JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

Abstract

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Introduction

סוכרת כוללת אוסף של הפרעות שיתוף הסוף-נקודה המשותפת של הומאוסטזיס הגלוקוז שבש. למרות מנגנוני פתוגניים של תת סוכרת הם ברורים, הם חולקים תוצאה של מסת β-cell ירד, כלומר, אובדן כושר אינסולין ייצור 1,2. נכון להיום, אסטרטגיות טיפול בסוכרת לסמוך על ממשל כרוני של אינסולין אקסוגני, גירוי תרופתי של ייצור אינסולין או שיפור רגישות לאינסולין, ולעתים נדיר, השתלת איי לבלב או 3,4 לבלב כולו. למרבה הצער, הצלחת יישום אסטרטגיה זו היא קצרת מועד ו / או לא מצליח לשחזר את הפונקציה מספיק של אינסולין אנדוגני. למרות התועלת של מפתחי שיטה לעורר התחדשות β-cell, אין גישה כזו. כתוצאה מכך, מטרת מחקר הסוכר עיקרית היא לפתח שיטות כדי ליצור תאי β חדשים או להרחיב המוני β-cell אנדוגני 5 . למרות התחדשות β-cell ממקורות מתחדשים כמו תאי גזע עובריים היא מתקדמת, חששות בטיחות ויעילות להפוך את המרדף של אסטרטגיות חלופיות, כולל הרחבת β-תאים בוגרים, בעדיפות 6,7. חשוב לציין כי מקור השולט של תאי-β חדש in vivo הוא-תאי β קיימים ולא ובתאים מיוחדים 8,9. למרות β-תאים נראה שיש יכולת שכפולה מוגבלת, עלייה קטנה במסת β-cell (~ 30%) עשויים להיות מספיק כדי לשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז אצל חולי סוכרת רבה. יתר על כן, בגירוי תרופתי באתרו של המוני β-cell אסטרטגיית טיפול זול וניתן להרחבה פוטנציאלי. בזאת שיטה גבוה הקרנת תוכן לזיהוי ואפיון מולקולות קטנות המעודדות צמיחת β-cell מוצגת.

מגוון שיטות במבחנה ניסיונית עשוי לשמש לזיהוי מוצרי גן ו / או מולקולות that לקדם שכפול β-תא ראשוני. מאמצים מוקדמים למדידת שטף שכפול תאי β בשימוש תרבות pancreata מכרסמים עוברים או תרבויות איון מבודד ללא פגע למדוד [3 ח] התאגדות thymidine, התאגדות BrdU או גופי mitotic בתוך האוכלוסייה מוכתמת אלדהיד-thionine או אינסולין בתגובה לתנאי טיפול ספציפי 10, 11. גישות במבחנה אלה הגירסות וקרובות יש ממנו מספר מגבלות. ליקויים בולטים כוללים (1) שימוש בתאי עובר אשר, בניגוד β-תאים בוגרים, להציג קצב שכפול β-תאי בסיס גבוה והם צמיחה מוסדרת באופן מובהק 12; (2) אופי סובייקטיבי שפיטה הנסיין תלויות אירועים שכפולים β-cell; (3) את העבודה וזמן הטבע אינטנסיבי של ספירת הנסיין תלוי אירועים שכפולים β-cell מפגר תפוקה ניסיון; (4) שימוש התאגדות / כתם / מראה גרעיני לזהות שכפול אפילוts וכתם ציטופלסמית שאינה חופף לזהות β-תאים מובילים misattribution של אירועים שכפולים שאינו β-cell בסמוך בטאו תאים.

לאחרונה β-תאים ראשוניים בוגרים שמשו להעריך את ההשפעה של transgene יתר הביטוי כמו גם טיפול מוצר או תרכובת גן על שכפול β-cell 13-16. עם זאת, מחקרים אלה גם יש לסמוך על ספירת סובייקטיבית של אירועים שכפול, cytoplasmic staining- או שאינו ספציפי שיטות לזיהוי β-cell ו / או צעדים עתירי עבודה כי להגביל את התפוקה, למשל, ציפוי שקופית היטב פרט של תאים או איון שלם הטבעת פרפין ועיבוד 17. יש לציין, מתודולוגיה הקרנה שכפולה β-תאים אנושיים מבוסס תמונה, דומה לזו המוצגת כאן, כבר פורסמה 18; עם זאת, שימוש מוצלח של assay זה לא הודגם ושימוש איי אדם להקרנה עיקרית לא יכול להיות רחב FEAsible.

