Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Zusammenfassung

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Zusammenfassung

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Einleitung

Diabetes umfasst eine Sammlung von Störungen des gemeinsamen Endpunktes gestörter Glukose-Homöostase zu teilen. Obwohl die pathogenen Mechanismen von Diabetes - Subtypen unterschieden sind, sie die Folge einer verminderten β-Zellmasse teilen, dh Verlust von Insulin Produktionskapazität ^1,2. Derzeit verlassen Diabetes Behandlungsstrategien auf die chronische Verabreichung von exogenen Insulin, pharmakologische Stimulation der Insulinproduktion oder Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und in seltenen Fällen die Transplantation von Pankreas - Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse ^3,4. Leider ist der Erfolg dieser Strategien ist von kurzer Dauer und / oder nicht in ausreichendem Maße die Funktion der endogenen Insulinproduktion rekapitulieren. Trotz der Nützlichkeit, ein Verfahren zur Entwicklung von β-Zell-Regeneration zu stimulieren, kein solcher Ansatz vorhanden ist. Folglich ist ein wichtiges Ziel der Diabetesforschung , Methoden zu entwickeln neue β-Zellen zu erzeugen , oder endogene β-Zellmasse ⁵ zu erweitern . Obwohl β-Zellregeneration aus erneuerbaren Quellen wie embryonale Stammzellen voranschreitet , Sicherheit und Effizienz betrifft , um die Verfolgung alternativer Strategien, einschließlich der Erweiterung der reifen β-Zellen, eine Priorität ^6,7. Wichtig ist , ist die vorherrschende Quelle von neuen β-Zellen in vivo vorbestehenden β-Zellen und nicht spezialisierte Vorläuferzellen ^8,9. Obwohl β-Zellen begrenzte Replikationskapazität, eine geringe Zunahme der β-Zellmasse zu haben scheinen (~ 30%) ausreichend sein Glucosehomöostase in viele Diabetiker wiederherzustellen. Darüber hinaus ist in situ pharmakologische Stimulation der β-Zellmasse eine potentiell kostengünstige und skalierbare Behandlungsstrategie. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Molekülen, die β-Zellwachstum stimulieren dargestellt.

Eine Vielzahl von in vitro experimentellen Methoden verwendet werden können Genprodukte und / oder Moleküle zu identifizieren , That fördern primäre β-Zell-Replikation. Frühe Bemühungen für β-Zell - Replikation Induktionsmessung verwendet fötalen Nagetier Bauchspeicheldrüsen Kultur oder intakte isolierte Inselkulturen zu messen ^[3 H] Thymidin - Einbau, BrdU - Einbau oder mitotischen Körper innerhalb der Aldehyd-Thionin oder Insulin gefärbten Population als Reaktion auf bestimmte Behandlungsbedingungen ^{10, 11.} Diese in - vitro - Ansätze und nahe Varianten davon haben einige Einschränkungen. Prominent Mängel umfassen (1) die Verwendung von fetalen Zellen , die, im Gegensatz zu reifen β-Zellen, eine hohe basale ¹² in einer bestimmten Weise reguliert β-Zellreplikationsrate und das Wachstum anzuzeigen; (2) die subjektive Natur der Experimentator abhängigen Jurierung von β-Zellen-Replikationsereignisse; (3) die arbeits- und zeitintensiv Natur der Experimentator abhängige Zählung von β-Zellen-Replikationsereignisse verzögert experimentellen Durchsatz; (4) die Nutzung der Kern Einbau / Fleck / Aussehen Replikation zu identifizieren, selbstts und eine nicht-überlappenden zytoplasmatischen stain β-Zellen zu identifizieren, führt zu Fehlattribution von proximalen nicht-β-Zell-Replikationsereignisse-Zellen ß.

In jüngerer Zeit reifen haben primäre β-Zellen , die die Auswirkungen von Transgen Überexpression sowie Genprodukts oder Verbindung Behandlung auf β-Zell - Replikation ^13-16 zu bewerten verwendet worden. Allerdings haben diese Studien auch auf subjektive Zählen von Replikationsereignisse verlassen, zytoplasmatische staining- oder nicht-spezifischen Methoden für die β-Zellen - Identifikation und / oder arbeitsintensive Schritte , die den Durchsatz begrenzen, beispielsweise einzelne Einschub gut Plattieren von Zellen oder intakten islet Paraffineinbettung und Verarbeitung ^17. Bemerkenswert ist , ein bildbasiertes menschliche β-Zellreplikation Screening Methode, ähnlich der hier vorgestellten, wurde ¹⁸ veröffentlicht wurde ; jedoch hat erfolgreiche Verwendung dieses Assays nicht nachgewiesen werden, und die Verwendung von menschlichen Inseln zur Vorabsiebung nicht breit sein FEAwortlich.

Eine alternative Strategie zur Identifizierung von Replikationsfördernde Substanzen das Wachstum Induktion von β-Zelllinien zu bewerten. Erste Versuche umgewandelt β-Zell-Linien verwendet wie MIN6 Zellen oder INS 832/13-Zellen ^14,19-21. Allerdings zeigen diese Zelllinien ungebremst Wachstum und wenig Ähnlichkeit mit gut differenzierten β-Zellen ^22. Folglich wachstumsInduktionsLeistung ist minimal, unklarer Relevanz und manchmal schwer zu rekapitulieren. Eine verbesserte Strategie für die zellbasierte Screening - Linie nutzt Zellen "reversibel umgewandelt" , das Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin (Doxycyclin) -abhängigen SV40 T - Antigen - Expression ^23,24 verhaftet sind. Es ist jedoch unklar, ob diese Zellen zu einer "normalen" β-Zell-ähnlichen Zustand auf Doxycyclin Entfernung zurück. Leider hat die Verwendung dieser Zellen verallgemeinert wachstumsfördernden Verbindungen ergab, dass offenbar nicht unmittelbaren Nutzen haben24. Insgesamt ist die Verwendung von Zell-Linien Wachstumsregulation eines Zelltyp - Anzeige von minimal spontane Replikationsaktivität zu studieren , können begrenzte Anwendbarkeit aufweisen.

Die β-Zellreplikation präsentiert Screening - Plattform hierin verwendet reifen primären Ratten - β-Zellen in vivo Wachstumsregulierung in dem Maße möglich, Inselzellkulturen von gemischten Zelltyp - Zusammensetzung zu erhalten Identifizierung von Lineage-restricted wachstumsfördernden Aktivitäten zu ermöglichen, multi -well Formatierung Durchsatz und automatisierte Analyse zu maximieren Bias zu beseitigen und den Durchsatz zu erleichtern. Der erfolgreiche Einsatz dieser Plattform hat Identifizierung mehrerer Verbindungen aktiviert , die β-Zell - Replikation ^25,26 fördern. Zusätzlich wurde der Test für die Struktur-Wirkungs-Beziehung Studien und chemischen epistasis Experimenten verwendet worden mechanistische Einblicke in die molekulare Regulation von β-Zell-Replikation zu ermöglichen. Die vorgestellte Plattform wurde erfolgreich angepasst for lentiviralen RNAi-basierte Untersuchung von β-Zell - Replikation Pfade ^25. Einschränkungen des Tests umfassen Skalierbarkeit (Verwendung von Primärzellen) beschränkt, die Verwendung von Nagetier anstatt menschlichen Inselzellen (obwohl der Test auf menschlichen Insel Studien angepasst werden kann), Aufwendungen im Zusammenhang mit Antikörper-basierte Bildgebung und primäre Insel Nutzung, die Nutzung von dispergierten Inseln (gestört islet Architektur) automatisierten Bildaufnahme und die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit eines automatisierten Mikroskop mit Bildaufnahme und Analysefähigkeit zu erleichtern. Obwohl eine leichte In - vivo - Screening - Methodik Genprodukte oder zur Identifizierung von Verbindungen , die β-Zell - Regeneration in situ stimulieren ideal wäre, eine solche Plattform ist noch nicht ²⁷ zur Verfügung. Folglich ist die beschriebene Plattform geeignet für Forscher interessiert sich für die meisten Aspekte der β-Zell-Replikation zu untersuchen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Stanford University School of Medicine durchgeführt. 300 g - Das beschriebene Protokoll wird von sechs 250 für Inselisolierung skaliert (8 - 9 Wochen alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 228 Wells einer 384-Well-Platte für die Inselzellen-Replikationsabschätzung zu erzeugen ausreichend ist.

1. Material Vorbereitung

1. Bereiten Beschichtungsmedien vor Beginn der Inselisolierung durch den konditionierten Medien von 804G Rattenblasenkarzinom - Zellen bei Konfluenz für 3 Tage (20 ml RPMI1640) gehalten Sammeln in einer 15 cm - Gewebekulturschale ^28. Sterilfilter und zu speichern (-20 ° C) das konditionierte Medium für die spätere Verwendung.
2. Sterilisieren chirurgische Instrumente (eine 12 cm Zahngewebe Zange, ein 11,5 cm feinen Schere, ein 14,5 cm chirurgische Scheren, zwei 16 cm gebogenen Pinzette, ein 12 cm gebogen hemostat, ein 12 cm Skalpell Griff) und ein 30 mesh Gewebe Sieb vor initiating Inselisolierung.
3. Vorbereitung pankreatischen Verdauungslösung durch eine 60% ​​zum Auflösen: 40% Mischung von gereinigtem Klasse I: Klasse II Kollagenasen (total Kollagenase - Aktivität von 300.000 - 400.000 Einheiten) in 60 ml 1x Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) , supplementiert mit Calcium und Magnesium. Last 10 ml Pankreasverdauungspuffer in 10 ml Spritzen (sechs) mit einem 1 "22 G Nadel und auf Eis.
   Anmerkung: 10 ml Aufschlußlösung pro Ratte injiziert. Skalieren entsprechend.
4. Bereiten 4,5 ml des Anästhetikums Cocktail in einer belüfteten Haube von 1,3 ml Ketamin Mischen (100 mg / ml), 0,2 ml Xylazin (100 mg / ml) und 3 ml PBS. Bereiten Sie das Anästhetikum Cocktail innerhalb 1 Stunde von Inselisolierung zu initiieren.
5. Bereiten Waschpuffer durch Zugabe von 25 ml Serum von neugeborenen Kälbern auf 500 ml HBSS. Legen Waschpuffer auf Eis für die spätere Verwendung.
6. Bereiten Sie 1 Flasche Insel Medium , das 500 ml niedriger Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) ist, 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin.
7. Bereiten Inselfunktion Medium von Funktionalität / Lebensfähigkeit Lösung (500 ml) mit 2% FBS, 2 mM Glutamin, 5 mM Glucose, 5,000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin. Speichern Sie die Inselfunktion Medien (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
8. Vorbereitung 40 ml Puffer durch Zugabe von 2,5 ml Esel Blockierungsserum und 0,12 ml Triton X-100 bis 37,38 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Store Blockierungspuffer (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
9. Besorgen Sie sich die benötigten Antikörper vor, das Protokoll zu initiieren.
   Hinweis: PDX-1 (TRITC) und Ki-67 (FITC) Co-Färbung ist für die primäre β-Zell-Replikation-Screening verwendet. zusammen mit Kern (DAPI), PDX (Cy5) und Ki-67 (FITC) Färbung; Für linienspezifische Replikationsanalyse, Immunfluoreszenzanfärbung für zusätzliche Zellidentität Marker (TRITC Insulin, Glukagon, Vimentin oder Somatostatin) durchführen. Alternative replication Marker, beispielsweise PCNA, können ebenfalls verwendet werden.
10. Bereiten Sie eine 228-Well-Behandlungsplan mit jedem in vierfacher Ausfertigung durchgeführt Behandlungszustand. Positiv- Fügen (5-Iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 & mgr; M]) und Fahrzeugkontrolle (DMSO 1: 666 Verdünnung) Brunnen.

2. Perfusion des Pancreas

1. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von verdünntem Anästhetikum Cocktail-Lösung (0,30 ml / 100 g Körpergewicht). Sobald die Ratte vollständig betäubten und reagiert nicht mehr auf schädliche Reize, führen Zervikaldislokation.
2. Legen Sie die eingeschläfert Ratte in Rückenlage (kranial-kaudal-Orientierung) auf einem Stapel von Papiertuch und sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
3. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem U-Schnitt (Basis am Schambereich) und einfahren Haut in der rostralen Richtung über der Brust in die Bauchhöhle zu belichten.
4. packen Sie vorsichtig das Duodenum mit zwei Paaren von gebogenen Pinzette, suchen Sie den duodenalen Eintrag der gemeinsamen bile Kanal (Sphinkter Oddi) und der Zwölffingerdarm-Öffnung an der Papille mit einer gekrümmten hemostat festzuklemmen.
5. Heben Sie den gekrümmten hemostat verwendet, um den gemeinsamen Gallengang Papille zu klemmen und den Gallengang nahe an Leber schnappen Sie sich einen gebogenen Pinzette verwenden. Verwenden Sie stumpfe Präparation mit den gebogenen Pinzette zu isolieren und den Gallengang aus.
6. Positionieren Sie die Ratte mit dem Kopf proximal und distal die Füße.
7. Kanülieren den gemeinsamen Gallengang (CBD) an oder gerade distal zu der Verbindung der zystischen und gemeinsame -beladene Lebergänge mit einer pankreatischen Verdauungslösung 10 ml Spritze und 10 langsam ml der pankreatischen Verdauungslösung injizieren. Während die Injektion, die CBD mit einem Skalpell Griff unterstützen. Positionieren Sie die Nadel, wenn der Kanal und der Bauchspeicheldrüse aufzublasen scheitern.
8. Entfernen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse die gebogenen Pinzette und einer feinen Schere mit ihm zu trennen von dem absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz. Legen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse auf Eis in einem 50-ml-Röhrchen mit 5 ml Pankreas - Verdauungslösung.
   Hinweis: Für eine maximale Inselausbeute, sammeln Sie alle Bauchspeicheldrüsen innerhalb von 30 min und Ort nur 1 oder 2 Bauchspeicheldrüsen in je 50 ml Aufschlußrohr.

3. Die Dissoziation des Pancreas

1. Sobald alle Bauchspeicheldrüsen gesammelt, legen Sie die Verdauung Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig schwenken alle 3 Minuten die Röhrchen.
2. Nach 15 min kräftig schütteln (vertikal) die Rohre 10 - mal und 10 ml kaltem Waschpuffer hinzufügen. Kräftig schütteln die Rohre zusätzlich 5 mal auf Eis stellen.
3. Füllen Sie die Verdauung Rohre bis 50 ml mit kaltem Waschpuffer und Mischung von Röhren 5 - mal umgekehrt wird .
4. Zentrifugiere die Röhrchen bei 97 × g bei 4 ° C für 1 min und giesst den Überstand. Achten Sie darauf, nicht die pelle Gewebe zu entfernen.
5. 25 ml Waschpuffer und erneut zu suspendieren , das Gewebe durch sanftes Vortexen. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 noch zweimal.
6. Legen Sie ein 30 mesh Gewebe Sieb über eine sterile 250-ml-Becher und gießen Sie die Gewebesuspension auf das Sieb. Spülen Sie das Aufschlußrohr mit zusätzlichen 20 ml Waschpuffer und gieße auf das Netz. Die unverdaute Pankreas und Fettgewebe sind bei diesem Schritt entfernt.
7. Gießen Sie das gefilterte Material in zwei frische 50-ml-Röhrchen und das Gewebepellet durch bei 4 ° C bei 97 × g für 1 min drehen. Decant Überstand und Invert-Röhren überschüssige Puffer zu entleeren.

4. Reinigung von Inselchen

1. 20 ml kaltem Polysaccharose / Natriumdiatrizoat-Lösung (1,119 g / ml Dichte) an die pelletierten Pankreasgewebe. Homogen erneut zu suspendieren, den Inhalt jedes Röhrchen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren fünfmal.
2. Overlay vorsichtig die Polysucrose / Natriumdiatrizoat Lösung mit 10 ml HBSS. Pflegen Sie eine scharfe Flüssigkeit-Grenzfläche durch langsam die HBSS entlang der Rohrwand hinzufügen.
3. Zentrifugieren der verdauten Bauchspeicheldrüsen bei 560 × g für 15 min (4 ° C) mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse.
4. Collect die Inselschicht von der Oberfläche einer 10 ml Pipette und Platz Inselchen in frischen 50-ml-Röhrchen mit. Pool nicht Inselchen in diesem Stadium.
5. Werden 40 ml Waschpuffer in jede 50 - ml - Röhrchen und Schleuder für 1 min bei 140 × g bei 4 ° C.
6. Gießen Sie den Überstand ab und erneut zu suspendieren gepoolt Inseln in 50 ml Waschpuffer durch die Rohre mehrmals umgekehrt wird . Zentrifugiere die Röhrchen für 1 min bei 97 × g bei 4 ° C Inselchen in einem Pellet zu sammeln.
7. Gießen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche ab. Bringen Inseln in die Gewebekultur Haube und den Überstand aspirieren.
8. Re-suspend jedes Rohr von Inseln in 6 ml Insel Medium.
9. Übertragen Sie die Inseln von je 50 ml Tube in eine Vertiefung Sechs-Well-Gewebekulturschale. Schwenken Sie die 6-well Schale Inseln in der Mitte des Brunnens zu sammeln und Inselchen Qualität und Reinheit unter dem Mikroskop beobachten.
10. Manuell sammeln Inselchen einer 1 ml Pipette und übertragen die aufgenommenen Inseln in die benachbarte Verwendungenthält, gut 6 ml Insel Medien. Wiederholen Sie Inselchen Verwirbelung und Kommissionierung bis> 90% Reinheit erreicht.
11. Übertragen Sie die gereinigten Inseln zu einer 10 cm Gewebekulturschale mit 20 ml Insel Medium.
12. Ort Inselchen in einem Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ über Nacht (1A).
13. In Vorbereitung der Inselzellen Plattieren, Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen mit 40 ul 804G konditionierten Medium pro Well. über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.

5. Dispersion und Beschichtung von Inselzellen

1. Am folgenden Tag, nehmen Sie sanft kleine Inseln aus dem 10-cm-Schale mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Inseln in einen 50-ml-Tube.
2. Pellet die Inseln durch Zentrifugation für 1 min bei 22 · g bei Raumtemperatur. Den Überstand aspirieren.
3. Waschen Sie die Inselchen mit 20 ml warmem PBS und wie oben dekantiert.
4. Re-suspend Inseln in 0,25% Trypsin (150 & mgr; l pro Ratte Bauchspeicheldrüse) Und für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Pipette Inselchen nach oben und unten 10-mal mit 1 ml Pipette nach 5 und 10 Minuten Inkubation.
5. Nach 10 min wurde eine 20 ul Probe der trypsiniert Inseln unter dem Mikroskop ausgewertet vollständige Verdauung zu gewährleisten und die Inselzellen mit einem Hämocytometer gezählt. Wenn unverdaute Inseln bleiben, weiterhin Inkubation für eine weitere 3-5 min und Pipette auf und ab 10 weitere Male. Bei Bedarf wiederholen.
   Hinweis: Die typische Ausbeute von ~ 125.000 - 150.000 Insel-Zellen pro Ratte.
6. Entfernen 804G konditionierten Medien beschichteten 384-Well-Platte aus dem Inkubator und entfernen Medien eine 12-Well-Verteiler Absauger verwenden.
7. Suspend - Inselzellen in einer Dichte von 45.000 Zellen pro ml in Islet Funktionsmedium und der Platte 70 & mgr; l (3.150 Zellen) pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette (1B).
   Hinweis: Da in den äußeren Wells β-Zellen sind in der Regel 4 in Richtung des Umfangs der Platte Verwendung Reihen C bis N und Spalten zu migrierenbis 21 228 Vertiefungen mit den Inselzellen von 6 Ratten isoliert auf den Teller.
8. Die Platte wird in der Gewebekultur-Inkubator für 48 Stunden Zelladhäsion zu ermöglichen.

6. Islet-Zellkultur-Behandlung, Fixierung und Färbung

1. Bereiten 200 ul Vehikel und Verbindungen (Behandlungsbedingungen werden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt) bei einer 2x - Konzentration in Islet Funktionsmedium. Anordnen Verbindungen in einer sterilen 96-Well-Platte mit mehreren Vertiefungen Pipettieren zu erleichtern.
2. Sorgfältig Inselchen Medium mit einer 12-Well-Verteiler Absauger entfernen und mit Inselfunktion Medium (35 & mgr; l / Well) unter Verwendung eines 12-Well-Pipette ersetzen. Entfernen und Ersetzen Medien von einer Zeile zu einer Zeit , Risiko zu begrenzen , Trocknen (1C).
3. Initiieren Behandlung von 35 ul / Vertiefung der 2x Verbindungslösungen zu übertragen. Rückplatte in den Inkubator für die 48 Stunden Behandlungsdauer.
4. Nach 48 Stunden der Behandlung, dekantiert die Behandlungsmedien durch Umdrehen der Platte.
5. Waschen Sie sich leicht die Inselzellen mit 50 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS (1 min). Fügen Sie den PBS einen Mehrkanal-Pipette.
6. Dekantiert die PBS und die Zellen beheben, indem 50 ul Zugabe pro Vertiefung von kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS. Inkubiere Zellen für 15 min bei 4 ° C.
7. Waschen Sie die Zellen dreimal (jeweils 5 min) durch die Platte Invertieren des PFA zu entfernen, und die Zugabe vorsichtig 60 ul PBS pro Vertiefung wie oben.
8. Vorbereitung 15 ml Antigen-Retrieval-Lösung durch Mischen von 14,25 ml Formamid und 0,75 ml 0,15 M Natriumcitrat (pH 6). Sprechen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
9. Entfernen PBS aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte und fügen Sie zu jeder Vertiefung 60 ul Antigen-Retrieval-Lösung. Anschließend wird die Platte in 70 ° C warmen Wasserbad für 45 min. Platzieren einem Heizblock auf der Oberseite der Platte während dieser Inkubation Verziehen der Multiwell-Platte zu verhindern.
   Hinweis: Das Wasser sollte bis zur Hälfte der Platte Rock sein; Die Platte sollte nicht in Wasser getaucht werden.
10. Die Platte aus Wasserbad und lassen Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Stellen Sie sicher, dass die Platte durch visuelle Inspektion nicht verzogen wird.
11. Waschen Sie die Zellen mit 60 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS dreimal (jeweils 5 min). Hinzufügen PBS mit einer Mehrkanalpipette und dekantieren PBS durch Umdrehen der Platte.
12. Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 40 ul pro Vertiefung Blockierungspuffer hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Blockierungspuffer durch Umdrehen der Platte und dekantiert.
13. Werden 40 & mgr; l Maus-anti-human Ki-67 (1: 200) und Ziege-anti-human PDX-1 (1: 100) in Blockierungspuffer auch mit jedem verdünnten Antikörper und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
14. Am nächsten Tag, dekantiert die Antikörperlösung und wasche die Zellen mit 1x PBS dreimal (jeweils 5 min), wie oben beschrieben. Umfüllen PBS.
15. In 40 ul pro Vertiefung verdünnt (1: 200) biotinyliertes Esel-anti-Maus-IgG und Rhodamin-konjugierten Esel-Anti-Ziegen-IgG in Blocking-Puffer. Inkubieren für 1 Stundebei Raumtemperatur.
16. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. Werden 40 & mgr; l verdünnt (1: 400 in Blockierungspuffer) fluorescein-konjugiertem Streptavidin zu jeder Mulde. Inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
17. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. In 40 ul pro Vertiefung DAPI (300 nM in Blocking-Puffer) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
18. Wash-Zellen mit 1x PBS zweimal und lassen Zellen in 40 ul 1x PBS. Die Platte ist nun bereit, analysiert zu werden.

7. β-Zellreplikation Analyse

Hinweis: Ein Testprotokoll für das High Content Screening-Mikroskop hergestellt werden muss verwendet, um β-Zell-Replikation zu messen. In seiner einfachsten Zusammensetzung Dieses Protokoll ist ein Zwei-Farben - Assay in dem ein Identitätsmarker verwendet wird β-Zellen (PDX-1 ⁺ -Zellen) und einen Replikationsmarker (Ki-67) zu definieren Zellteilung Ereignisse zu definieren.

1. Identifizieren Sie Objekte (β-Zellen), basierend auf dem average Fluoreszenzintensität von PDX-1 - Färbung (549 - nm - Filter) innerhalb eines angenäherten Kreises (Länge: Breite <1,6) innerhalb des erwarteten Pixelbereich einer β-Zellkerns (2A).
2. Als nächstes etablieren Einstellungen Replikationsereignisse (Ki-67-Positivität) , basierend auf der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (485 nm Filter) innerhalb des PDX-1 ⁺ Fläche (2B) zu identifizieren.
   Hinweis: Die Belichtungszeiten muss festgelegt werden, um Pixelintensität Vergleiche zwischen den Bildern ermöglichen. Assay-Protokoll-Parameter werden so eingestellt, dass Anrufe Maschine konstant unspezifische Färbung, Schutt und Zellaggregate auszuschließen, die sich nachteilig auf die Datenqualität beeinträchtigen könnten.
3. Analysieren Sie ein Minimum von 500 β-Zellen pro Well Genauigkeit und Grenz Variabilität zu maximieren.
   Anmerkung: Die basale β-Zell-Replikation in Kulturen Index rat islet erwartet wird, 0,5 bis - 3%. Typischerweise beträgt 40 Bilder pro Vertiefung mehr als ausreichend 500 β-Zellen zu identifizieren.
4. Vor der Analyse dergesamte Platte, Analyse ausgewählt Negativ- (DMSO-behandelten) und Positivkontrolle (5-iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 uM]) -behandelten Vertiefungen die Gültigkeit des Testprotokolls zu bewerten. Wenn der Test richtig hergestellt ist, induzieren positive Kontrollverbindungen mindestens eine zweifache Erhöhung des Prozentsatzes β-Zellen zu replizieren.
5. Lesen Sie die gesamte Platte, sobald das Testprotokoll bestätigt wird.

Ergebnisse

Zu β-Zelle oder α-Zellreplikation, eine Vierfarben-Assay-Protokoll ist erforderlich, zu beurteilen. Zuerst werden Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1, 386 nm) identifiziert. Als nächstes gezählt β-Zellen (Ereignis 1): Objekte , die und peri-Kern Insulin (Kanal 3, 549 nm) PDX-1 ⁺ (2, 650 nm - Kanal) zusammen auszudrücken. Anschließend replizieren β-Zellen (Ereignis 2) gezählt: ß-Zellen (Ereignis 1) coexprimierender Ki-67 (Kanal 4, 485 nm) (Abbildung 3).

Diskussion

Experimentelle Methoden für die molekularen Mechanismen zu studieren, die β-Zellwachstum und Regeneration zu steuern sind wichtige Werkzeuge für die Diabetes-Forscher. Hierbei wird eine Ratte-Insel-basierte Screening-Plattform für kleine Molekül Stimulatoren der β-Zell-Replikation identifizieren und zu charakterisieren, wird präsentiert.

Während die meisten Aspekte dieses Protokolls leicht von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, erfordern ein paar Schritte besondere Technik. E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps	Fine Science Tools	11021-12
11.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14058-11
14.5 cm surgical scissors	Fine Science Tools	14001-14
16 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-16
12 cm curved hepostat	Fine Science Tools	13011-12
12 cm scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Tissue sieve-30 mesh	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units	VitaCyte	005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	to make anesthetic cocktail
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	to make anesthetic cocktail
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	to make histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose	Hyclone	SH30021.01
Functionality/Viability Solution	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media	Hyclone	SH30096.01	to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line	Available upon request		to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 ml	Fisher BioReagents	BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)	Vector Laboratories	H-3300	to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous	EMD Chemicals	DX0145-1	to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody	BD Biosciences	556003
Goat anti-human PDX-1 antibody	R&D Systems	AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody	abcam	ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated	Invitrogen	S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml	Sorenson BioScience	39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate	BD Falcon	353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate	Costar	3603
Multi-channel pipettor	Costar	4880
12-channel vaccume aspirator	Drummond	3-000-096
Cell Scraper	Falcon	353085
Isotemp Water Bath Model 2223	Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI	Thermo Scientific