الفئران العضلة القابضة وتر الإصابات وجراحة إصلاح

Summary

والأوتار المثنية في اليد أصيب عادة، مما يؤدي إلى اختلال وظائف اليد. ومع ذلك، يتم الاستجابة شفاء ندبة الأنسجة لا تتميز بشكل جيد. وأظهر نموذج الفئران الشفاء المثنية وتر هنا. هذا النموذج يمكن أن تعزز الفهم الشامل لعملية الشفاء، وتقييم أساليب علاجية لتحسين الشفاء.

Abstract

وتر يربط العضلات والهيكل العظمي والعظام، وتسهيل حركة ما يقرب من كامل الجسم. في اليد والأوتار العضلة القابضة (FTS) تمكن انثناء الأصابع واليد وظيفة عامة. إصابات في FTS شائعة، وغالبا ما يتم التئام مرضية بسبب ندبا الزائدة والتصاقات بين الوتر والأنسجة المحيطة بها. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن المكونات الجزيئية والخلوية للإصلاح FT. تحقيقا لهذه الغاية، وهذا نموذج الفئران من إصلاح FT الذي يلخص جوانب كثيرة للشفاء في البشر، بما في ذلك مجموعة وضعف الحركة ونقص الخصائص الميكانيكية، وقد وضعت وصفها سابقا. هنا يتم توفير مظاهرة في عمق هذا الإجراء الجراحي، التي تنطوي على transection وإصلاح لاحقة في وتر العضلة القابضة لأصابع إبهام اليد (إف دي إل) في مخلب هند الفئران. هذه التقنية يمكن استخدامها لإجراء تحليل النسب من أنواع مختلفة من الخلايا، وتقييم تأثير زيادة الجين أو فقدان وظيفة، ولاختبار ايفيcacy من التدخلات الدوائية في عملية الشفاء. ومع ذلك، هناك نوعان من القيود الأساسية لهذا النموذج: ط) وتر إف دي إل في منتصف جزء من مخلب هند الفئران، حيث تحدث transection والإصلاح، لا يحيط بها غمد الزليلي. لذلك هذا النموذج لا يأخذ في الحسبان إمكانية مساهمة غمد لعملية تشكيل ندبة. ب) لحماية سلامة الموقع إصلاح، يتم تحرير FT عند تقاطع myotendinous، وخفض القوات الميكانيكية للوتر، من المرجح أن تسهم في زيادة تكوين ندبة. وقد أثبتت عزل خلايا كافية من النسيج الحبيبي من FT أثناء عملية الشفاء لتحليل تدفق cytometric تحديا. علم الخلايا الطرد المركزي لتركيز هذه الخلايا هو أسلوب بديل المستخدمة، ويسمح لجيل من الاستعدادات الخلية التي مناعي وضع العلامات لا يمكن أن يؤديها. مع هذا الأسلوب، وتحديد حجم الخلايا أو البروتينات من الفائدة خلال الشفاء FT يصبح ممكنا.

Introduction

الأوتار المثنية في جهة العمل بالتنسيق مع العضلات الباسطة من الساعد والأغماد الرقمية لتمكين انثناء من الأرقام واستيعاب وظيفة اليد. الأوتار المثنية تشغيل على طول الجانب الراحي من اليد. هذا الموقع سطحية نسبيا غالبا ما يؤدي إلى إصابة الأوتار المثنية خلال صدمة في اليد. الأوتار شفاء من خلال استجابة ندبا بدلا من تجديد وتر العادي الأنسجة ^1. في حين أن هذا ندبا توفر استمرارية لوتر، وظيفة وانخفض بشكل كبير نسبة إلى وتر صحي. وتتميز المركبة الأنسجة وتر-ندبة من قبل الخواص الميكانيكية اختلال ^1، مما يجعل الأوتار إصلاحه أكثر عرضة للتمزق. وبالإضافة إلى ذلك، ندبا تفتقر إلى تنظيم وتر الكولاجين بنية الألياف الأصلي، مما أدى إلى زيادة في حجم وتر وبكميات كبيرة. ونظرا للقيود التشريحية وحدة وتر-غمد، وحتى زيادة متواضعة في حجم وتر يمكن الحمراء بشكل كبيرفوسي وظيفة مزلق للوتر، وبالتالي مجموعة مكونة من الحركة وظيفة اليد.

قبل إلى وقوع إصابات في عام 1960 إلى الأوتار المثنية، ولا سيما في المنطقة الثانية من جهة، لم إصلاحه بشكل روتيني بسبب مضاعفات خطيرة في تضميد الجراح التي نشأت مع هذه الإصلاحات ^2. وقد أحيلت هذه المنطقة من ناحية باسم "المنطقة الحرام" ^3. ومع ذلك، فإن التحسينات في التقنيات الجراحية، وأنماط خياطة والبروتوكولات إعادة التأهيل والعلاج الفيزيائي قد تحسنت بشكل كبير نتائج المثنية إصلاح وتر ^2. وعلى الرغم من هذا التقدم، ما يصل إلى 40٪ من إصلاحات تؤدي إلى تشكيل التصاق كافية لإعاقة وظيفة اليد ^(4). لذلك، لا بد من نهج البيولوجي لتحسين الشفاء. للأسف، لا يعرف إلا القليل جدا عن عملية الشفاء وتر على المستوى الخلوي والجزيئي. وهكذا، كان الهدف هو تطوير نموذج الفئران التي يمكن استخدامها لتحسين التفهم الأساسيغرام من المكونات الخلوية والجزيئية لالمثنية الشفاء وتر واستجابة تشكيل ندبة، وذلك كوسيلة لتحديد أهداف علاجية جديدة لتحسين الشفاء.

وكانت النماذج الحيوانية أكبر دور فعال في تعزيز فهم عملية الشفاء المثنية وتر. وقد أثبتت الكلاب والأرانب دراسات كل من قدرة الشفاء الذاتية وخارجي الأوتار المثنية ^5،6، على أهمية الحركة السلبية التي تسيطر عليها في وقت مبكر في التقليل من تشكيل التصاق بالنسبة لتجميد ^7، فضلا عن آثار أنماط خياطة مختلفة على عملية الشفاء ^{8 9.} وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج الكلاب مفيدة في اختبار نهج النسيج الهندسة متعدية لتحسين الشفاء ^10. ومع ذلك، هناك العديد من المزايا الهامة في استخدام نموذج الفئران بالنسبة لنموذج الحيوانات الكبيرة، بما في ذلك التكاليف النسبية، وتوفر الكواشف محددة الفئران، وسهولة توليد كنوك العالميأو يبني حذف / overexpression الأنسجة محددة الرافضة ك. وعلاوة على ذلك، فإن أوجه التشابه وظيفية بين الإنسان والفئران فيما يتعلق الأوتار المثنية ¹¹ تشير إلى فائدة محتملة في تطوير نموذج الفئران.

تطوير نموذج الفئران من transection المثنية وتر وإصلاح يحاكي جوانب كثيرة من الشفاء السريري، بما في ذلك تشكيل وفيرة ندبا والخواص الميكانيكية ضعف. النموذج الذي وصفها هنا ليست خلاصة الحقيقي للممارسة السريرية بسبب transection من إف دي إل عند تقاطع myotendinous من أجل حماية الموقع إصلاح. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج لا يأخذ في الحسبان مساهمة خلايا غمد الزليلي للاستجابة الشفاء، حيث لا يوجد غمد الزليلي الذي يغطي منتصف جزء من وتر التي يحدث فيها إصلاح. وعلى الرغم من هذه القيود، وهذا النموذج في الاستفادة من مجموعة توليد الالتصاقات التي تحد الحركة، والذي لم يتم حتى الآن أثبتت في نماذج الفئران أن أكثر كلوساعل تقريب السيناريو السريري. وقد استخدم هذا النموذج لتقييم نماذج الماوس خروج المغلوب ^12،13، واختبار النهج الدوائية المختلفة لتحسين الشفاء ^14-17. تحليل النسيجي لهذا النموذج، وذلك باستخدام المناعية وفي الموقع التهجين، يمكن أن توفر معلومات هامة في لتوطين الجينات والبروتينات الأساسية أثناء الشفاء. ومع ذلك، توفر الأنسجة سوى التحليل المكاني مستعرضة ولا تسمح الكمي في جميع أنحاء الأنسجة بأكملها. التدفق الخلوي يمثل نهجا أكثر الكمي، ولكن فقط لعدد محدود جدا من الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة الشفاء وتر في نموذج الفأر، وانخفض هذا العدد مرة أخرى خلال خطوات التثبيت، permeabilization، والغسيل. أخذ هذا في الاعتبار ل، وتدفق يصبح الخلوي نهج غير عملي نظرا لعدد من الحيوانات التي ستكون مطلوبة. ضروري طريقة بديلة للحفاظ على غالبية هذه الفئة من السكان الخلايا الصغيرة من أجللمزيد من تميز الوسط الشفاء. الطريقة المستخدمة لتحقيق ذلك، كما هو موضح هنا، ينطوي على تركيز الخلايا المعزولة عن طريق الطرد المركزي الخلايا على شريحة زجاجية، تليها مناعية. في هذه الدراسة ايدو (5 إيثينيل-2'deoxyuridine، التناظرية ثيميدين) تم استخدام التأسيس ووضع العلامات لاحق لتحديد حالة التكاثري النسبية للخلايا في الموقع الشفاء. هذا النهج يمكن تطبيقها على اختبار فعالية من العلاجات الدوائية على تكاثر الخلايا، الجينات الضربة القاضية، أو overexpression، أو لتحديد وقياس السكان مختلفة من الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت لجنة جامعة للبحوث الحيوان في جامعة روتشستر جميع التجارب على الحيوانات. / استخدمت 6J الفئران عشرة لمدة 12 أسبوعا من العمر C57BL الإناث.

1. إعداد الحيوانات لجراحة العضلة القابضة وتر (~ 15 دقيقة)

1. الأدوات الجراحية الأوتوكلاف لتعقيم، وارتداء القفازات المعقمة في جميع أنحاء، والحفاظ على مجال التشغيل العقيمة.
2. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) مع حجم الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) المقابلة لوزن الجسم. تأكيد عمق التخدير عن طريق غياب منعكس إصبع القدم قرصة.
3. إدارة التسكين وقائية (البوبرينورفين، ،05-،1 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد. تطبيق مرهم للعين لمنع العينين من الجفاف.
4. إعداد موقع الجراحية التي تقليم الفراء على أطرافه الخلفية بأكمله. تعقيم الجلد عن طريق تنقية بالتتابع مع اليود البوفيدون، تليها 70٪ من الإيثانول، ومرة ​​أخرى مع اليود البوفيدون.

معشوقة = "jove_title"> 2. الفئران العضلة القابضة وتر الإصابات وجراحة إصلاح (~ 10 دقيقة)

1. العثور على العضلة القابضة لأصابع إبهام اليد (إف دي إل) وتر، وينظر بشكل سطحي في الجانب الأنسي من ربلة الساق. باستخدام مشرط، وجعل صغير 0.5-1 سم شق في الجلد مع مقص الجزئي لفضح وتر.
2. استخدام ملقط لفصل وتر إف دي إل من الأنسجة المحيطة وتتبع ما يصل الى تقاطع myotendinous. قطع وتر في هذا التقاطع مع مقص الربيع الإفراج عنها، مع الحرص على تجنب الشريان الخلفي عظام الساق.
3. إغلاق الجلد مع خيوط النايلون 5-0.
   ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ transection إف دي إل وإصلاح (الخطوات 2،4) باستخدام مجهر تشريحي.
4. جعل شق 3 مم على الجانب posterolateral من مخلب هند باستخدام الربيع مقص الصغرى. سحب بلطف الأنسجة الناعمة المحيطة والعضلات مع ملقط، مع التأكد من تقليل تلف الأنسجة، والتعرف على وتر إف دي إل.
   1. رفع بلطف وتر إف دي إل والقطع تماما باستخدام ميلكرو-مقص. خياطة طرفي إف دي إل وتر معا في نمط كيسلر مع تعديل 8-0 الغرز، وتجنب جفاف وتر عن طريق تبليل بشكل دوري مع المياه المالحة.
   2. استبدال الأنسجة الرخوة والعضلات على وتر، ثم إغلاق شق مع 5-0 خيوط النايلون.
5. وضع الفئران على شريحة مجموعة دفئا إلى 37 درجة مئوية، للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى تعافى من التخدير.
6. مراقبة الفئران بعد العملية لعلامات ضعف أو الإصابة بما في ذلك زيادة اللفظ والفراء تكدرت. حقن البوبرينورفين (50 ميكرولتر / الماوس)، ومسكن كل 12 ساعة حتى الفئران لم تعد تظهر علامات الألم أو الضيق.
7. السماح للفئران لعلاج لمدة 10 يوما بعد الجراحة قبل الاستمرار في الخطوات التالية.
   ملاحظة: خلايا يمكن حصاده في أي وقت نقطة بعد الجراحة. هنا، يتم اختيار 10 يوما لهذه التجارب التمثيلية نظرا لالخلوية عالية نسبيا من الأنسجة في هذا الوقت.

3. Labeliنانوغرام من خلايا الدراجات (~ 10 دقيقة)

1. إعداد ايدو (5 إيثينيل-2'deoxyuridine) حل (10 ملغ / مل في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [دمس]] إلى زيادة القابلية للذوبان).
2. حقن الفئران مع 100 ميكرولتر ايدو (50 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن الملكية الفكرية 24 ساعة السابقة للتضحية.

4. خلايا الحصاد لعلم الخلايا الطرد المركزي (2.5 ساعة، ~ 30 دقيقة اليدين في الوقت المحدد)

1. إعداد 3 ملغ / مل كولاجيناز أنا في برنامج تلفزيوني.
2. الموت ببطء الماوس عن طريق الخنق ثاني أكسيد الكربون بمعدل تدفق ما لا يزيد عن 3 لتر / دقيقة، وتنفيذ خلع عنق الرحم كإجراء الثانوي.
3. تحديد موقع وتر إصلاحها باستخدام الخطوة 2.4 أعلاه، وعزل الأنسجة وتر عن طريق قطع حوالي 2 ملم على جانبي موقع الإصابة مع مقص الصغرى.
   1. نسيج اللحم المفروم مع مشرط في طبق بتري مع 1 مل من 3 ملغ / مل كولاجيناز، ثم تمرير الخليط من خلال 18 G إبرة عدة مرات لتفريق النسيج. جمع الخليط في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي.
   2. هضم الأنسجة وتر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
   3. الأنسجة تدور أسفل (300 x ج لمدة 5 دقائق)، نضح كولاجيناز، resuspend ثم الخلايا / الأنسجة مع الزلال 500 ميكرولتر 3٪ المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
   4. تعليق خلية مرشح من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون لإزالة الحطام وقطع كبيرة من وتر، وتوضع جانبا في الحاضنة 37 درجة مئوية.
   5. وضع الأنسجة وتر في أنبوب آخر الطرد المركزي 1.5 مل، وتحديث مع 1 مل من محلول كولاجيناز، pipetting صعودا وهبوطا إلى المزيج.
   6. احتضان الأنسجة آخر ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
   7. تدور باستمرار الأنسجة وتر هضمها (300 x ج لمدة 5 دقائق)، ثم resuspend في 500 ميكرولتر 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
   8. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، مع الجمع بين تعليق معزولة في 4.3.3، ثم عد الخلايا مع عدادة الكريات.
   9. غسل الخلايا مرة أخرى مع 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني، resuspend ثم إلى 3-6× 10 ^4/100 ميكرولتر.
4. إرفاق قمع الخلايا إلى شريحة موجبة الشحنة وقفل إلى الناقل الشريحة. إدراج الجهاز بأكمله إلى جهاز للطرد المركزي الخلايا وإضافة تعليق الخلية 100 ميكرولتر إلى القمع. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لتفريق الخلايا إلى الشريحة.

5. سيتولوجية مناعية لكشف ايدو (2 ساعة، 45 دقيقة ~ اليدين في الوقت المحدد)

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات حضانة في الظلام للحد من photobleaching من fluorophores من.

1. خلايا دائرة بالقلم حاجز مسعور للحد من الحل اللازم لاتخاذ الخطوات التالية، ثم إصلاح فورا مع 150 ميكرولتر 3٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   1. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع 150 ميكرولتر 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
   2. خلايا Permeabilize مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 20 دقيقة في RT.
   3. خطوة تكرار غسل كما هو الحال في 5.1.1.
2. إعداد EDU رد فعل cocktتزعج وفقا لتعليمات مجموعة لا تزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
   1. إضافة 150 ميكرولتر كوكتيل على كل شريحة، واحتضان 30 دقيقة في RT.
   2. خطوة تكرار غسل كما هو الحال في 5.1.1.
3. احتضان مع 150 ميكرولتر مباين النووية Hoechst33342 المخفف 1: 2000 في برنامج تلفزيوني مدة 30 دقيقة في RT.
   1. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع 150 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
4. إضافة 1-2 قطرات مكافحة تتلاشى المتوسطة إلى خلايا المتصاعدة، ثم ببطء أقل ساترة لمنع الفقاعات.
   1. يسمح للتصاعد المتوسطة لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في RT.
   2. استخدام طلاء الأظافر واضحة لختم ساترة إلى الشريحة.
5. الشرائح صورة في 40X التكبير باستخدام مجهر فلوري مزودة بمرشحات الإثارة / الانبعاثات قادرة على الكشف عن دابي (Hoeschst33342)، وتكساس الأحمر (اليكسا فلور 594).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

إبهام اليد الباسطة لأصابع (إف دي إل) في العضلات، وتقع في ربلة الساق، تعمل لثني أصابع مخلب هند ماوس عبر وتر العضلة القابضة (الموضحة باللون الأزرق في الشكل 1A، ويظهر تشريحيا في الشكل 2A)، الذي يمتد بشكل قريب من myotendinous تقاطع وينهي في الس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتقدم العملية الجراحية لنموذج الفئران من transection كاملة وإصلاح المثنية لأصابع إبهام اليد وتر في هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك يتجلى تطبيق رواية التركيز السكان خلية صغيرة مع أجهزة الطرد المركزي الخلايا، مما يسمح للتحليل الكمي immunocytochemical البيئة الخلوية أثناء الشفاء ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1 ml syringe	BD	309659
30 G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200 g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5
Clear nail polish