JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف الورقية طريقة استخراج الحمض النووي بسيطة وسريعة من فيروس نقص المناعة البشرية proviral DNA من الدم الكامل الكشف عنها بواسطة PCR الكمي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لاستخدامها في الكشف عن علامات وراثية أخرى أو استخدام أساليب التضخيم بديلة.

Abstract

الاتحاد الدولي للسباحة، والعزلة الترشيح من الأحماض النووية، هو طريقة استخراج الرواية التي تستخدم الترشيح الرأسي عن طريق الغشاء الفاصل وسادة ماصة لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم كله في أقل من 2 دقيقة. يتم التعامل مع عينة الدم مع المنظفات، لفترة وجيزة مختلطة وتطبيقها بواسطة الماصة لغشاء الفصل. المحللة الفتائل في لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح الغشاء الفاصل. يتم الاحتفاظ الحمض النووي المستخرج على الغشاء خلال خطوة غسل بسيطة حيث مثبطات PCR هي الشريرة في لوحة النشاف ماصة. ثم يتم إضافة غشاء التي تحتوي على الحمض النووي فخ للتفاعل PCR دون مزيد من التنقية. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة ومعدات المختبرات ويمكن تنفيذها بسهولة مع وازم المختبرات وغير مكلفة. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف حساسة للغاية والكميات من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر الدم كله كنموذج لفي وقت مبكرالتشخيص فانت من فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن بسهولة أن تتكيف مع أهداف وراثية أخرى.

Introduction

وناقش العديد من التقارير تطوير أساليب الاستخراج paper- أو التي تعتمد على الأغشية للاستخدام في نقطة من الرعاية (POC) الأجهزة 1-5 بهدف جعل حساسية رائعة وخصوصية التشخيص الجزيئي للجميع. صاغ منظمة الصحة العالمية (WHO) الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي مبادرة التشخيص على المدى ASSURED (بأسعار معقولة، الحساسة، محددة، وسريعة وقوية، خالية من المعدات وتسليمها لأولئك الذين في حاجة إليها المستخدم ودية) لوصف خصائص مثالية لPOC اختبار 6. من هذه المبادئ التوجيهية، فإن السمة خالية من المعدات تحديا من نوع خاص لتحقيق التشخيص الجزيئي. ومع ذلك، فإن كل الابتكار في مجال تحقيق هدف الوصول إلى من هم في أشد الحاجة، وليس هناك أمل في تحسن على المدى القريب في أداء الاختبار عن طريق التكيف مع التكنولوجيا الحالية 7.

نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الدم الكاملالتي لا تتطلب الكيمياء المعقدة أو الأجهزة المخبرية. الاتحاد الدولي للسباحة (الترشيح عزل الأحماض النووية) طريقة تحضير العينة وضعت أصلا لاستخراج الحمض النووي الكريات البيض من الدم الكامل من أجل كشف طليعة الفيروس HIV-1 كجزء من عينة إلى الإجابة نقطة من الرعاية (POC) الكمي PCR (QPCR) الرضع في وقت مبكر للتشخيص (عيد) منصة للاستخدام في بيئات محدودة الموارد 8-11. استخراج الاتحاد الدولي للسباحة يختلف عن أساليب تنقية التقليدية التي تستخدم الأغشية السيليكا أو جزيئات ممغطس المغلفة السيليكا لربط عكسية الحمض النووي في حضور وكلاء chaotropic 12. بدلا من ذلك، يستخدم الاتحاد الدولي للسباحة الترشيح الرأسي عبر غشاء الفصل لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم الكامل مباشرة. غشاء التي تحتوي على الحمض النووي شرك يمكن وضعها مباشرة في أنبوب PCR وإما استخدامها على الفور في تفاعل PCR أو الهواء المجفف لاحق التضخيم 9. تستخدم أي chaotropic وكلاء، والفينول، أو الكحول في استخراج عينة، eliminaتينغ خطوات الغسيل واسعة اللازمة لإزالة مثبطات QPCR قوية مستمدة من عملية الاستخراج 13،14.

غشاء الاتحاد الدولي للسباحة يمكن التقاط إما خلايا 9 أو الحمض النووي الجيني حررها خلية تحلل 11 قبل يتم إضافة العينة إلى الغشاء. لالتقاط الخلايا، يتم إضافة الدم الكامل مباشرة إلى الغشاء. وهي lysed الخلايا بعد ذلك في غشاء من خلال إضافة 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم. ميزة لهذا الأسلوب هو أنه ينطوي فقط 3 خطوات: 1) عينة بالإضافة. 2) خلية تحلل / غسيل و 3) وضع القرص مرشح في أنبوب QPCR. العيب إلى هذا الأسلوب هو أن غشاء يمكن أن تعقد سوى عدد محدد من الخلايا يتناسب طرديا مع قطر القرص الغشاء. للوصول إلى الحد من الكشف المطلوبة للعيد، و 100 ميكرولتر من الدم الكامل هو مطلوب لإدخال عينة الذي ينطوي على مرشح كبير جدا بحيث يمكن وضعها في أنبوب QPCR. الناشر خلايا الدم مع المنظفات قبل إضافة العينة إلى جمعويضيف غشاء خطوة المعالجة، ولكن يسمح باستخدام مرشح أصغر لنفس حجم العينة. كنا قادرين على إثبات استنساخ عالية، والكشف عن نسخة واحدة، وتقدير حجم اقل من 10 نسخ من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر من الدم باستخدام هذا التكوين اختبار 11.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الاتحاد الدولي للسباحة كما وضعت أصلا للاستخدامات المختبرية. شطيرة غشاء / فلتر المعروفة باسم وحدة إعداد نموذج الاتحاد الدولي للسباحة يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها لاستخدامها لاحقا. عندما تكون العينات ليكون استخراجه هذه العملية تستغرق مدة 2 دقيقة، ويمكن أداؤها في متفاوتة دفعات الحجم. وQPCR يمكن تشغيلها مباشرة أو المرشحات التي تحتوي على الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من يمكن تخزين حتى أنها مريحة لأداء QPCR. هذه الطريقة مناسبة جدا لتحليل الروتيني للعينات في كل من إعدادات الموارد المنخفضة والعالية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بيان الأخلاق: العينات الدموية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة لا تعتبر الأبحاث التي تجرى على البشر. وقد تم الحصول على عينات لأغراض التشخيص السريري، والذي كانوا راضين، وقدمت الجزء المتبقي من هذه العينات للفحص البحوث الاتحاد الدولي للسباحة. تم ترميز العينات من هذا القبيل أن المحققين لم يتمكنوا من التأكد بسهولة من هوية الأفراد.

1. إعداد وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة عينة

  1. إعداد النشاف لوحة عن طريق قطع 35 × 35 مم 2 من 2.6 مم وسادة من القطن 100٪. قطع منصة واحدة في العينة.
  2. إعداد فيلم البارافين البلاستيك مع شريط دعم ورقة بواسطة قطعة قطع فيلم البارافين (25 ملم (ح) بنسبة 50 ملم (ث)) ثم اللكم حفرة قطرها 7.14 ملم في وسط الشريط باستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. إعداد شريط واحد لكل عينة.
  3. إعداد الغشاء الفاصل ملزمة الدم الزجاج (غشاء القبض) على القرص من خلال اللكم دائرة قطرها 8.35 ملمباستخدام مطرقة مدفوعة حفرة لكمة. لكمة قرص واحد لكل عينة. القرص لديه القدرة على الاحتفاظ الجسيمات من 2.3 ميكرون.
  4. تجميع عينة وحدة إعداد الاتحاد الدولي للسباحة خلال وضع القرص الالتقاط في وسط لوحة النشاف باستخدام ملقط. وضع شريط فيلم البارافين على القرص التقاط الصورة حتى يترك حفرة من الشريط البارافين وسط القرص القبض عرضة للخطر.
  5. ضمان أقصى قدر من الاتصال بين القرص ولوحة النشاف التي تمتد على الشريط البارافين قليلا لتغطية لوحة النشاف والضغط على الشريط البارافين بحزم التمسك بها إلى لوحة النشاف حول جميع حواف القرص.
  6. جعل العديد من وحدات حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

2. إعداد QPCR أنبوب

  1. إعداد قرص الشريط 5.1 ملم من شأنها ترسيخ غشاء القبض على الخلية إلى جانب أنبوب QPCR لمنع غشاء من عرقلة الكشف عن مضان من قبل اللكم دائرة بولي المغلفة المزدوجخاء الشريط التشخيص بمطرقة مدفوعة لكمة من ورقة الشريط. إعداد القرص شريط واحد لكل عينة.
  2. إزالة جانب واحد من الشريط اللاصق بطانة. ضع الشريط إلى 200 ميكرولتر أنبوب PCR، الشائكة على جانب واحد وباتجاه الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة ملصق الثانية بطانة. الأنبوب هو الآن على استعداد لاستقبال القرص المعدة.
  3. إنتاج أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الحاجة للتجربة أو مخزون للاستخدام في المستقبل.

3. دبر الدم عينة

ملاحظة: إذا كان يجري إعداد عينة اختبار حقيقية، انتقل إلى الخطوة 4.

  1. ذوبان الجليد الخلايا 8e5-LAV 15 بإيواء نسخة واحدة من طليعة الفيروس HIV-1 تم الحصول عليها من ضمان الجودة مختبر علم الفيروسات (VQA، راش المشيخية / سانت لوقا مركز الطبي، شيكاغو، IL).
    ملاحظة: يتم تخزينها كما الكريات الخلايا المجمدة بتركيز 4000 خلية / ميكروليتر. تم التحقق من عدد الخلايا كما هو موضح سابقا 9.
  2. إعداد سرالتخفيف الاتحاد العالمي للتعليم في تجميد المتوسطة (90٪ مصل بقري جنيني، و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد) لتركيزات تتراوح 1-400 خلية / ميكروليتر.
  3. الماصة 10 خلايا ميكرولتر من كل من التخفيفات المسلسل إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة HIV-1 EDTA سلبي تعامل عينة الدم الكامل لكل أنبوب لإنشاء منحنى قياسي من نسخة أرقام 8e5-LAV 10-4،000. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات.

4. تنفيذ الاتحاد الدولي للسباحة استخراج

  1. خلايا الدم ليز بإضافة تريتون-X100) إلى تركيز النهائي من 1٪ (11 ميكرولتر 10٪ تريتون-X100 إلى 110 ميكرولتر من الدم الكامل والخلايا من الخطوة 3.3).
  2. مزيج من قبل عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب 5 مرات. الدم يجب أن تتحول الأحمر الشفاف.
  3. الماصة كل عينة دم على القرص القبض عليه.
    ملاحظة: ختم ضيق المياه بين الشريط البارافين والغشاء القبض يضمن تدفق الدم من خلال الغشاء، واتصالات جيدة بين القبض على مembrane والنشاف التجمع وحة يضمن عينة فتل السريع.
  4. السماح عينة لامتصاص من خلال مرشح.
    ملاحظة: الفتائل المحللة الدم إلى لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح القرص القبض عليه. وقد غارقة المحللة في القرص عند ظهوره غير لامع.
  5. إضافة 600-1،000 ميكرولتر 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة على القرص القبض عليه.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تضاف غسل العازلة بمثابة إضافة كبيرة الحجم من 600 ميكرولتر. سوف عازلة تشكل قطرات على الشريط البارافين مسعور والفتيل من خلال ثقب إلى القرص في حوالي 20 ثانية. سوف مرشح تغير من اللون الأحمر إلى إزالة مشيرا الأبيض من الهيموغلوبين.
  6. فصل القرص من لوحة النشاف مع ملقط وتطبيق القرص إلى الشريط في أنبوب PCR استعداد. إذا كان هناك أي لون أحمر اليسار على مرشح إضافة 50-100 ميكرولتر من غسل العازلة لمسح عامل التصفية قبل وضعه في أنبوب.
    ملاحظة: نادرا، الضغط الزائد تطبيقها أثناء إعدادالاتحاد الدولي للسباحة وحدات النتائج في تقسيم طبقات غشاء أثناء فصل من لوحة النشاف. تجاهل هذه الأقراص وإعداد عينة جديدة.
  7. بعد يتم وضع فلتر في أنبوب PCR، وتحليل عينات على الفور. بدلا من ذلك، بين عشية وضحاها الجاف في علبة تحتوي على الكالسيوم كبريتات المجففة، ثم سقف وضعها في الحقيبة احباط مع المجففة السيليكا ومخزن لتصبح جاهزة للتحليل.

5. QPCR رد الفعل

  1. إعداد 100 ميكرولتر مزيج الرئيسي QPCR في رد الفعل باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الاشعال وتحقيقات محددة كما هو موضح سابقا 9،11. تشمل عنصر تحكم التضخيم الداخلية لمراقبة وجود مثبطات التضخيم والتحقق من أن عينة سلبية هي سلبية حقيقية. مما لا شك فيه أن مرشح مغطاة بالكامل مع مزيج الرئيسي وأن المرشح يبقى ثابتة إلى جانب أنبوب في جميع أنحاء رد فعل.
  2. أداء التضخيم باستخدام الوقت الحقيقي جهاز PCR كما هو موضح سابقا 9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد سير العمل لاستخراج الحمض النووي proviral من الدم الكامل ارتفعت مع خلايا 8e5-LAV في الشكل 1. ويبين الشكل 2 وحدة عينة الاتحاد الدولي للسباحة وإعداد أنبوب QPCR. وتسمح هذه الطريقة لتضخيم كفاءة HIV-1 طليعة الفيروس من خلايا 8e5-LAV في أعداد نسخة مخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تجلى عيد مرتبطة الحصول على العلاج السريع للحد من وفيات الأطفال بسبب عدوى فيروس نقص المناعة البشرية (16). بسبب استمرار الأجسام المضادة الأمهات في الدم الرضيع وسريعة اختبارات الأجسام المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية محدودة فائدة في تحديد وضع الرضع الذين تع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fusion 5GE Healthcare Life Sciences8151-9915
707 blotting padVWR International28298-014
PARAFILM MVWR International52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape 3M Medical Specialties9965
200 µl qPCR strip tubesAgilent401428
optical strip capsAgilent401425
Mx3005p qPCR SystemAgilent401456
sodium hydroxideSigma-Aldrich221465A.C.S. Reagent
Triton X-100Sigma-AldrichT9284BioXtra
dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. originThermo Fisher Scientific16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)McMaster Carr3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)McMaster Carr3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)McMaster Carr3424A23

References

  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
  6. Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
  7. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
  8. Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
  9. Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
  11. McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
  16. Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
  17. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved