JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحديات بالغة الأهمية للبحث ميداني مرض السكري لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم جزيرة تكرار β خلايا وتطوير طرق لتحفيز تجديد خلايا بيتا. هنا طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد وتقييم وقدم النشاط ودعم تكرار β-خلية من جزيئات صغيرة.

Abstract

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Introduction

مرض السكري يشمل مجموعة من الاضطرابات تقاسم نقطة النهاية المشتركة للتوازن الجلوكوز تعطلت. على الرغم من أن الآليات المسببة للأمراض من أنواع فرعية مرض السكري تختلف، إلا أنهما يشتركان نتيجة لانخفاض كتلة خلايا بيتا، أي فقدان القدرة على إنتاج الأنسولين 1،2. في الوقت الحاضر، واستراتيجيات علاج مرض السكري تعتمد على إدارة المزمنة من الأنسولين خارجي، وتحفيز الصيدلانية إنتاج مادة الأنسولين أو تعزيز الحساسية للانسولين، ونادرا ما، وزرع جزيرات البنكرياس أو كله البنكرياس 3،4. وللأسف، فإن نجاح هذه الاستراتيجيات قصيرة الأمد و / أو يفشل في تلخيص بما فيه الكفاية وظيفة إنتاج الأنسولين الذاتية. وعلى الرغم من فائدة من تطوير طريقة لتحفيز تجديد خلايا بيتا، لا يوجد نهج من هذا القبيل. ونتيجة لذلك، وهو هدف أبحاث مرض السكري الرئيسي هو تطوير طرق لتوليد خلايا β جديدة أو لتوسيع الذاتية β خلايا كتلة 5 . على الرغم من تجديد β خلايا من مصادر الطاقة المتجددة مثل الخلايا الجذعية الجنينية تتقدم، مخاوف تتعلق بالسلامة والكفاءة تجعل السعي الاستراتيجيات البديلة، بما في ذلك توسيع β خلايا ناضجة، أولوية 6،7. الأهم من ذلك، المصدر الغالب للخلايا β جديدة في الجسم الحي هو موجودة من قبل خلايا β بدلا من الخلايا الاصلية المتخصصة 8،9. على الرغم من أن β خلايا يبدو أن لديها قدرة محدودة النسخ، زيادة صغيرة في كتلة β خلايا (~ 30٪) قد تكون كافية لاستعادة توازن الجلوكوز في كثير من مرضى السكر. وعلاوة على ذلك، في تحفيز الصيدلانية الموقعي من كتلة β-الخلية هو استراتيجية المعاملة التي قد تكون غير مكلفة وقابلة للتطوير. وهنا يرد طريقة فحص عالية المحتوى من أجل تحديد وتوصيف جزيئات صغيرة التي تحفز نمو خلايا بيتا.

ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من في المختبر الطرق التجريبية لتحديد المنتجات الجينات و / أو جزيئات ثار تشجيع تكرار β خلايا الأساسي. الجهود المبكرة لقياس خلايا بيتا تكرار الحث المستخدمة الجنين الثقافة القوارض بنكرياسات أو سليمة الثقافات جزيرة معزولة لقياس [3 H] التأسيس الثيميدين، BrdU التأسيس أو هيئات الإنقسامية داخل ألدهيد-thionine أو الأنسولين السكان الملون في استجابة لظروف علاج محدد 10، 11. هذه الأساليب في المختبر، والمتغيرات وثيقة يكون لها العديد من القيود. وتشمل أوجه القصور البارزة (1) استخدام الخلايا الجنينية التي، على عكس β خلايا ناضجة، عرض وارتفاع معدل تكرار β-الخلايا القاعدية وهي النمو ينظم بطريقة متميزة 12؛ (2) طبيعة الشخصية للتحكيم التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β-الخلية؛ (3) العمل وطبيعة مكثفة وقت العد التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β خلايا يؤخر الإنتاجية التجريبية. (4) استخدام النووي التأسيس / وصمة عار / مظهر لتحديد تكرار حتىالخبر وصمة عار هيولي غير متداخلة لتحديد خلايا بيتا يؤدي إلى misattribution من أحداث النسخ المتماثل غير β خلايا المباشرة لبيتا خلايا.

وفي الآونة الأخيرة تم استخدام ناضجة خلايا β الأولية لتقييم أثر التحوير الإفراط في التعبير وكذلك علاج الجين المنتج أو مركب على النسخ المتماثل β خلايا 13-16. ومع ذلك، فقد اعتمدت هذه الدراسات أيضا على العد شخصي لأحداث النسخ المتماثل، staining- حشوية أو غير محددة اساليب تحديد β خلايا و / أو خطوات كثيفة العمالة التي تحد من الإنتاجية، على سبيل المثال، الفردي الطلاء الشرائح جيدا من الخلايا أو جزيرة سليمة تضمين البارافين وتجهيز 17. والجدير بالذكر، وهو الإنسان β-خلية منهجية فرز تكرار الصورة القائمة، مماثلة لتلك الواردة في هذه الوثيقة، تم نشر 18. ومع ذلك، لم يثبت الاستخدام الناجح لهذا الاختبار واستخدام الجزر الإنسان لغربلة أولية قد لا تكون على نطاق واسع الهيئة الاتحادية للبيئةsible.

استراتيجية بديلة لتحديد المواد المعززة للتكرار هو تقييم تحريض نمو خطوط β-الخلية. الجهود الأولية المستخدمة تحولت β خلايا خطوط مثل min6 الخلايا أو INS 832/13 خلايا 14،19-21. ومع ذلك، هذه خطوط الخلايا تظهر النمو غير المقيد وتحمل شبها جيدا متباينة β خلايا 22. ونتيجة لذلك، والقدرة على النمو الاستقراء هو الحد الأدنى، من أهمية واضحة وصعبة في بعض الأحيان أن ألخص. استراتيجية محسنة لفحص المستندة إلى خط الخلية يستخدم "تحويل عكسية" الخلايا التي هي نمو اعتقل في غياب التتراسيكلين (الدوكسيسيكلين) معتمد على SV40 المستضد T التعبير 23،24. ومع ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت هذه الخلايا تعود إلى "طبيعية" حالة شبيهة β-خلية على إزالة الدوكسيسيكلين. للأسف، واستخدام هذه الخلايا قد حقق المركبات المعززة للنمو المعممة التي لا يبدو أن لها فائدة فورية24. وعموما، قد يكون استخدام خطوط الخلايا لدراسة تنظيم نمو الخلية من نوع عرض الحد الأدنى من النشاط تكرار عفوية محدودة التطبيق.

وβ خلايا تكرار منصة فحص المقدمة هنا تستخدم الناضجة الفئران الأساسي β خلايا للاحتفاظ في تنظيم نمو الجسم الحي إلى أقصى حد ممكن والثقافات جزيرة الخلية المختلطة تكوين خلية من نوع لتمكين تحديد الأنشطة المعززة للنمو المقيدة النسب، متعددة -well تهيئة إلى تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية وتحليل الآلي للقضاء على التحيز وتسهيل الإنتاجية. وقد مكن الاستخدام الناجح لهذه المنصة تحديد العديد من المركبات التي تعزز تكرار خلايا بيتا 25،26. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام فحص للدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط والتجارب قشوة الكيميائية لتقديم رؤى الآلية في تنظيم الجزيئي للتكرار β-الخلية. تم تعديل منصة عرض بنجاح FOالتحقيق استنادا رني ص lentiviral النسخ المتماثل β خلايا الممرات 25. وتشمل القيود المفروضة على فحص قابلية محجوب (استخدام الخلايا الأولية)، واستخدام القوارض بدلا من جزيرة خلايا الإنسان (على الرغم من أن الفحص يمكن تكييفها للدراسات جزيرة الإنسان)، والنفقات المرتبطة التصوير القائم على الأجسام المضادة واستخدام جزيرة الأساسي، واستخدام من الجزر المتناثرة (تعطلت العمارة جزيرة) لتسهيل الحصول على الصور الآلي والاعتماد على توافر المجهر الآلي مع الحصول على الصور والقدرة على التحليل. على الرغم من أن سطحي جدا في الجسم الحي منهجية الفرز لتحديد المنتجات الجينات أو المركبات التي تحفز تجديد الخلايا بيتا في الموقع سيكون امرا مثاليا، مثل هذا المنبر ليست متاحة بعد 27. وبالتالي، فإن منصة وصف مناسبة للباحث مهتم في التحقيق في معظم جوانب تكرار β-الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجري هذا البروتوكول وفقا للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ستانفورد كلية الطب. يتم تحجيم بروتوكول صفها لعزل جزيرة من ستة 250-300 غرام (8-9 أسابيع من العمر) ذكور فئران سبراغ داولي، وهو ما يكفي لتوليد 228 بئرا من لوحة 384 جيدا لتقييم تكرار جزيرة خلايا.

1. تحضير المواد

  1. إعداد وسائل الاعلام الطلاء قبل الشروع في عزلة الجزيرة عن طريق جمع وسائل الإعلام مكيفة من 804G خلايا سرطان المثانة الفئران الحفاظ على التقاء لمدة 3 أيام (20 مل من RPMI1640) في 15 سم صحن زراعة الأنسجة 28. تصفية العقيمة وتخزينها (-20 درجة مئوية) وسائل الإعلام مكيفة لاستخدامها لاحقا.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية (واحد 12 سم ملقط الأنسجة مسننة، واحدة 11.5 سم مقص غرامة، واحدة 14.5 سم مقص جراحي، وهما 16 سم ملقط المنحنية، واحد 12 سم مرقئ المنحني، واحد 12 سم مقبض مشرط) واحد غربال الأنسجة 30 شبكة قبل الحرف الأولiating عزل خلايا البنكرياس.
  3. يعد حل الهضم البنكرياس عن طريق إذابة 60٪: 40٪ خليط من الدرجة النقاء الأول: الطبقة collagenases الثاني (إجمالي النشاط كولاجيناز 300،000 - 400،000 وحدة) في 60 مل من 1X هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) تستكمل مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تحميل 10 مل من العازلة الهضم البنكرياس إلى 10 مل المحاقن (ستة) مع 1 "22 G إبرة ومكان على الجليد.
    ملاحظة: يتم حقن 10 مل من محلول الهضم في الفئران. حجم وفقا لذلك.
  4. إعداد 4.5 مل من كوكتيل مخدر في غطاء التهوية عن طريق خلط 1.3 مل من الكيتامين (100 ملغ / مل)، 0.2 مل من زيلازين (100 ملغ / مل) و 3 مل من برنامج تلفزيوني. تحضير كوكتيل مخدر داخل 1 ساعة من بدء العزلة جزيرة.
  5. إعداد غسل العازلة بإضافة 25 مل من مصل العجل إلى 500 مل من HBSS. ضع غسل العازلة على الجليد لاستخدامها لاحقا.
  6. إعداد 1 زجاجة متوسطة جزيرة وهو 500 مل من انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 50 مل الجنين المصل البقري (FBS)، 5000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
  7. إعداد جزيرة ظيفة المتوسطة من حل وظيفة / الجدوى (500 مل) مع 2٪ FBS، 2 مم الجلوتامين، 5 ملي الجلوكوز، 5000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. تخزين وسائل الإعلام وظيفة جزيرة (4 درجة مئوية) لاستخدامها لاحقا.
  8. إعداد 40 مل عازلة تمنع عن طريق إضافة 2.5 مل مصل حمار و 0.12 مل تريتون X-100-37،38 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن عازلة تمنع (4 درجة مئوية) لاستخدامها لاحقا.
  9. الحصول على الأجسام المضادة المطلوبة قبل الشروع في البروتوكول.
    ملاحظة: يستخدم PDX-1 (TRITC) وكي-67 (FITC) شارك في تلطيخ لفحص تكرار β خلايا الأساسي. لتحليل النسخ المتماثل نسب محددة، نفذ المناعي تلطيخ لعلامات إضافية هوية الخلية (الأنسولين، الجلوكاجون، فيمنتين أو السوماتوستاتين، TRITC) جنبا إلى جنب مع، PDX (Cy5) وكي-67 (FITC) تلطيخ النووية (دابي). مندوب البديلعلامات lication، على سبيل المثال، بكنا، ويمكن أيضا أن تستخدم.
  10. إعداد خطة العلاج 228 بشكل جيد مع كل حالة العلاج التي أجريت في quadruplicate. تشمل positive- (5 Iodotubercidin [1 ميكرومتر] أو ديبيريدامول [15 ميكرومتر]) وسيارة تحكم ([دمس 1: 666 تمييع) بئرا.

2. الإرواء من البنكرياس

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من حل كوكتيل مخدر المخفف (0.30 مل / 100 غرام من وزن الجسم). وبمجرد أن الفئران هو تخدير كامل وغير مستجيب للمؤثرات الضارة، نفذ خلع عنق الرحم.
  2. وضع فأر الموت الرحيم في موقف (اتجاه الجمجمة، الذيلية) ضعيف على كومة من منشفة ورقية ورش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
  3. فتح تجويف البطن مع U-شق (قاعدة في منطقة العانة) وسحب الجلد في اتجاه منقاري على الصدر للكشف عن تجويف البطن.
  4. بعناية والاستيلاء على الاثني عشر باستخدام اثنين من أزواج من ملقط المنحنية، موقع الإدخال الاثني عشر للب مشتركةقناة إيل (مصرة أودي) والمشبك افتتاح الاثني عشر في حليمة مع مرقئ المنحني.
  5. رفع مرقئ المنحني تستخدم لكبح القناة الصفراوية المشتركة حليمة والاستيلاء على القناة الصفراوية بالقرب الكبد باستخدام ملقط المنحنية. استخدام تشريح حادة مع ملقط منحنية لعزل وفضح القناة الصفراوية.
  6. إعادة الفئران مع الداني الرأس والقدمين البعيدة.
  7. يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة (CBD) في أو مجرد البعيدة إلى تقاطع القنوات الكبدية الكيسي والمشتركة مع حل هضم البنكرياس -loaded 10 حقنة مل وحقن ببطء 10 مل من محلول الهضم البنكرياس. في حين حقن، ودعم اتفاقية التنوع البيولوجي مع مقبض مشرط. إعادة الإبرة إذا كان لاصق والبنكرياس تفشل لتضخيم.
  8. إزالة البنكرياس تضخم باستخدام ملقط المنحنية ومقص غرامة لفصلها من القولون النازل والأمعاء والمعدة والطحال. وضع البنكرياس مضخمة على الجليد في أنبوب 50 مل تحتوي على 5 مل من البنكرياس حل الهضم.
    ملاحظة: للحصول على أقصى قدر من العائد جزيرة، وجمع كل بنكرياسات في غضون 30 دقيقة ومكان فقط 1 أو 2 بنكرياسات في كل أنبوب 50 مل الهضم.

3. التفكك من البنكرياس

  1. مرة واحدة يتم جمع جميع بنكرياسات، وضع أنابيب الهضم إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 15 دقيقة. دوامة بلطف الأنابيب كل 3 دقائق.
  2. بعد 15 دقيقة، هزة بقوة (عموديا) الأنابيب 10 مرات، وإضافة 10 مل من العازلة غسل الباردة. هزة بقوة أنابيب ل5 مرات إضافية، ووضع على الجليد.
  3. ملء أنابيب الهضم إلى 50 مل مع العازلة غسل الباردة ومزيج من قلب أنابيب 5 مرات.
  4. أنابيب الطرد المركزي في 97 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتصب قبالة طاف. يجب الحرص على عدم طرد الأنسجة مكعبات.
  5. إضافة 25 مل العازلة غسيل وإعادة تعليق الأنسجة قبل vortexing بلطف. كرر الخطوات من 3.4 و 3.5 ضعف أكثر.
  6. وضع غربال الأنسجة 30 شبكة على شارعerile 250 مل دورق وتصب تعليق الأنسجة على غربال. شطف أنبوب الهضم مع 20 مل إضافية من غسل العازلة وتصب على شبكة. تتم إزالة أنسجة البنكرياس والدهون غير المهضومة في هذه الخطوة.
  7. صب المواد التي تمت تصفيتها إلى قسمين جديدة 50 مل أنابيب وبيليه الأنسجة عن طريق الدوران في 97 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب طاف وعكس أنابيب لتصريف عازلة الزائد.

4. تنقية من الجزر

  1. إضافة 20 مل من البرد polysucrose / الصوديوم محلول دياتريزوات (1.119 غرام / مل الكثافة) للأنسجة البنكرياس مكعبات. متجانس اعادة تعليق محتويات كل أنبوب من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا خمس مرات.
  2. تراكب بلطف الحل دياتريزوات polysucrose / الصوديوم مع 10 مل HBSS. الحفاظ على واجهة حادة السائلة بإضافة ببطء HBSS على طول الجدار أنبوب.
  3. الطرد المركزي بنكرياسات يهضم في 560 x ج لمدة 15 دقيقة (4 درجة مئوية) مع تسارع بطيء وليس الفرامل.
  4. شاركllect طبقة جزيرة من واجهة استخدام 10 مل ماصة ومكان الجزر في جديدة 50 مل أنابيب. لا تجمع الجزر في هذه المرحلة.
  5. إضافة 40 مل من غسل العازلة إلى كل أنبوب 50 مل وتدور لمدة 1 دقيقة في 140 x ج في 4 درجات مئوية.
  6. تخلصي من طاف واعادة تعليق الجزر المجمعة في 50 مل من غسل العازلة التي كتبها قلب الأنابيب عدة مرات. أنابيب الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 97 x ج في 4 درجات مئوية لجمع الجزر في بيليه.
  7. تخلصي من غسل العازلة وتكرار الغسيل. جلب الجزر في نسيج الثقافة هود ونضح طاف.
  8. اعادة تعليق كل أنبوب من الجزر في 6 مل من المتوسط ​​جزيرة.
  9. نقل الجزر من كل أنبوب 50 مل في بئر من ستة جيدا طبق زراعة الأنسجة. دوامة طبق من 6 جيدا لجمع الجزر في منتصف البئر ومراقبة الجودة جزيرة والنقاء تحت المجهر.
  10. جمع يدويا الجزر باستخدام مل ماصة 1 و نقل الجزر التقطت في متاخمةكذلك تحتوي على 6 مل من وسائل الاعلام خلايا البنكرياس. ويتحقق كرر دوامات جزيرة واختيار حتى> 90٪ النقاء.
  11. نقل الجزر النقية إلى صحن زراعة الأنسجة 10 سم تحتوي على 20 مل من المتوسط ​​جزيرة.
  12. مكان الجزر في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) بين عشية وضحاها (الشكل 1A).
  13. في إعداد خلايا الطلاء خلايا البنكرياس، ومعطف الآبار من 384 لوحة جيدا مع 40 ميكرولتر من 804G وسائل الإعلام مكيفة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة.

5. تشتت والتصفيحات من الخلايا جزيرة

  1. في اليوم التالي، فصل بلطف الجزر من طبق 10 سم مع مكشطة خلية ونقلها الجزر في أنبوب 50 مل.
  2. بيليه الجزر بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 22 x ج في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف.
  3. يغسل الجزر مع 20 مل من برنامج تلفزيوني الدافئ وصب على النحو الوارد أعلاه.
  4. اعادة تعليق الجزر في 0.25٪ التربسين (150 ميكرولتر في البنكرياس الفئران)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ماصة الجزر صعودا وهبوطا 10 مرات باستخدام 1 مل ماصة بعد 5 و 10 دقيقة من الحضانة.
  5. بعد 10 دقيقة، وتقييم عينة 20 ميكرولتر من الجزر trypsinized تحت المجهر لضمان الهضم الكامل والاعتماد على الخلايا جزيرة باستخدام عدادة الكريات. إذا ظلت الجزر غير مهضوم، ومواصلة حضانة لعدد إضافي من 3-5 دقيقة وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات أكثر. كرر حسب الضرورة.
    ملاحظة: العائد نموذجي هو ~ 125،000 - 150،000 جزيرة الخلايا في الفئران.
  6. إزالة 804G مكيفة المغلفة وسائل الإعلام 384 لوحة جيدا من الحاضنة وإزالة الوسائط باستخدام الشافطة المتعددة 12-جيدا.
  7. تعليق الخلايا خلايا البنكرياس في مناطق ذات كثافة من 45،000 خلية لكل ميليلتر في جزيرة ظيفة المتوسطة ولوحة 70 ميكرولتر (3،150 خلايا) لكل بئر مع ماصة الأقنية (الشكل 1B).
    ملاحظة: لأن β خلايا تقع في الآبار الخارجية تميل إلى الهجرة نحو محيط الصفوف استخدام لوحة C إلى N والأعمدة 421 لوحة 228 بئرا مع جزيرة خلايا معزولة من 6 الفئران.
  8. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 48 ساعة للسماح للالتصاق الخلية.

6. جزيرة خلية ثقافة العلاج، التثبيت وتلطيخ

  1. إعداد 200 ميكرولتر من السيارة والمركبات (يتم تنفيذ شروط العلاج في quadruplicate) في تركيز 2X في وظيفة جزيرة المتوسطة. ترتيب المركبات في العقيمة لوحة 96-جيدا لتسهيل متعددة جيدا pipetting ل.
  2. إزالة بعناية متوسطة جزيرة مع الشافطة المتعددة 12 جيدا واستبدال المتوسطة وظيفة جزيرة (35 ميكرولتر / جيد) باستخدام ماصة 12-جيدا. إزالة واستبدال وسائل الإعلام من صف واحد في وقت واحد للحد من خطر الجفاف (الشكل 1C).
  3. بدء العلاج عن طريق نقل 35 ميكرولتر / بئر الحلول مجمع 2X. العودة لوحة الحاضنة لمدة العلاج 48 ساعة.
  4. بعد 48 ساعة من العلاج، صب سائل الإعلام العلاج قلب اللوحة.
  5. يغسل بلطف الخلايا جزيرة مع 50 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني 1X (1 دقيقة). إضافة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة متعدد القنوات.
  6. صب برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  7. غسل الخلايا ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) من قلب لوحة لإزالة PFA وإضافة بلطف 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر على النحو الوارد أعلاه.
  8. إعداد 15 مل مستضد حل استرجاع عن طريق خلط 14.25 مل الفورماميد و 0.75 مل 0.15 M سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6). جعل حل استرجاع المستضد مباشرة قبل الاستعمال.
  9. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار عن طريق عكس لوحة وإضافة 60 ميكرولتر حل استرجاع مستضد إلى كل بئر. تسخين لوحة في 70 ° C حمام الماء لمدة 45 دقيقة. وضع كتلة التدفئة في أعلى لوحة خلال هذه الحضانة لمنع تزييفها لوحة متعددة أيضا.
    ملاحظة: يجب أن يكون الماء في منتصف الطريق حتى تنورة وحة؛ لا ينبغي أن تكون مغمورة لوحة.
    10. إزالة لوحة من الحمام المائي والسماح لتبرد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن لوحة لا مشوه عن طريق التفتيش البصري.
  10. غسل الخلايا مع 60 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما). إضافة برنامج تلفزيوني مع ماصة متعدد القنوات وصب برنامج تلفزيوني من قلب اللوحة.
  11. استخدام ماصة متعدد القنوات لإضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من العازلة الحجب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المنطقة العازلة الحجب التي كتبها قلب لوحة والصب.
  12. إضافة 40 ميكرولتر من الماوس مكافحة الإنسان كي-67 (1: 200) والماعز مكافحة الإنسان PDX-1 (1: 100) الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة إلى كل بئر واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  13. في اليوم التالي، صب الحل مكافحة الجسم وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) كما هو موضح أعلاه. صب برنامج تلفزيوني.
  14. إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من المخفف (1: 200) المعقدة البيروكسيديز حمار المضادة للماوس مفتش وحمار رودامين مترافق مكافحة الماعز مفتش في عرقلة العازلة. احتضان لمدة 1 ساعةبدرجة حرارة الغرفة.
  15. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما. إضافة 40 ميكرولتر من المخفف (1: 400 في عرقلة العازلة)، فلوريسئين مترافق streptavidin إلى كل بئر. احتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  16. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما. إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من دابي (300 نانومتر في عرقلة العازلة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  17. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X مرتين وترك الخلايا في 40 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. لوحة هي الآن جاهزة لتحليلها.

تحليل النسخ المتماثل 7. β خلية

ملاحظة: يجب أن يتم إنشاء لبروتوكول فحص لارتفاع مجهر فحص المحتوى المستخدمة لقياس تكرار خلايا بيتا. في تكوينه أبسط، وهذا البروتوكول هو فحص اللونين حيث يتم استخدام علامة هوية لتحديد خلايا بيتا يستخدم (PDX-1 + -cells) وعلامة التكرار (كي-67) لتحديد الأحداث انقسام الخلايا.

  1. تحديد الكائنات (β خلايا) استنادا إلى averagه كثافة مضان من PDX-1 تلطيخ (549 فلتر نانومتر) ضمن دائرة التقريبية (الطول: العرض <1.6) داخل منطقة بكسل المتوقعة من نواة β-الخلية (الشكل 2A).
  2. بعد ذلك، وضع الإعدادات لتحديد الأحداث التكرار (كي-67-الإيجابية) على أساس متوسط ​​كثافة مضان (485 فلتر نانومتر) داخل PDX-1 + المنطقة (الشكل 2B).
    يجب أن تكون ثابتة مرات التعرض للسماح مقارنات بكسل الكثافة عبر الصور: مذكرة. يتم تعديل المعلمات بروتوكول الفحص بحيث المكالمات آلة يستبعد باستمرار تلطيخ والحطام والركام الخلايا غير محددة التي يمكن أن تؤثر سلبا على جودة البيانات.
  3. تحليل ما لا يقل عن 500 β خلايا لكل بئر إلى تحقيق أقصى قدر من الدقة والحد من التقلبات.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون 0.5 المؤشر تكرار β-الخلايا القاعدية في الثقافات جزيرة الفئران - 3٪. عادة، 40 صور لكل بئر هي أكثر من كافية لتحديد 500 β-الخلايا.
  4. قبل تحليللوحة كاملة، وتحليل negative- مختارة (المعالجة DMSO) والسيطرة الايجابية (5 iodotubercidin [1 ميكرومتر] أو ديبيريدامول [15 ميكرومتر]) المعالجة بالإثير الآبار لتقييم صلاحية بروتوكول الفحص. عندما يثبت الفحص بشكل صحيح، ومركبات مراقبة إيجابية تحفز على الأقل زيادة شقين في نسبة تكرار β-الخلايا.
  5. قراءة لوحة كاملة بمجرد التحقق من صحة بروتوكول الفحص.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتقييم β-الخلية أو تكرار α خلايا، مطلوب بروتوكول فحص أربعة ألوان. أولا، ويتم تحديد الكائنات عن طريق تلطيخ دابي (القناة 1، 386 نانومتر). بعد ذلك، يتم عد β خلايا (الحدث 1): الكائنات التي تشترك في التعبير عن PDX-1 + (القناة 2، 650 نانومتر) والأنسولين شبه الن?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطرق التجريبية لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وبيتا وتجديد أدوات مهمة للباحثين مرض السكري. هنا، يتم تقديم منصة الفحص القائمة على الفئران جزيرة لتحديد وتوصيف التحفيز والتشجيع جزيء صغير من تكرار β-الخلية.

في ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
250 g male Male Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 cm teeth tisuue forcepsFine Science Tools11021-12
11.5 cm fine scissorsFine Science Tools14058-11
14.5 cm surgical scissorsFine Science Tools14001-14
16 cm curved forcepsFine Science Tools11003-16
12 cm curved hepostatFine Science Tools13011-12
12 cm scalpel handleFine Science Tools10003-12
Tissue sieve-30 meshBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA unitsVitaCyte005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)Gibco24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077SigmaH-1077to make histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 mlHycloneSH30118.03
Hanks' Balanced Salt solutionHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose HycloneSH30021.01
Functionality/Viability Solution Mediatech99-768-CV
RPMI1640 media HycloneSH30096.01to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-lineAvailable upon requestto make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) MP Biomedicals1670049
Formamide 500 mlFisher BioReagentsBP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)Vector LaboratoriesH-3300to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, AnhydrousEMD ChemicalsDX0145-1to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibodyBD Biosciences556003
Goat anti-human PDX-1 antibodyR&D SystemsAF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibodyDako2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibodyDako2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibodyDako2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibodyabcamab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated InvitrogenS32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Disposable Reagent Reservoir 25 mlSorenson BioScience39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plateBD Falcon353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plateCostar3603
Multi-channel pipettorCostar4880
12-channel vaccume aspiratorDrummond3-000-096
Cell ScraperFalcon353085
Isotemp Water Bath Model 2223 Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTIThermo Scientific

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600(2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113 67 PDX 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved