogel-incapsulato con legante idrogel-lipidico tramite in-situ covalente coniugazione (cgHEM). 15 In entrambi i sistemi, vite membrana aumentato notevolmente (> 10 giorni) . Tuttavia, i sistemi di formazione membrana non erano sufficientemente robusto, e non possono essere memorizzati o consegnati ove necessario liberare competenze per l'utilizzo dei doppi strati lipidici.}

Lo sviluppo di una piattaforma di doppio strato lipidico ha ruotato principalmente attorno aumentare la robustezza e la longevità di BLM. Anche se la longevità di BLM è stata substantially migliorata di recente, le loro applicazioni sono state limitate a causa della mancanza di trasportabilità e conservabilità. Per superare questi problemi, Jeon et al. Ha creato un sistema a membrana immagazzinabile e ha introdotto un precursore di membrana (MP). ¹⁶ Per costruire un deputato, hanno preparato una miscela di decano n- e esadecano contenente 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) per controllare il punto di congelamento della soluzione lipidica tale che sarebbe congelare a ~ 14 ° C (sotto della temperatura ambiente, sopra la temperatura tipica frigorifero). In questo esperimento, la MP è stato suddiviso in una piccola apertura su una pellicola di politetrafluoroetilene (PTFE) e successivamente congelati in frigorifero a 4 ° C. Quando la MP è stato portato a temperatura ambiente, la MP scongelato e un doppio strato lipidico automaticamente formato, eliminando le competenze tipicamente associati con formazione della membrana. Tuttavia, il tasso di successo di BLM a base di MP era partire da ~ 27%, e formatio membranan tempo era praticamente inesistente (30 min a 24 ore), limitando le sue applicazioni pratiche.

In questo studio, un polidimetilsilossano (PDMS) a film sottile è usato al posto di un convenzionale film sottili idrofobiche (PTFE, poliossimetilene, polistirolo) a (a) tempo il controllo di produzione e (b) aumentare il tasso di successo della formazione BLM come precedentemente riportato da Ryu et al. ¹⁷ Qui, formazione della membrana è stata facilitata mediante estrazione di solventi a causa della natura porosa del PDMS, e il tempo necessario per la formazione della membrana è stata controllata con successo in questo studio. In questo sistema, come la soluzione lipidica è stata assorbita nella pellicola sottile PDMS, è stato raggiunto un tempo di formazione della membrana coerente. Inoltre, durata della membrana è stata prolungata dovuta ad un lento assorbimento dei solventi nei PDMS film sottile, un risultato dell'aggiunta di squalene alla soluzione lipidica. Abbiamo condotto misure ottiche ed elettriche per verificare che le membrane formate utilizzando questa tecnica sono adatti per isu studi canali.

Protocollo

1. Soluzione Preparazione

1. Preparazione della soluzione tampone:
   1. Per formulare soluzione tampone, sciogliere 1 M KCl (cloruro di potassio), 10 mM Tris-HCl (Tris-cloridrato), e 1 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) in acqua distillata e regolare il pH a 8,0.
   2. Filtrare la soluzione con un filtro di 0.20 micron. Per sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 15 min.
2. Preparazione della soluzione lipidica per la pre-quadro:
   1. Per formulare la soluzione lipidica per preverniciatura, sciogliere 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 n decano ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.
3. Preparazione della soluzione lipidica per la formazione della membrana:
   1. Per formulare la soluzione lipidica per la formazione della membrana, sciogliere 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 squalene ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.

2. Formazione di un PDMS a film sottile

1. Mescolare PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 9: 1 (w / w) in una tazza di miscelazione per formare il prepolimero PDMS. Aggiungere 5 g di PDMS prepolimero ad una piastra di Petri per formare i PDMS pellicola sottile (spessore 200 - 250 micron). Distribuire PDMS pre-polimero usando una spalmatrice centrifuga a 800 rpm per 10 secondi per formare una pellicola sottile.
2. Porre la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto ad una pressione di 100 mTorr per 2 ore per rimuovere le bolle d'aria. Per polimerizzare il film sottile prepolimero, cuocere in forno per 5 ore a 70 ° C.
3. Al fine di rendere un PDMS quadrati a film sottile, tagliare il film sottile PDMS polimerizzati in 2 x 2 cm ² piazze. Utilizzare un 500 micron micro punzone per fare un'apertura nel centro di PDMS film sottile. Aperture pre-vernice con 3% soluzione DPhPC lipidi mescolati in 2: 8 decano n- e esadecano.

3. Fabrication Camera e Assembly

1. Per realizzare la camera di BLM, disegno due blocchi simmetrici della camera utilizzando il software di disegno 3D con dimensioni esterne di 4 cm x 1,5 cm x 1 cm e dimensioni interne pozzetti di 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm ^17.
2. Craft la camera utilizzando un blocco di PTFE con una macchina CNC e seguire le istruzioni del produttore.

4. Montaggio Camera

1. Per assemblare la camera, posizionare il film sottile preverniciato-PDMS tra i due blocchi PTFE tale che l'apertura sulla PDMS film sottile è allineato con il foro nella camera.
2. Sigillare i bordi esterni della camera con un vetro di copertura con grasso (facilitando l'osservazione ottica). Immobilizzare la camera di assemblata utilizzando dadi e bulloni.
   NOTA: Assicurarsi che la camera è ben sigillato, in modo che non vi siano perdite di liquido.

5. La formazione di membrana precursore con formazione accellerata di auto-assemblaggio (MPES)

1. Usando una pipetta, depositare 0.5ml di 0,1% DPhPC lipidi mescolato 2: 8 n decano: esadecano sulla apertura della PDMS film sottile assemblato con la camera.
2. Prima dell'uso, conservare la camera in un congelatore o frigorifero di sotto 10 ° C.

6. formazione della membrana e di verifica

1. Per formare una BLM con MPES, prelevare la camera dal frigorifero e sospendere 2 ml di soluzione tampone in ciascun lato della camera. Impostare la camera da parte per <10 minuti fino a quando il precursore di membrana congelato si scioglie.
2. Posizionare la camera su un micromanipolatore per controllare con precisione l'elevazione rispetto alla sorgente luminosa e il microscopio. Illuminare un lato della camera di come fonte di luce con un alogeno a fibre ottiche illuminatore per illuminare l'apertura dei PDMS a film sottile per l'osservazione ottica del processo di formazione BLM.
3. D'altro lato, collocare un microscopio digitale verticalmente rispetto alla sorgente di luce per osservare la formazione BLM (ingrandimento da 200X).
4. Per confermare la formazione BLM, osservare il centro dell'apertura dove il colore diventa più luminoso del annulus.

7. registrazione elettrica

1. Per la misurazione elettrica, preparare elettrodi Ag / Cl con un filo d'argento 208 micron di spessore e candeggina in ipoclorito di sodio per> 1 min. Posizionare gli elettrodi Ag / Cl in ogni lato della camera abbastanza profonda da essere immersa nella soluzione tampone.
2. Collegare gli elettrodi all'amplificatore microelettrodo. Utilizzando il software elettrofisiologia, applicare una forma d'onda triangolare mV ± 10 attraverso la membrana di acquisire un'onda quadra. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
3. Registrare le proprietà elettriche della membrana facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Procedere con la registrazione fino a quando si osserva un'onda quadra uniforme. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.

8. Ion Canale incorporazione

NONE: Gramicidin A (GA) l'incorporazione avviene spontaneamente sulla formazione di BLM, come si aggiunge GA direttamente alla soluzione dei lipidi.

1. Per osservare le attività di canale ga, applicare 100 mV attraverso la membrana ad una frequenza di campionamento di 5 kHz per misurare il potenziale della membrana tenuta. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
2. Registrare le proprietà elettriche del costituzione gA facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Proseguire la registrazione fino a quando si osserva salti di corrente. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.
3. Dopo l'acquisizione dei dati elettrici, filtrare i dati con un filtro passa-basso Bessel a 100 Hz utilizzando un software di elettrofisiologia.
4. Osservare i salti di corrente nella tenuta dei dati potenziali filtrata (ogni salto corrente, ~ 0,15 ns, rappresenta dimerizzazione di un canale ionico GA) per verificare gA incorporazione.

Risultati

Ottimizzazione di MPES Soluzione Composizione
Diverse composizioni di lipidi e solventi sono stati testati con successo per ricostituire le membrane doppio strato lipidico da MPES. Il sistema MP con una miscela di decano n- ed esadecano contenente 3% DPhPC ¹⁴ mostrato un basso tasso di successo di formazione della membrana (~ 27%). Inoltre, il film PDMS estratta continuamente soluzione lipidica, era necessario ottimizzare composizione del solve...

Discussione

Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.

As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,^20...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For buffer solution
Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	For buffer solution
n-decane	Sigma-Aldrich	44074-U	For lipid solution
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	For lipid solution
Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	For lipid solution
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		To produce PDMS thin film
0.2 μm filter	Satorius stedim	16534----------K	To filter buffer solution
Rotator	FinePCR	AG	To dissolve lipid homogeneously
Autoclave	Biofree	BF-60AC	To sterilize buffer solution
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator	Welch	2042-22	To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch	Harris Uni-Core	0.5	To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine	SME trading	SME 2518	To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator	Motic	MLC-150C	To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope	Digital blue	QX-5	To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode	A-M Systems		To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier)	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)