אסטרטגיה חלופית לזיהוי חומרים לקידום שכפול היא להעריך אינדוקציה הצמיחה של קווי β-cell. מאמצים ראשוניים המשמשים β-cell-קווי טרנספורמציה כגון min6 תאים או INS 832/13-תאי 14,19-21. עם זאת,-שורות תאים אלה להפגין צמיחה רסן לשאת מעט דמיון β-תאים מובחנים היטב 22. כתוצאה מכך, יכולת צמיחת אינדוקציה היא מינימאלית, של רלוונטיות ברורות ולפעמים קשה לשחזר. אסטרטגיה משופרת להקרנה מבוססת שורת תאים מנצלת "טרנספורמציה הפיך" תאים הנמצאים עצירת גדילה בהעדר טטרציקלין (דוקסיציקלין) ביטוי אנטיגן התלוי SV40 T 23,24. עם זאת, לא ברור אם תאים אלה לחזור למצב "נורמלי" β-דמוי תא עם הסרת דוקסיציקלין. למרבה הצער, שימוש בתאים אלה הניב תרכובות מקדמת גדילה כללית כי לא נראה שיש שתועלת מיידית24. באופן כללי, השימוש-שורות תאים ללמוד ויסות צמיחה של תאים מסוג מוצגים פעילות שכפולה ספונטנית מינימאלית עשוי להיות תחולה מוגבלת.

פלטפורמת ההקרנה שהכפולה β-cell המוצגת כאן מנצלת עכברוש העיקרי בוגרים β-תאים לשמר ברגולציה של צמיחת vivo במידת ההאפשר, תרבויות תאי איון של רכב תא מסוג מעורב כדי לאפשר זיהוי של פעילויות לקידום צמיחה מוגבלת שושלת, רבה "טוב עיצוב על מנת למקסם את תפוקת ניתוח אוטומטי לחסל הטיה ולהקל תפוקה. שימוש מוצלח של פלטפורמה זו אפשר זיהוי של מספר תרכובות המקדמות שכפול β-cell 25,26. בנוסף, assay שמש במשך מחקרי יחסי מבנה-פעילות וניסויי epistasis כימיים לספק תובנות מכניסטית לתוך תקנה המולקולרי של שכפול β-cell. הפלטפורמה הציג הותאמה בהצלחה FOr lentiviral RNAi מבוסס חקירת שכפול β-cell מסלולי 25. מגבלות של assay כוללות מוגבלות מדרגיות (שימוש של תאים ראשוניים), שימוש מכרסם ולא-תאי איון אדם (אם כי assay יכול להיות מותאם עבור מחקרי איון אדם), הוצאות הקשורות הדמיה מבוססת נוגדן ושימוש איון עיקרי, השימוש איים מפוזרים (אדריכלות איון שבש) כדי להקל על רכישה ותלות תמונה אוטומטיות על הזמינות של מיקרוסקופ אוטומטית עם רכישת תמונה ויכולת ניתוח. למרות מתודולוגיה הקרנה הקלילה in vivo לזיהוי מוצרי גנים או תרכובות מעודדי התחדשות β-cell באתרו תהיה אידיאלית, פלטפורמת דוגמת אינה זמינה עדיין 27. כתוצאה מכך, הפלטפורמה תארה מתאימה חוקר מעוניין לחקור את רוב ההיבטים של שכפול β-cell.

Protocol

פרוטוקול זה בוצע בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. הפרוטוקול המתואר ישתנה לבידוד איון משישה 250 - 300 גרם (8 - 9 שבועות ישנים) חולדות זכרים ספראג Dawley, וזה מספיק כדי להפיק 228 בארות צלחת 384 גם להערכה שכפול תאי איון.

1. הכנת חומר

  1. הכן התקשורת ציפוי לפני ייזום בידוד איון על ידי איסוף התקשורת המותנה של תאי קרצינומה בשלפוחית ​​עכברוש 804G נשמר בנקודת המפגש במשך 3 ימים (20 מ"ל של RPMI1640) בצלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ 28. מסנן ולאחסן סטרילי (-20 ° C) בתקשורת מותנה לשימוש מאוחר יותר.
  2. לעקר כלים כירורגיים (אחד 12 ס"מ מלקחיים רקמות שיניים, אחד 11.5 ס"מ מספריים בסדר, מספריים כירורגיות אחד 14.5 ס"מ, שני מלקחיים מעוקל 16 ס"מ, hemostat מעוקל אחד 12 ס"מ, ידית אזמל אחד 12 ס"מ) מסננת ברקמה אחת 30 רשת לפני initiating בידוד איון.
  3. כן פתרון עיכול לבלב על ידי המסת 60%: 40% תערובת של אני בכיתה מטוהרת: בכיתה השנייה collagenases (פעילות collagenase סכה של 300,000 - 400,000 יחידות) ב 60 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת '1x הנקס (HBSS) השלים עם סידן ומגנזיום. טען 10 מ"ל של חיץ העיכול הלבלב לתוך 10 מ"ל מזרקים (שישה) עם מחט G 1 "22 ומניחים על קרח.
    הערה: 10 מ"ל של פתרון העיכול מוזרק לכל חולדה. קנה מידה בהתאם.
  4. הכן 4.5 מ"ל של קוקטייל ההרדמה במנדף מאוורר ידי ערבוב 1.3 מ"ל של קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 0.2 מ"ל של xylazine (100 מ"ג / מ"ל) ו 3 מ"ל של PBS. הכן את קוקטייל הרדמה בתוך שעה 1 של ייזום בידוד איון.
  5. הכן חיץ לשטוף ידי הוספת 25 מ"ל של סרום עגל בן יומו עד 500 מ"ל של HBSS. מניחים לשטוף חיץ על הקרח לשימוש מאוחר יותר.
  6. כן 1 בקבוק בינוני איון שהוא 500 מיליליטר של מדיום הנשר השונה של נמוכה גלוקוז Dulbecco (DMEM), 50 מ"ל בסרום שור העובר (FBS), 5,000 מ"ל / יחידות של פניצילין 5,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין.
  7. כן בינוני פונקצית איון מפתרון פונקציונלי / כדאיות (500 מיליליטר) עם 2% FBS, גלוטמין 2 מ"מ, 5 גלוקוז מ"מ, 5,000 יחידות / מיליליטר של פניצילין 5,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין. אחסן את המדיה פונקצית איון (4 ° C) לשימוש מאוחר יותר.
  8. הכן 40 מ"ל חיץ חסימת ידי הוספת 2.5 מ"ל סרום החמור 0.12 מ"ל טריטון X-100 37.38 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS). חנות חיץ חסימה (4 ° C) לשימוש מאוחר יותר.
  9. השג את הנוגדנים הנדרשת לפני שיזם את הפרוטוקול.
    הערה: PDX-1 (TRITC) ו קי-67 (FITC) שיתוף מכתים משמש להקרנה שכפול β-תא ראשוני. לניתוח שכפול ספציפיים השושלת, לבצע מכתים immunofluorescence עבור סמנים זהות תא נוסף (אינסולין, גלוקגון, vimentin או סומטוסטטין; TRITC) יחד עם גרעיני (DAPI), PDX (Cy5) ו קי-67 (FITC) מכתים. נציג אלטרנטיביסמני lication, למשל, PCNA, עשויים לשמש גם.
  10. כן תכנית טיפול 228-היטב עם כל תנאי טיפול מבוצעים ארבעה פעמים. כלול positive- (5 Iodotubercidin [1 מיקרומטר] או דיפירידאמול [15 מיקרומטר]) ורכב שליטה (DMSO 1: דילול 666) בארות.

2. זלוף של הלבלב

  1. להרדים חולדות על ידי הזרקת ה- IP של פתרון קוקטייל הרדמה מדולל (0.30 מ"ל / 100 g משקל הגוף). לאחר העכברוש הוא בהרדמה מלאה ואינו מגיב לגירויים מזיקים, לבצע פריקת צוואר רחם.
  2. מניחים את החולדה מורדמים במצב שכיבה (אוריינטציה גולגולתי הזנב) על ערימה של מגבת נייר ולרסס את אזור הבטן עם אתנול 70%.
  3. פתח את חלל הבטן עם (בסיס באזור הערווה) U-חתך לסגת עור בכיוון המקורי על חזה כדי לחשוף את חלל הבטן.
  4. בזהירות לתפוס את התריסריון באמצעות שני זוגות מלקחיים מעוקלים, אתר את הערך של התריסריון b המשותףצינור Ile (הסוגר של Oddi) מהדק פתיחת התריסריון על הגבשושיות עם hemostat מעוקל.
  5. הרם את hemostat המעוקל נהג לצבוט את גבשושיות צינור מרה המשותפת לתפוס את צינור ההמרה קרוב כבד באמצעות מלקחיים מעוקלים. השתמש דיסקציה קהה עם המלקחיים המעוקלים לבודד ולחשוף את צינור המרה.
  6. מיקום מחדש את העכברוש עם הפרוקסימלי הראש וכפות הרגליים דיסטלי.
  7. Cannulate את צינור המרה המשותף (CBD) בבית או דיסטלי רק עד לצומת של צינוריות הכבד פיברוזיס משותף עם פתרון העיכול הלבלב -loaded מזרק 10 מ"ל לאט להזריק 10 מ"ל של פתרון העיכול הלבלב. בעוד הזרקה, לתמוך CBD עם ידית אזמל. שנה את מיקום המחט אם הצינור והלבלב להיכשל לנפח.
  8. הסר את הלבלב המנופח באמצעות מלקחיים המעוקלים מספריים בסדר להפריד אותו מן המעי הגס, מעיים יורדת, הקיבה וטחול. מניחים את הלבלב מנופח על הקרח בתוך שפופרת 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של פתרון עיכול לבלב.
    הערה: תשואת איון מקסימלית, לאסוף את כל pancreata תוך 30 דק 'והמקום רק 1 או 2 pancreata בצינור אחד 50 מ"ל עיכול.

3. דיסוציאציה של הלבלב

  1. לאחר כל pancreata נאסף, ומקום צינורות העיכול לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מערבולת בעדינות את הצינורות כל 3 דקות.
  2. לאחר 15 דקות, לנער במרץ (אנכית) הצינורות 10 פעמים ולהוסיף 10 מ"ל של חיץ לשטוף קר. במרץ לנער את הצינורות של 5 פעמים נוספות ומניח על קרח.
  3. ממלאים את צינורות העיכול 50 מ"ל עם חיץ לשטוף קר ומערבבים על ידי היפוך הצינורות 5 פעמים.
  4. צנטריפוגה צינורות ב 97 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ושופכים את supernatant. היזהר שלא לעקור את רקמת pelleted.
  5. הוסף 25 מ"ל חיץ לשטוף מחדש להשעות את הרקמה על ידי vortexing בעדינות. חזור על שלבי 3.4 ו -3.5 פעמים נוספות.
  6. מניחים מסננת רקמת 30 רשת מעל רחerile 250 כוס מ"ל ויוצקים ההשעיה רקמה על מסננת. יש לשטוף את צינור העיכול עם 20 מיליליטר נוסף של חיץ לשטוף ויוצקים על הרשת. רקמות הלבלב ושומן המעוכלות יוסרו בשלב זה.
  7. יוצקים את החומר מסונן לשני צינורות טרי 50 מ"ל ו גלולה את הרקמה על ידי ספינינג ב 97 XG דקות 1 ב 4 ° C. צינורות supernatant ו להפוך למזוג לניקוז עודף חיץ.

טיהור 4. איים

  1. הוסף 20 מ"ל של תמיסת diatrizoate קר polysucrose / נתרן (1.119 g / ml צפיפות) אל רקמת לבלב pelleted. Homogenously מחדש להשעות את התוכן של כל צינור על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה חמש פעמים.
  2. בעדינות כיסוי הפתרון diatrizoate polysucrose / נתרן עם 10 מ"ל HBSS. שמור על ממשק נוזל חריף על ידי הוספה לאט את HBSS לאורך קיר הצינור.
  3. צנטריפוגה pancreata מתעכל ב 560 XG במשך 15 דקות (4 ° C) עם אצה איטית ולא בלם.
  4. שיתוףllect שכבת איון מממשק משתמש איים פיפטה ומקום 10 מ"ל ב 50 טרי צינורות מ"ל. אל הבריכה איים בשלב זה.
  5. הוסף 40 מ"ל של חיץ לשטוף צינור אחד 50 מ"ל ו ספין דקות 1 ב 140 XG ב 4 ° C..
  6. יוצקים את supernatant מחדש להשעות איים נקווה 50 מ"ל של חיץ לשטוף ידי היפוך הצינורות מספר פעמים. בצנטריפוגה צינורות 1 דקות ב 97 XG ב 4 ° C כדי לאסוף איים בתוך גלולה.
  7. יוצקים את חיץ לשטוף וחזור על לשטוף. תביאו איים לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב supernatant.
  8. Re- להשעות כל צינור של איים ב 6 מ"ל של מדיום איון.
  9. מעבירים את האיונים מהצינור כל 50 מ"ל לתוך באר של צלחת בתרבית רקמה שש היטב. מערבולת את המנה 6 באר לאסוף איים לאמצע הבאר ולבחון איכות איון וטוהר תחת מיקרוסקופ.
  10. ידני לאסוף איים בעזרת פיפטה 1 מיליליטר ולהעביר את איי הרים לתוך הסמוכיםהיטב המכיל 6 מ"ל של התקשורת איון. מתערבל איון חזור וקוטפים עד טוהר 90%> מושגת.
  11. מעבירים את האיונים מטוהרים לצלחת בתרבית רקמה 10 ס"מ המכיל 20 מ"ל של מדיום איון.
  12. איים מקום בתוך חממה בתרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לילה (איור 1 א).
  13. בעריכת תמצית תאי ציפוי איון, לצפות את הבארות של צלחת 384 גם עם 40 μl של תקשורת המותנה 804G לכל טוב. דגירה לילה חממה בתרבית רקמה.

5. פיזור ציפוי של תאי איילט

  1. למחרת, בעדינות לנתק איים מצלחת 10 ס"מ עם מגרד תא ולהעביר את איים לתוך צינור 50 מ"ל.
  2. גלולה איים על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 22 XG בטמפרטורת החדר. לשאוב supernatant.
  3. שטוף את האי עם 20 מיליליטר של PBS החם למזוג כנ"ל.
  4. Re- להשעות איים ב טריפסין 0.25% (150 μl לכל לבלב עכברושו) לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. פיפטה איים למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה 1 מ"ל לאחר 5 ו -10 דקות של דגירה.
  5. לאחר 10 דקות, להעריך מדגם 20 μl של האיים trypsinized תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עיכול מלא לספור את תאי האיון באמצעות hemocytometer. אם איים מעוכלים להישאר, להמשיך דגירה במשך 3 נוספת - עד 5 דקות ו פיפטה ולמטה 10 פעמים נוספות. חזור על פי צורך.
    הערה: התשואה טיפוסית היא ~ 125,000 - 150,000 תאים-איון לכל חולדה.
  6. הסר את צלחת תקשורת המצופית מותנית 804G 384 גם מן החממה ולהסיר תקשורת באמצעות aspirator 12 גם סעפת.
  7. להשעות תאים איון בצפיפות של 45,000 תאים לכל מ"ל במדיום פונקציה איילט צלחת 70 μl (3,150 תאים) לכל היטב עם טפטפת רב (איור 1B).
    הערה: מאחר β-תאים ממוקמים הבארות החיצוניות נוטים להגר כלפי ההיקף של שורות שימוש צלחת C ל N ועמודות 4ל -21 לצלחת 228 בארות עם תאים-איון מבודד 6 חולדות.
  8. מניח את הצלחת בחממה בתרבית הרקמה למשך 48 שעות כדי לאפשר הידבקות תא.

