Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Zusammenfassung

FINA, Filtration Isolierung von Nukleinsäuren, ist ein neuartiges Extraktionsverfahren, das über eine Trennmembran und absorbierendes Kissen zum Extrahieren der zellulären DNA aus Vollblut in weniger als 2 min vertikale Filtration verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Detergens, behandelt kurz gemischt und mit einer Pipette auf die Trennmembran aufgebracht. Das Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Trennmembran zu erfassen. Die extrahierte DNA wird auf die Membran während einer einfachen Waschschritt zurückgehalten, wobei PCR-Inhibitoren Schlechten in das absorbierende Löschblatt sind. Die Membran, die die eingeschlossene DNA enthält, wird dann ohne weitere Reinigung der PCR-Reaktion zugesetzt. Diese einfache Methode nicht Laborausrüstung erfordern und kann leicht mit preiswerten Labormaterialien realisiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum hochempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Vollblut als ein Modell für frühfant Diagnose von HIV, die ohne weiteres auf andere genetische Ziele angepasst werden könnte.

Einleitung

Mehrere Berichte haben die Entwicklung von papier- oder membranbasierten Extraktionsverfahren für die Verwendung in Point-of-Care (POC) -Geräte ^1-5 mit dem Ziel, die exquisite Sensitivität und Spezifität der molekularen Diagnostik zur Verfügung zu allen diskutiert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Sexuell übertragbare Krankheiten Diagnostics Initiative prägte den Begriff ASSURED (Bezahlbar, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundliche, schnelle und robuste, Ausrüstung frei und Lieferung für diejenigen, die es brauchen) die idealen Eigenschaften eines POC zu beschreiben Test ^6. Von diesen Richtlinien ist die Ausrüstung freie charakteristische besondere Herausforderung für die molekulare Diagnostik zu erreichen. Jede Innovation auf dem Gebiet wird jedoch voran das Ziel , die in den meisten Bedürftigen erreicht, und es gibt Hoffnung für kurzfristige Verbesserungen der Testleistung von bestehenden Technologie zur Anpassung ^7.

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die DNA aus Vollblut zu extrahierendass erfordert keine komplexe Chemie oder Laborinstrumente. Die FINA (Filtration Isolierung von Nukleinsäuren) Probenvorbereitung wurde ursprünglich um DNA aus Vollblut zu extrahieren Leukozyten entwickelt, um die HIV-1-Provirus als Teil einer Probe zu beantwortende Point-of-Care (POC) quantitative PCR zu erkennen (qPCR) frühkind Diagnose (EID) Plattform für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen ^8-11. FINA Extraktion unterscheidet sich von herkömmlichen Reinigungsverfahren Silikamembranen oder Silika-beschichteten paramagnetischen Partikeln verwenden , um reversibel DNA in Gegenwart von chaotropen Mitteln ¹² binden. Stattdessen verwendet FINA vertikale Filtration über eine Trennmembran direkt zelluläre DNA aus Vollblut zu extrahieren. Die Membran , die die eingeschlossene DNA enthält , kann direkt in einem PCR - Röhrchen gegeben werden und entweder sofort in einer PCR - Reaktion oder Luft für die spätere Amplifikation ⁹ getrocknet eingesetzt. Keine chaotropen Mitteln, Phenol oder Alkohole werden in der Probenextraktion verwendet, eliminating die umfangreichen Waschschritte benötigt starke qPCR - Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess ^13,14 abgeleitet zu entfernen.

Die FINA Membran kann entweder Zellen ⁹ oder genomische DNA erfassen durch Zelllyse freigesetzt ¹¹ , bevor die Probe auf die Membran gegeben wird. Für die Zell capture wird Vollblut direkt auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Zellen in der Membran lysiert durch Zugabe von 10 mM NaOH. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nur drei Schritten durchgeführt: 1) Probenzugabe; 2) Zelllyse / Wäsche und 3) Filterscheibe Platzierung in qPCR Rohr. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Membran nur eine definierte Anzahl von Zellen direkt proportional zum Durchmesser der Membranscheibe halten kann. Um die Nachweisgrenze zu erreichen für EID benötigt wurden 100 ul Vollblut wird für die Probeneingabe erforderlich, die einen Filter beinhaltet, der zu groß ist, in einem qPCR Rohr platziert werden. Lyse der Blutzellen mit einem Reinigungsmittel, bevor die Probe in die Auflistung hinzufügenMembran fügt einen Verarbeitungsschritt, jedoch ermöglicht die Verwendung eines kleineren Filters für die gleiche Probengröße. Wir konnten eine hohe Reproduzierbarkeit, einzelne Kopie Erkennung und Quantifizierung von weniger als 10 Kopien des HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Blut Konfiguration ¹¹ mit diesem Test zu demonstrieren.

In diesem Bericht beschreiben wir die FINA-Protokoll, wie sie ursprünglich für den Laboreinsatz entwickelt. Die Membran / Filter-Sandwich als FINA Probenvorbereitungsmodul bekannt sind, können in großen Chargen und auf Halde für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Wenn die Proben in diesem Prozess, 2 dauert min extrahiert werden und kann in unterschiedlicher Größe Chargen durchgeführt werden. Die qPCR können sofort ausgeführt werden oder die Filter die eingebettete DNA enthalten, können gespeichert werden, bis es bequem ist, qPCR auszuführen. Diese Methode ist sehr bequem für die Routineanalyse von Proben in niedrigen und hohen Ressourceneinstellungen.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Die Vollblut-Proben in dieser Studie verwendet werden, nicht am Menschen zu sein Forschung. Die Proben wurden für klinische Diagnosezwecke erhalten, die erfüllt waren, und der restliche Teil dieser Proben wurde für die FINA Forschungs Assay bereitgestellt. Die Proben wurden so codiert, daß die Forscher die Identität von Personen nicht in der Lage, ohne weiteres festzustellen waren.

1. Herstellung von FINA Probenvorbereitungsmodul

1. Bereiten Sie Pad Blotting eine 35 x 35 mm ² einer 2,6 mm dicken 100% Baumwolle - Pad durch Schneiden. Schneiden Sie ein Pad pro Probe.
2. Bereiten Kunststoff Paraffinfilm mit einem Papierträgerband durch ein Schneidstück Paraffinfilm (25 mm (h) von 50 mm (w)) und dann eine 7,14 mm Durchmesser Loch in der Mitte des Bandes Stanzen eines Hammer angetrieben Locher mit. Bereiten Sie eine Band pro Probe.
3. Bereiten Sie ein gebundenes Glas Bluttrennmembran (Capture-Membran) Scheibe durch einen 8,35 mm Durchmesser-Kreis Stanzenmit einem Hammer angetrieben Locher. Lochen eine Platte pro Probe. Die Scheibe hat eine Partikelrückhaltevermögen von 2,3 & mgr; m.
4. Montieren Sie die FINA Probenvorbereitungsmodul durch die Aufnahmeplatte in der Mitte der Schreibunterlage mit einer Pinzette platziert. Legen Sie das Paraffin Filmband über die Capture-Scheibe, so dass das Loch des Paraffins Band in der Mitte der Fangplatte ausgesetzt verlässt.
5. Stellen Sie sicher, einen maximalen Kontakt zwischen der Platte und dem Löschblatt durch das Paraffin Band dehnen leicht die Schreibunterlage und Drücken des Paraffin Band zu bedecken fest an die Schreibunterlage zu bleiben, um alle Kanten der Platte.
6. Machen Sie so viele Module wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt.

2. Herstellung von qPCR-Schlauch

1. Vorbereiten eines 5,1 mm-Bandscheibe, die die Zelle Einfangmembran auf der Seite der qPCR Röhre verankern wird die Membran von Blockierung der Fluoreszenzdetektion durch Stanzen eines Kreises von doppelt beschichteten polye zu verhindernster Diagnoseband mit einem Hammer angetriebenen Stempel aus einem Blatt des Bandes. Bereiten Sie eine Bandscheibe pro Probe.
2. Entfernen Sie eine Seite der Aufkleber Schiff der Band. Legen das Band in einem 200 & mgr; l PCR-Röhrchen, das auf der einen Seite und in Richtung der Unterseite des Rohres haften. Entfernen Sie den zweiten Sticker-Liner. Das Rohr ist nun fertig vorbereitete Platte zu erhalten.
3. Produzieren Sie so viele Rohre wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt.

3. Contrive Blutprobe

Hinweis: Wenn ein echter Testprobe vorbereitet wird, gehen Sie zu Schritt 4.

1. Thaw 8E5-LAV - Zellen ¹⁵ eine einzige Kopie der HIV-1 - Provirus erhalten aus der Virologie Qualitätssicherung Labor beherbergen (VQA; Eile Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.).
   Hinweis: sie gespeichert sind, als gefrorene Zellpellets in einer Konzentration von 4.000 Zellen / & mgr; l. Zellzahl wurde zuvor ⁹ wie beschrieben verifiziert.
2. bereiten serial Verdünnungsmedium (90% fötales Rinderserum, 10% Dimethylsulfoxid) auf Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen / ul in einfriert.
3. Pipette 10 ul Zellen aus jedem der seriellen Verdünnungen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Frisch HIV-1 negativen EDTA behandelt Vollblutprobe in jedes Röhrchen 10-4,000 eine Standardkurve von 8E5-LAV-Kopienzahlen zu erstellen. Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen.

4. Führen Sie FINA-Extraktion

1. Lyse Blutzellen durch Zugabe von Triton-X100) bis zu einer Endkonzentration von 1% (11 & mgr; l 10% Triton-X100 bis 110 & mgr; l Vollblut und Zellen aus Schritt 3.3).
2. Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. Das Blut sollte durchscheinend rot.
3. Pipettieren alle der Blutprobe auf die Capture-Platte.
   Hinweis: Eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Paraffin Band und der Einfangmembran stellt sicher, daß das Blut die Membran fließt, und einen guten Kontakt zwischen dem Erfassungs membrane und Schreibunterlage Montage sorgt für eine schnelle Probe Feuchtigkeitstransport.
4. Lassen Sie Probe durch den Filter zu tränken.
   Hinweis: Die Blut-Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Capture-Platte zu erfassen. Das Lysat wurde in die Scheibe eingetaucht, wenn es matt erscheint.
5. In 600-1.000 & mgr; l 10 mM NaOH tropfenweise auf die Capture-Platte.
   Hinweis: Die Pufferwäsche kann auch als bulk Zugabe von 600 & mgr; l zugegeben werden. Der Puffer wird ein Tröpfchen auf dem hydrophoben Paraffinband bilden und in etwa 20 sec auf die Platte durch das Loch Docht. Der Filter wird von rot auf weiß anzeigt, Clearance von Hämoglobin ändern.
6. Trennen Sie die Diskette aus dem Löschblatt mit einer Zange und ziehen Sie die Platte auf das Band in die vorbereitete PCR-Röhrchen. Wenn es eine rote Farbe auf dem Filter hinzufügen, 50-100 & mgr; l Waschpuffer gelassen ist, den Filter zu löschen, bevor in die Röhre platzieren.
   Hinweis: Gelegentlich kam es Überdruck angewendet bei der Herstellung vondie FINA-Module Ergebnisse in Partitionierung der Membranschichten während der Trennung von der Schreibunterlage. Entsorgen Sie diese Disketten und bereiten eine neue Probe.
7. Nachdem der Filter in dem PCR-Röhrchen platziert wird, analysieren die Proben sofort. Alternativ trocken über Nacht in einem Karton mit Calciumsulfat Trocken, dann verschließen und in einen Folienbeutel mit Kieselsäure Trocken- und Speicher bis zur Analyse bereit.

5. qPCR-Reaktion

1. Bereiten Sie 100 ul qPCR Mastermix pro Reaktion unter Verwendung von HIV - spezifische Primer und Sonden , wie zuvor beschrieben ^9,11. Umfassen eine interne Amplifikationskontrolle für die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten Inhibitoren zu überwachen und zu überprüfen, ob eine negative Probe ein wahrer negativ ist. Stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit Mastermix abgedeckt ist und dass der Filter zur Seite des Rohres während der gesamten Reaktions fixiert bleibt.
2. Für die Amplifikation eine Echtzeit - PCR - Gerät , wie zuvor ⁹ beschrieben.

Ergebnisse

Der Workflow für provirale DNA aus Vollblut extrahieren gespickt mit 8E5-LAV - Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die FINA Probenmodul und vorbereitet qPCR Rohr. Dieses Verfahren ermöglicht eine effiziente Amplifikation von HIV-1 - Provirus von 8E5-LAV - Zellen bei unterschiedlicher Kopienzahl, wie in der Standardkurve von künstlich Proben (Figur 3) dargestellt. PCR hatte einen Wirkungsgrad von 103%, wie aus Effi...

Diskussion

EID verbunden schnelle Behandlung Zugang hat sich gezeigt , die Kindersterblichkeit zu reduzieren aufgrund einer HIV - Infektion ^16. Aufgrund der Persistenz der mütterlichen Antikörper bei einem Säugling Blut haben Dienstprogramm schnellen HIV-Antikörper-Tests begrenzt den Status von HIV-exponierten Neugeborenen bei der Bestimmung. Die WHO empfiehlt , dass alle Kinder von HIV-1 - positiven Müttern geboren sollte bei 4-6 Wochen alt getestet werden, eine virologische Test ¹⁷ ​​verwendet wird...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fusion 5	GE Healthcare Life Sciences	8151-9915
707 blotting pad	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR International	52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape	3M Medical Specialties	9965
200 µl qPCR strip tubes	Agilent	401428
optical strip caps	Agilent	401425
Mx3005p qPCR System	Agilent	401456
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. Reagent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin	Thermo Fisher Scientific	16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)	McMaster Carr	3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)	McMaster Carr	3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)	McMaster Carr	3424A23