Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

Резюме

Мы опишем здесь простой и быстрый на бумажной основе метода экстракции ДНК ДНК ВИЧ провирусной из цельной крови обнаружен с помощью количественной ПЦР. Этот протокол может быть расширен для использования в обнаружении других генетических маркеров или с использованием альтернативных методов амплификации.

Аннотация

FINA, изоляция фильтрация нуклеиновых кислот, представляет собой новый способ экстракции, который использует вертикальную фильтрацию для извлечения ДНК клеток из цельной крови менее чем за 2 мин через разделительную мембрану и абсорбирующей прокладки. Образец крови обрабатывают с помощью моющих средств, смешанных кратко и наносится пипеткой на разделительной мембраны. Лизат фитили в промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности разделительной мембраны. Извлеченный ДНК удерживается на мембране во время простой стадии промывки, где ингибиторы ПЦР нечестивы в абсорбирующий блокнот с промокательной бумагой. Мембрана, содержащая захваченный ДНК затем добавляют в реакционную смесь для ПЦР без дополнительной очистки. Этот простой метод не требует лабораторного оборудования и могут быть легко реализованы с помощью недорогих лабораторных принадлежностей. Здесь мы опишем протокол для высокочувствительного обнаружения и количественного определения ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл цельной крови в качестве модели для раннейFant диагностика ВИЧ, которые могут быть легко адаптированы к другим генетическим целям.

Введение

В ряде докладов были обсуждены вопросы развития бумажно или мембран на основе методов извлечения для использования в пункте оказания медицинской помощи (ПСУ) устройства ^1-5 с целью сделать изящную чувствительность и специфичность молекулярной диагностики доступной для всех. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) венерических болезней Инициатива Диагностика ввел термин уверил (Бюджетное, Чувствительный, конкретные, Удобный, быстрый и надежная, оборудование свободные и доставляется к тем, кто в ней нуждается), чтобы описать идеальные характеристики ВОК тест ^6. Из этих руководящих принципов, оборудование свободной характеристикой является особенно сложной задачей для достижения молекулярной диагностики. Тем не менее, каждое нововведение в области будет продвигать цель достичь тех , кто больше всего нуждается, и есть надежда на ближайшую перспективу улучшения в проведении испытания путем адаптации существующих технологий ^7.

Здесь мы опишем простой протокол для экстракции ДНК из цельной кровичто не требует сложной химии или лабораторного оборудования. FINA (фильтрация выделение нуклеиновых кислот) способ подготовки проб был первоначально разработан для извлечения лейкоцитарной ДНК из цельной крови с целью выявления ВИЧ-1 провируса как часть образца до ответа точки оказания медицинской помощи (ПСУ) количественной ПЦР диагностики (ВИЗ) платформа детей раннего возраста (КПЦР) для использования в условиях ограниченных ресурсов ^8-11. FINA добыча отличается от традиционных способов очистки , которые используют кремнеземные мембран или парамагнитные частицы диоксида кремния , покрытые обратимо связывать ДНК в присутствии хаотропных агентов ^12. Вместо этого FINA использует вертикальную фильтрацию с помощью разделительной мембраны для извлечения клеточной ДНК из цельной крови непосредственно. Мембрана , содержащая захваченный ДНК может быть помещена непосредственно в пробирку для ПЦР , и либо непосредственно использовали в реакции ПЦР или сушат на воздухе в течение последующего усиления ^9. Нет хаотропные агенты, фенол, или спирты не используются при экстракции образца, eliminaтин обширные стадии промывки , необходимые для удаления мощные ингибиторы КПЦР , полученные из процесса экстракции ^13,14.

Мембрана FINA может выполнять захват либо клеток ⁹ или геномную ДНК , освобожденные от лизиса клеток ¹¹ до того , как образец добавляется к мембране. Для захвата клетки, цельной крови добавляют непосредственно к мембране. Клетки затем лизируют в мембране путем добавления 10 мМ NaOH. Преимущество этого метода заключается в том, что она включает в себя только 3 шага: 1) образец дополнение; 2) лизис клеток / мытья и 3) размещение фильтра диска в КПЦР трубке. Недостаток этого метода состоит в том, что мембрана может содержать только определенное количество клеток прямо пропорционально диаметру мембранного диска. Для того, чтобы достичь предела обнаружения, требуемого для EID, 100 мкл цельной крови требуется для ввода образца, который влечет за собой фильтр, который слишком велик, чтобы быть помещенной в трубку КПЦР. Лизиса клеток крови с помощью моющего средства перед добавлением образца в коллекциюмембрана добавляет стадию обработки, но позволяет использовать меньший фильтр для того же самого размера образца. Мы смогли продемонстрировать высокую воспроизводимость, одного обнаружения копирования и количественно оценить всего лишь 10 копий ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл крови с помощью этой тестовой конфигурации ^11.

В этом докладе мы опишем FINA протокол, первоначально разработанный для использования в лабораториях. Сэндвич мембрана / фильтр известен как FINA модуль подготовки пробы может быть получен в больших количествах и складированы для последующего использования. При проведении анализа проб должны быть извлечены этот процесс занимает 2 мин и может быть выполнена в различных партий размера. КПЦР может быть запущена немедленно или фильтры, содержащие внедренный ДНК могут быть сохранены до тех пор, пока удобно выполнять КПЦР. Этот метод очень удобен для рутинного анализа образцов в обоих параметрах низких и высоких ресурсов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление по этике: Весь образцы крови, используемые в данном исследовании не рассматриваются как исследования с участием человека. Образцы были получены в клинических диагностических целей, которые были удовлетворены, а оставшаяся часть этих образцов была предоставлена ​​для FINA исследований анализа. Образцы были закодированы таким образом, что следователи не смогли легко установить личность лиц.

1. Получение FINA образца модуля подготовки

1. Приготовьте промокательную прокладку путем разделки 35 х 35 мм ² из 2,6 мм толщиной 100% хлопок колодки. Отрежьте один прокладки в образце.
2. Приготовьте пластмассовую парафиновой пленки с бумажной защитной ленты режущей части парафиновой пленки (25 мм (h) на 50 мм (w)) и затем пробивать отверстие диаметром 7,14 мм в центре ленты с помощью молотка приводом дырокола. Подготовьте одну ленту на образец.
3. Приготовьте сепаратор мембраносвязанными стекла крови (захват мембраны) диск путем пробивки круга диаметром 8,35 ммс помощью молотка приводом дырокола. Удар один диск на образце. Диск имеет удерживающую способность частиц 2,3 мкм.
4. Собирают модуль подготовки проб FINA путем размещения захвата диска в центре блоттинга колодки с помощью щипцов. Поместите парафиновой пленки ленту над диском захвата так, чтобы отверстие парафинового ленты покидает центр диска захвата открытой.
5. Обеспечить максимальный контакт между диском и промокательной прокладки, слегка растягивая парафиновую пленку, чтобы покрыть промокательной площадку и нажав на парафиновую пленку твердо придерживаться ее на промокательной прокладки вокруг всех краев диска.
6. Сделать столько модулей, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.

2. Получение КПЦР Tube

1. Подготовьте ленточный диск 5,1 мм, что якорь мембраны захвата клеток к стороне трубки КПЦР, чтобы предотвратить мембрану от блокирования посредством флуоресцентной детекции путем пробивки круг двойной оболочкой ПолеSter диагностическую ленту с молотка приводом удар из листа ленты. Подготовьте один ленточный диск на образце.
2. Удалите одну сторону наклейки лайнера ленте в. Поместите ленту в 200 мкл ПЦР-пробирку, приклеить ее на одну сторону, и в сторону нижней части трубы. Удалите вторую наклейку лайнера. Трубка теперь готова получить подготовленный диск.
3. Производить столько трубок, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.

3. изловчиться образцы крови

Примечание: Если настоящий испытательный образец готовится, перейдите к шагу 4.

1. Оттепель клетки 8e5-LAV ¹⁵ , несущие одну копию провируса ВИЧ-1 , полученные из лаборатории вирусологии обеспечения качества (VQA; Rush Presbyterian / St медицинский центр Луки, Чикаго, Иллинойс.).
   Примечание: Они хранятся в виде замороженных гранул клеток в концентрации 4000 клеток / мкл. Количество клеток проверено , как описано выше ^9.
2. Подготовка серМВЛ разведение в замораживании среды (90% эмбриональной бычьей сыворотки, 10% диметилсульфоксиде) в диапазоне концентраций от 1 до 400 клеток / мкл.
3. Пипеткой 10 мкл клеток от каждого из серийных разведений в микроцентрифужных трубки. Добавьте 100 мкл свежей ВИЧ-1 отрицательный ЭДТА обработанной пробы цельной крови в каждую пробирку, чтобы создать стандартную кривую числа копий 8e5-LAV 10-4,000. Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз.

4. Выполните FINA Extraction

1. Клетки Лизируйте крови путем добавления Triton-X100) до конечной концентрации 1% (11 мкл 10% Тритона-X100 до 110 мкл цельной крови и клеток со стадии 3.3).
2. Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз. Кровь должна превратить полупрозрачный красный.
3. Пипетируйте образца крови на диске захвата.
   Примечание: водонепроницаемое уплотнение между парафином лентой и мембраной захвата гарантирует, что кровь течет через мембрану, и хороший контакт между захвата мembrane и промокательной площадку сборки обеспечивает быстрый образец затекание.
4. Разрешить образец, чтобы впитать через фильтр.
   Примечание: лизата крови фитили Into промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности диска захвата. Лизат впиталась в диск, когда он появляется матовость.
5. Добавить 600-1000 мкл 10 мМ NaOH по каплям на диск захвата.
   Примечание: Промывочный буфер также может быть добавлен в качестве сыпучего добавлением 600 мкл. Буфер будет образовывать капли на гидрофобной парафиновой ленту и фитиль через отверстие в диске примерно за 20 сек. Фильтр будет меняться от красного до белого с указанием зазора гемоглобина.
6. Отделить диск из промокательной прокладки с пинцетом и нанесите диск на ленту в подготовленную для ПЦР пробирку. Если есть красный цвет, оставленный на фильтре добавляют 50-100 мкл промывочного буфера, чтобы очистить фильтр перед размещением в трубке.
   Примечание: Нечасто, избыточное давление, применяемое в ходе подготовкиФИНА модулей приводит к разделения мембранных слоев во время отделения от промокательной прокладки. Выбросьте эти диски и готовить свежий образец.
7. После того, как фильтр помещают в пробирку для ПЦР, анализируют образцы сразу. В качестве альтернативы, сухой в течение ночи в коробке, содержащей сульфат кальция осушителя, а затем колпачок и поместить в пакет из фольги с диоксидом кремния осушителя и хранят до готовности для анализа.

5. КПЦР реакции

1. Подготовьте 100 мкл КПЦР мастер смеси в реакции с использованием ВИЧ - специфических праймеров и зондов , как описано выше ^9,11. Включите внутренний контроль усиления для контроля за наличием ингибиторов амплификации и убедиться, что отрицательный образец является истинным отрицательным. Убедитесь, что фильтр полностью покрыт мастер-смеси и что фильтр остается фиксированной на стороне трубки в течение всей реакции.
2. Выполнение амплификации с использованием ПЦР в реальном времени устройство , как было описано выше ^9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рабочий процесс для извлечения провирусной ДНК из цельной крови с добавленными 8e5-LAV клеток показано на рисунке 1. На рисунке 2 показан модуль образца FINA и подготовил КПЦР трубку. Этот метод позволяет эффективно амплификации ВИЧ-1 провируса из 8e5-LAV кле?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ВИЗ связан с быстрым доступом к лечению было продемонстрировано для снижения детской смертности из - за ВИЧ - инфекции ^16. Из-за сохранения материнских антител в крови младенца, экспресс-тесты на ВИЧ антитела имеют ограниченную полезность в определении статуса ВИЧ младенцев. ВОЗ р?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fusion 5	GE Healthcare Life Sciences	8151-9915
707 blotting pad	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR International	52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape	3M Medical Specialties	9965
200 µl qPCR strip tubes	Agilent	401428
optical strip caps	Agilent	401425
Mx3005p qPCR System	Agilent	401456
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. Reagent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin	Thermo Fisher Scientific	16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)	McMaster Carr	3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)	McMaster Carr	3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)	McMaster Carr	3424A23