איילט תאים 6. תרבות טיפול, קיבוע מכתים

  1. כן 200 μl של רכב ותרכובות (תנאי טיפול מבוצעים ארבעה פעמים) בריכוז 2x במדיום פונקצית איילט. מסדרים תרכובות בצלחת 96-גם סטרילי כדי להקל pipetting רב גם.
  2. מוציאים בזהירות בינוני איון עם aspirator 12 גם סעפת ולהחליף עם המדיום פונקציה איון (35 μl / טוב) בעזרת פיפטה 12 גם. סור ולהחליף תקשורת משורה אחת בכל פעם, כדי להגביל את הסיכון של ייבוש (תרשים 1C).
  3. להתחיל בטיפול על ידי העברת 35 μl / טוב של הפתרונים המתחמים 2x. חזור הצליחו אל האינקובטור עבור משך טיפול 48 שעות.
  4. לאחר 48 שעות של טיפול, למזוג תקשורת הטיפול על ידי היפוך לצלחת.
  5. לשטוף בעדינות את תאי איון עם 50 μl לכל טוב של PBS 1x (1 דקות). מוסיף את PBS בעזרת פיפטה רב ערוצים.
  6. למזוג PBS ולתקן את התאים על ידי הוספת 50 μl לכל טוב של paraformaldehyde קר 4% (PFA) מדולל 1x PBS. דגירה תאים עבור 15 דקות ב 4 °.
  7. שוטפים את התאים שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) על ידי היפוך לצלחת להסיר את PFA בעדינות הוספת 60 μl של PBS לכל טוב כנ"ל.
  8. הכן 15 מ"ל פתרון אחזור אנטיגן על ידי ערבוב 14.25 מ"ל לפוראמיד ו -0.75 מ"ל 0.15 M נתרן ציטרט (pH 6). הפוך את הפתרון יחזור אנטיגן מייד לפני השימוש.
  9. הסר PBS מבארת על ידי היפוך לצלחת ולהוסיף פתרון יחזור אנטיגן 60 μl היטב כל אחד. מחמם את הצלחת באמבט מים 70 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. מניח בלוק חימום על גבי הצלחת במהלך דגירה זה כדי למנוע עיוות של הצלחת רבה היטב.
    הערה: המים צריכים להיות בחצי הדרך במעלה החצאית צלחת; הצלחת צריכה לא להיות שקועה.
  10. הסר את צלחת מן האמבט במים ולאפשר לו להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ודא כי הצלחת לא ארוגה בדיקה ויזואלית.
  11. שוטפים את התאים עם 60 μl לכל טוב של פי שלושה 1x PBS (5 דקות כל אחד). הוסף PBS עם פיפטה רב ערוצי למזוג PBS על ידי היפוך לצלחת.
  12. השתמש פיפטה רב ערוצי להוסיף 40 μl לכל טוב של חיץ חסימת דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את חוצץ חסימת ידי היפוך לצלחת ו decanting.
  13. הוסף 40 μl של עכבר אנטי אנושי Ki-67 (1: 200) ועז אנטי אנושי PDX-1 (1: 100) נוגדנים מדוללים חסימת חיץ היטב כל דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  14. למחרת, למזוג את פתרון האנטי-הגוף לשטוף את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) כפי שתואר לעיל. למזוג PBS.
  15. הוסף 40 μl לכל טוב של מדולל (1: 200) החמור biotinylated אנטי עכבר IgG והחמור rhodamine מצומדות IgG נגד עז בחסימת המאגר. דגירה עבור שעה 1בטמפרטורת החדר.
  16. שוטפים את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. הוסף 40 μl של בדילול (1: 400 בחסימת המאגר) streptavidin מצומדות-והעמסת היטב כל אחד. דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. שוטפים את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. הוסף 40 μl לכל טוב של DAPI (300 ננומטר בחסימת המאגר) דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  18. שטפו תאים עם 1x PBS פעמיים ולהשאיר תאים 40 μl 1x PBS. הצלחת מוכנה כעת להיות מנותח.

7. ניתוח שכפול β-Cell

הערה: פרוטוקול assay יש לקבוע עבור מיקרוסקופ הקרנת התכולה הגבוה המשמש למדידה שכפול β-cell. בהרכב הפשוט ביותר, פרוטוקול זה הוא assay שני צבעים שבו סמן זהות ממשמש להגדרה-תאי β (PDX-1 + -cells) ועם סמן שכפול (Ki-67) משמש כדי להגדיר אירועי חלוקת תא.

  1. לזהות עצמים (β-תאים) מבוסס על averagדואר עוצם קרינה של מכתים PDX-1 (549 מסנן ננומטר) בתוך מעגל משוער (אורך: רוחב <1.6) בתוך שטח פיקסל הצפוי של גרעין β-cell (איור 2 א).
  2. לאחר מכן, לקבוע הגדרות לזהות אירועים שכפול (Ki-67-חיוביות) בהתבסס על עוצמת הקרינה הממוצעת (485 מסנן ננומטר) בתוך השטח PDX-1 + (איור 2B).
    הערה: פעמי חשיפה חייבות להיות קבועות על מנת לאפשר השוואה עוצמת פיקסל על פני תמונות. פרמטרי פרוטוקול Assay מותאמים כך שיחות מכונית עקביות לכלול אגרגטים מכתימים, פסולת תא ספציפיים שיכול להשפיע על איכות נתונים לרעה.
  3. לנתח מינימום של 500 β-תאים לכל היטב על מנת למקסם את השתנות דיוק ולהגביל.
    הערה: מדד שכפול β-תאי בסיס בתרבויות איון חולדה צפוי להיות 0.5 - 3%. בדרך כלל, 40 תמונות לכל טוב הוא יותר מהדרוש כדי לזהות 500-תאי β.
  4. לפני הניתוחהצלחת כולה, לנתח negative- נבחרים (DMSO שטופלו) ו-בקרה חיובית (5 iodotubercidin [1 מיקרומטר] או דיפירידאמול [15 מיקרומטר]) -treated בארות להעריך את תוקפו של פרוטוקול assay. כאשר assay מוקם כראוי, תרכובות בקרה חיוביות להשרות לפחות עלייה כפולה באחוז המשכפל את תאי β.
  5. קראו את הצלחת כולה פעם פרוטוקול assay מקבל תוקף.

תוצאות

כדי להעריך β-cell או שכפול תאי α, פרוטוקול assay בארבעת צבעים נדרשים. ראשית, אובייקטים מזוהים על ידי מכתים DAPI (ערוץ 1, 386 ננומטר). לאחר מכן, β-תאי (אירוע 1) נספרים: יצירות כי שיתוף להביע PDX-1 + (ערוץ 2, 650 ננומטר) ואינסולין פרי-גרעיני (ערוץ 3, 549 ננומטר). בהמשך לכ...

Discussion

שיטות ניסיוניות ללימוד המסלולים המולקולריים השולטים צמיחת β-cell והתחדשות הן כלים חשובים לחוקרי סוכרת. בזאת, פלטפורמת הקרנה מבוססת עכברוש-איון לזהות ולאפיין לגירוי-מולקולה הקטנה של שכפול β-cell מוצג.

בעוד רוב ההיבטים של פרוטוקול זה ...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
250 g male Male Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 cm teeth tisuue forcepsFine Science Tools11021-12
11.5 cm fine scissorsFine Science Tools14058-11
14.5 cm surgical scissorsFine Science Tools14001-14
16 cm curved forcepsFine Science Tools11003-16
12 cm curved hepostatFine Science Tools13011-12
12 cm scalpel handleFine Science Tools10003-12
Tissue sieve-30 meshBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA unitsVitaCyte005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)Gibco24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077SigmaH-1077to make histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 mlHycloneSH30118.03
Hanks' Balanced Salt solutionHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose HycloneSH30021.01
Functionality/Viability Solution Mediatech99-768-CV
RPMI1640 media HycloneSH30096.01to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-lineAvailable upon requestto make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) MP Biomedicals1670049
Formamide 500 mlFisher BioReagentsBP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)Vector LaboratoriesH-3300to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, AnhydrousEMD ChemicalsDX0145-1to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibodyBD Biosciences556003
Goat anti-human PDX-1 antibodyR&D SystemsAF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibodyDako2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibodyDako2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibodyDako2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibodyabcamab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated InvitrogenS32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Disposable Reagent Reservoir 25 mlSorenson BioScience39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plateBD Falcon353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plateCostar3603
Multi-channel pipettorCostar4880
12-channel vaccume aspiratorDrummond3-000-096
Cell ScraperFalcon353085
Isotemp Water Bath Model 2223 Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTIThermo Scientific

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113cellKi 67PDX 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved