El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

Resumen

Se describe aquí un método de extracción de ADN basado en papel simple y rápida del ADN proviral del VIH de la sangre total detectado por PCR cuantitativa. Este protocolo se puede extender para su uso en la detección de otros marcadores genéticos o el uso de métodos de amplificación alternativos.

Resumen

FINA, el aislamiento de los ácidos nucleicos de filtración, es un nuevo método de extracción que utiliza filtración vertical, a través de una membrana de separación y la almohadilla absorbente para extraer el ADN celular de la sangre total en menos de 2 min. La muestra de sangre se trata con detergente, se mezclaron brevemente y se aplicó mediante una pipeta a la membrana de separación. El lisado absorbe en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie de la membrana de separación. El ADN extraído se retiene en la membrana durante un simple paso de lavado en el que los inhibidores de la PCR son malvados en el papel secante absorbente. Se añade entonces la membrana que contiene el ADN atrapado a la reacción de PCR sin purificación adicional. Este sencillo método no requiere equipos de laboratorio y se puede implementar fácilmente con suministros de laboratorio de bajo costo. Aquí se describe un protocolo para la detección altamente sensible y cuantificación de VIH-1 DNA proviral de todo 100 l de sangre como un modelo para principios deFANT diagnóstico del VIH que podrían ser fácilmente adaptado a otras dianas genéticas.

Introducción

Varios informes han analizado el desarrollo de métodos de extracción de papel o basados ​​en membranas para uso en el punto de atención (PDA) dispositivos ^{de 1-5} con el objetivo de hacer la exquisita sensibilidad y especificidad del diagnóstico molecular disponible para todos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) Enfermedades de Transmisión Sexual Diagnóstico Iniciativa acuñó el término ASSURED (asequibles sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto, libre de Equipo y se entrega a aquellos que lo necesitan,) para describir las características ideales de un POC prueba ^6. De estas directrices, la característica libre de equipo es particularmente difícil de alcanzar para el diagnóstico molecular. Sin embargo, todas las innovaciones en el campo avanzará el objetivo de llegar a los más necesitados, y no hay esperanza para mejoras a corto plazo en el rendimiento de la prueba mediante la adaptación de la tecnología existente ^7.

Aquí se describe un protocolo sencillo para la extracción de ADN a partir de sangre enteraque no requiere la química compleja o instrumentación de laboratorio. La FINA (aislamiento de filtración de los ácidos nucleicos) Método de preparación de la muestra fue desarrollado originalmente para extraer el ADN de leucocitos de la sangre entera con el fin de detectar el provirus VIH-1 como parte de un punto de atención (POC) de muestra a respuesta PCR cuantitativa (qPCR) plataforma de diagnóstico infantil precoz (EID) para su uso en entornos de recursos limitados ^8-11. Extracción FINA difiere de los métodos de purificación convencionales que utilizan membranas de sílice o partículas paramagnéticas recubiertas de sílice para unirse de forma reversible de ADN en presencia de agentes caotrópicos ^12. En su lugar, utiliza FINA filtración vertical, a través de una membrana de separación para extraer el ADN celular de la sangre completa directamente. La membrana que contiene el ADN atrapado se puede colocar directamente en un tubo de PCR y, o bien inmediatamente utilizado en una reacción de PCR o se seca al aire para la amplificación posterior ^9. No hay agentes caotrópicos, fenol, o alcoholes se utilizan en la extracción de la muestra, Eliminating las extensas etapas de lavado necesarias para eliminar los inhibidores de la qPCR potentes derivados del proceso de extracción de ^13,14.

La membrana FINA puede capturar cualquiera de las células ⁹ o el ADN genómico liberado por lisis celular ¹¹ antes de añadir la muestra a la membrana. Para la captura de células, se añade la sangre total directamente a la membrana. Las células se lisan posteriormente en la membrana mediante la adición de NaOH 10 mM. La ventaja de este método es que implica sólo 3 pasos: 1) adición de la muestra; 2) la lisis celular / lavado y 3) la colocación disco de filtro en el tubo de qPCR. El inconveniente de este método es que la membrana sólo puede contener un número definido de células directamente proporcional al diámetro del disco de membrana. Para llegar al límite de detección requerido para la EID, se requiere 100 l de sangre entera para la entrada de muestra, que implica un filtro que es demasiado grande para ser colocado en un tubo de qPCR. Lisis de las células de la sangre con detergente antes de añadir la muestra a la colecciónmembrana añade una etapa de procesamiento, pero permite el uso de un filtro más pequeño para el mismo tamaño de la muestra. Hemos sido capaces de demostrar una alta reproducibilidad, la detección de copia única, y la cuantificación de tan poco como 10 copias de VIH-1 El material de ADN de 100 l de sangre utilizando esta configuración de prueba ^11.

En este informe se describe el protocolo de la FINA como originalmente desarrollado para uso en laboratorio. El sándwich de membrana / filtro conocido como el módulo de preparación de la muestra FINA se puede preparar en grandes lotes y almacenadas para su uso posterior. Cuando las muestras se van a extraer este proceso tarda 2 min y se puede realizar en diferentes lotes de tamaño. El qPCR se puede ejecutar inmediatamente o los filtros que contienen el ADN integrado puede ser almacenado hasta que es conveniente para llevar a cabo qPCR. Este método es muy conveniente para el análisis de rutina de muestras en ambos ajustes de alta y baja de los recursos.

Protocolo

Ética declaración: Las muestras de sangre utilizadas en este estudio no se consideran como la investigación en seres humanos. Se obtuvieron los especímenes con fines de diagnóstico clínico, que estaban satisfechos, y se proporcionó la porción restante de estas muestras para el ensayo de la investigación de la FINA. Las muestras se codificaron de manera que los investigadores no fueron capaces de determinar fácilmente la identidad de los individuos.

1. Preparación de la FINA Preparación de muestras Módulo

1. Preparar la almohadilla secante cortando un disco de algodón 100% de espesor de 35 x 35 mm ² de unos 2,6 mm. Cortar una almohadilla por espécimen.
2. Preparar película de parafina de plástico con una cinta de soporte de papel por una pieza de corte de la película de parafina (25 mm (h) por 50 mm (W)) y después la perforación de un orificio de diámetro 7,14 mm en el centro de la cinta utilizando un martillo accionado perforadora. Preparar una cinta por espécimen.
3. Preparar una membrana de vidrio separador de sangre unido (membrana de captura) de disco por la perforación de un círculo de 8,35 mm de diámetroutilizando un martillo accionado perforadora. Perforar un disco por espécimen. El disco tiene una capacidad de retención de partículas de 2,3 micras.
4. Montar el módulo de preparación de la muestra de la FINA, coloque el disco de captura en el centro del papel secante con unas pinzas. Coloque la cinta de la película de parafina sobre el disco de captura de modo que el orificio de la cinta de parafina sale del centro del disco de captura expuesta.
5. Asegurar el máximo contacto entre el disco y la almohadilla de transferencia por el estiramiento de la cinta de parafina ligeramente para cubrir la almohadilla de transferencia y presionando la cinta de parafina firmemente que se pegue a la almohadilla de transferencia alrededor de todos los bordes del disco.
6. Hacer tantos módulos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro.

2. Preparación de qPCR Tubo

1. Prepare un disco de cinta 5.1 mm que anclar la membrana de captura de células al lado del tubo de qPCR para evitar que la membrana desde el bloqueo de la detección de la fluorescencia por la perforación de un círculo de Polié de doble revestimientoster cinta de diagnóstico con un martillo accionado punzón partir de una lámina de la cinta. Preparar un disco de cinta por espécimen.
2. Retire un lado del forro de la etiqueta engomada de la cinta. Coloque la cinta en un 200 l tubo de PCR, pegándolo sobre un lado y hacia la parte inferior del tubo. Retire el segundo revestimiento de etiqueta. El tubo está ahora lista para recibir el disco preparado.
3. Producir tantos tubos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro.

3. Contrive Sangre de muestras

Nota: Si se está preparando una muestra de prueba genuina, continúe con el paso 4.

1. Descongelar las células 8E5-LAV ¹⁵ que albergan una sola copia de los provirus VIH-1 obtenidos del Laboratorio de Control de Calidad de Virología (VQA; fiebre del Presbyterian / St Centro Médico de Lucas, Chicago, IL.).
   Nota: Se almacenan como sedimentos de células congeladas a una concentración de 4.000 células / l. Recuento de células fue verificada como se ha descrito anteriormente ^9.
2. preparar Serdilución ial en medio de congelación (suero de 90% de bovino fetal, 10% de sulfóxido de dimetilo) a concentraciones que van de 1 a 400 células / mL.
3. Pipetear 10 células mu l de cada una de las diluciones en serie en un tubo de microcentrífuga. Añadir 100 l de fresco VIH-1 EDTA negativo tratado muestra de sangre entera a cada tubo para crear una curva patrón de número de copias de 8E5-LAV 10-4,000. Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces.

4. Realizar la FINA Extracción

1. células de la sangre Lyse mediante la adición de Triton-X100) a una concentración final de 1% (11 l 10% de Triton-X100 para 110 l de sangre completa y células de la etapa 3.3).
2. Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces. La sangre debe ponerse en rojo translúcido.
3. Pipet todo de la muestra de sangre en el disco de captura.
   Nota: un sello hermético entre la cinta de parafina y la membrana de captura se asegura de que la sangre fluye a través de la membrana, y un buen contacto entre la captura membrane y secante conjunto de almohadilla asegura una rápida absorción de la muestra.
4. Deje que la muestra penetre a través del filtro.
   Nota: Las mechas de lisado de sangre en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie del disco de captura. El lisado se ha empapado en el disco cuando aparece mate.
5. Añadir 600-1000 l de NaOH 10 mM gota a gota en el disco de captura.
   Nota: El tampón de lavado también se puede añadir como una adición mayor de 600 l. El tampón se formará una gotita en la cinta de parafina hidrófoba y la mecha a través del agujero en el disco en aproximadamente 20 segundos. El filtro cambiará de rojo a blanco indicando la liquidación de la hemoglobina.
6. Separar el disco de la almohadilla de transferencia con unas pinzas y aplicar el disco a la cinta en el tubo de PCR preparado. Si hay cualquier color rojo a la izquierda en el filtro de añadir 50 a 100 l de tampón de lavado para limpiar el filtro antes de colocar en el tubo.
   Nota: Con poca frecuencia, el exceso de presión aplicada durante la preparación dela FINA módulos resultados en la partición de las capas de la membrana durante la separación del papel secante. Desechar estos discos y preparar una muestra fresca.
7. Después de que el filtro se coloca en el tubo de PCR, análisis de las muestras de inmediato. Alternativamente, secar durante la noche en una caja que contiene calcio desecante sulfato, a continuación, la tapa y colóquelo en una bolsa de aluminio con desecante de sílice y la tienda hasta que esté listo para su análisis.

5. Reacción qPCR

1. Preparar 100 l qPCR mezcla maestra de reacción usando por VIH cebadores y sondas específicas como se describió previamente ^9,11. Incluir un control interno de amplificación para monitorear la presencia de inhibidores de la amplificación y para verificar que una muestra negativa es un verdadero negativo. Asegúrese de que el filtro está completamente cubierta de mezcla maestra y que el filtro se mantiene fijo a lado del tubo a lo largo de la reacción.
2. Realizar la amplificación usando un dispositivo de PCR en tiempo real como se describió anteriormente ^9.

Resultados

El flujo de trabajo para la extracción de ADN proviral de sangre total enriquecida con células 8E5-LAV se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra el módulo de muestra de FINA y prepararon tubo qPCR. Este método permite la amplificación eficiente de VIH-1 provirus a partir de células 8E5-LAV en diferentes números de copias, como se muestra en la curva estándar de muestras artificiales (Figura 3). PCR tenía una eficiencia del ...

Discusión

EID relacionado con el acceso rápido tratamiento se ha demostrado para reducir la mortalidad infantil debida a la infección por el VIH ^16. Debido a la persistencia de anticuerpos maternos en sangre de un bebé, pruebas rápidas de anticuerpos del VIH tienen una utilidad limitada en la determinación de la condición de los niños expuestos al VIH. La OMS recomienda que todos los niños nacidos de madres VIH-1 positivas se deben probar a las 4-6 semanas de edad, usando una prueba virológica ^17. H...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fusion 5	GE Healthcare Life Sciences	8151-9915
707 blotting pad	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR International	52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape	3M Medical Specialties	9965
200 µl qPCR strip tubes	Agilent	401428
optical strip caps	Agilent	401425
Mx3005p qPCR System	Agilent	401456
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. Reagent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin	Thermo Fisher Scientific	16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)	McMaster Carr	3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)	McMaster Carr	3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)	McMaster Carr	3424A23