Murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação

Resumo

tendões flexores na mão são comumente feridos, levando a mão função prejudicada. No entanto, a resposta de cura de tecido cicatricial não está bem caracterizada. Um modelo murino de cura do tendão flexor é demonstrada aqui. Este modelo pode melhorar a compreensão global do processo de cura e avaliar abordagens terapêuticas para melhorar a cicatrização.

Resumo

Tendão conecta o músculo esquelético e o osso, facilitando o movimento de quase todo o corpo. Na mão, tendões flexores (STF) permitem flexão dos dedos e função geral mão. Lesões ao SFT são comuns, e cura satisfatória é muitas vezes prejudicada devido ao tecido cicatricial em excesso e aderências entre o tendão eo tecido circundante. No entanto, pouco se sabe sobre os componentes moleculares e celulares de reparação FT. Para esse fim, num modelo murino de reparação FT que recapitula muitos aspectos de cicatrização em humanos, incluindo a gama de movimento diminuída e diminuição propriedades mecânicas, tem sido desenvolvido e descrito anteriormente. Aqui uma demonstração em profundidade deste procedimento cirúrgico é fornecido, envolvendo o corte transversal e subsequente reparação do tendão flexor longo dos dedos (FDL) na pata posterior murino. Esta técnica pode ser usado para realizar a análise da linhagem de diferentes tipos celulares, avaliar os efeitos do ganho do gene ou a perda de função, e para testar a eficácia de intervenções farmacológicas no processo de cicatrização. No entanto, existem duas limitações principais para este modelo: i) o tendão FDL na porção média da pata posterior de murino, em que a transecção e reparação ocorrer, não é rodeado por uma bainha sinovial. Portanto, este modelo não leva em conta a potencial contribuição da bainha para o processo de formação de cicatriz. ii) A fim de proteger a integridade do local de reparação, o FT é libertado na junção miotendínea, diminuindo as forças mecânicas do tendão, provavelmente contribui para aumentar a formação de cicatriz. Isolamento de células suficientes a partir do tecido de granulação do FT durante o processo de cura para a análise de citometria de fluxo demonstrou ser um desafio; citologia centrifugação a concentrar-se nestas células é um método alternativo utilizado, e permite a geração de preparações de células no qual a rotulagem de imunofluorescência pode ser realizada. Com este método, a quantificação de células ou proteínas de interesse durante FT cura torna-se possível.

Introdução

tendões flexores da mão de obra em conjunto com os músculos flexores do antebraço e bainhas digitais para permitir a flexão dos dígitos e função de agarrar a mão. tendões flexores executar ao longo do aspecto palmar da mão; este local relativamente superficial muitas vezes resulta em lesões nos tendões flexores durante um trauma para a mão. Tendões curar através de uma resposta do tecido da cicatriz em vez de regeneração do tecido do tendão normal de ^1. Embora este tecido cicatricial dá continuidade ao tendão, função dramaticamente é diminuída em relação ao tendão saudável. Compósitos tecido do tendão-de cicatriz são caracterizados por propriedades mecânicas com deficiência ^1, tornando os tendões reparados mais propensos à ruptura. Além disso, o tecido cicatricial não tem a organização da estrutura de fibra de colagénio de tendão nativa, resultando num aumento do tamanho do tendão e grandes quantidades. Dadas as limitações anatômicas do tendão-bainha, mesmo um modesto aumento no tamanho do tendão pode drasticamente vermelhoUCE a função de deslizamento do tendão, e, portanto, gama dígitos de movimento e função da mão.

Antes de lesões década de 1960 para os tendões flexores, particularmente os da Zona II da mão, não foram rotineiramente reparado devido a complicações graves em cura que surgiram com esses reparos ^2. Esta área da mão foi referido como 'terra de ninguém' ^3. No entanto, as melhorias nas técnicas cirúrgicas, padrões de sutura e protocolos de reabilitação de fisioterapia têm resultados do tendão flexor reparos ² melhorou dramaticamente. Apesar destes avanços, até 40% das reparações resultar na formação de aderência suficiente para impedir a função da mão ^4. Portanto, uma abordagem biológica é necessário para melhorar a cicatrização. Infelizmente, muito pouco se sabe sobre o processo de cicatrização do tendão no nível celular e molecular. Assim, o objectivo foi desenvolver um modelo murino que poderia ser usado para melhorar a understandin fundamentaisg dos componentes celulares e moleculares da cicatrização do tendão flexor e a resposta de formação de cicatrizes, como um meio para identificar novos alvos terapêuticos para melhorar a cicatrização.

modelos animais maiores têm sido fundamentais para aprofundar a compreensão do processo de cicatrização do tendão flexor. Canino e coelho estudos demonstraram tanto a capacidade de cura intrínseca e extrínseca de tendões flexores ^5,6, a importância de movimento passivo precoce controlada para minimizar a formação de aderência em relação à imobilização ^7, bem como os efeitos de diferentes padrões de sutura sobre o processo de cura ^{8 , 9.} Além disso, o modelo canino tem sido útil em testes de abordagens de engenharia de tecidos para melhorar a cicatrização de translação ^10. No entanto, existem várias vantagens importantes na utilização de um modelo de murino em relação a um modelo animal de grande porte, incluindo o custo relativo, da disponibilidade de reagentes específicos de murino, e a facilidade de gerar KNOC mundialk-outs ou construções de deleção / superexpressão de tecidos específicos. Além disso, as semelhanças funcionais entre humanos e ratinhos com respeito aos tendões flexores ¹¹ indicam a utilidade potencial no desenvolvimento de um modelo de murino.

Desenvolvimento de um modelo murino de transecção do tendão flexor e reparação imita muitos aspectos da cura clínica, incluindo a formação de tecido cicatricial abundante e propriedades mecânicas prejudicada. O modelo descrito aqui não é uma verdadeira recapitulação da prática clínica devido à transecção do FDL na junção miotendínea, a fim de proteger o local de reparação. Além disso, este modelo não leva em conta a contribuição de células da bainha sinovial à resposta de cura, já que não há bainha sinovial que cobre a porção média do tendão onde o reparo ocorre. Apesar destas limitações, este modelo tem a vantagem de intervalo de geração de adesões de limitação de movimento, que ainda tem de ser demonstrada em modelos murinos que mais closEly aproximar o cenário clínico. Este modelo tem sido utilizado para avaliar knock-out modelos de ratinho ^12,13, e para testar diferentes abordagens farmacológicas para melhorar a cicatrização ^14-17. As análises histológicas deste modelo, usando imuno-histoquímica e hibridação in situ, pode fornecer informações importantes para a localização de genes-chave e proteínas durante a cura. No entanto, histologia fornece apenas uma análise espacial do corte transversal e não permite a quantificação ao longo de todo o tecido. A citometria de fluxo representa uma abordagem mais quantitativa, mas apenas um número muito limitado de células podem ser isoladas a partir do tecido de cicatrização do tendão no modelo de ratinho, e este número é ainda mais reduzida durante os passos de fixação, permeabilização e lavagem. Tendo isto em conta a, citometria de fluxo torna-se uma abordagem inviável devido ao número de animais que seria necessária. Um método alternativo é necessário para preservar a maioria desta população de células pequenas, a fimpara caracterizar ainda mais o meio de cura. O método utilizado para alcançar este objetivo, mostrado aqui, envolve a concentração das células isoladas através de centrifugação citologia numa lâmina de vidro, seguido por imunocitoquímica. No presente estudo EdU (5-etinil-2'desoxiuridina, um análogo da timidina) incorporação e rotulagem subsequente foi usada para determinar o estado proliferativo relativa de células no local de cicatrização. Esta abordagem pode ser aplicada para testar a eficácia dos tratamentos farmacológicos sobre a proliferação celular, o gene de knock-out ou sobre-expressão, ou para identificar e quantificar as populações de células diferentes.

Protocolo

O Comité University em Pesquisa Animal da Universidade de Rochester aprovado todos os experimentos com animais. Dez-12 semanas de idade C57BL fêmea / 6J foram usadas.

1. Preparação de Animais para a cirurgia do tendão flexor (~ 15 min)

1. instrumentos cirúrgicos autoclave para esterilizar, usar luvas estéreis por toda parte, e manter um campo de cirurgia estéril.
2. Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal (IP) com um volume de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) correspondente ao peso do corpo. Confirmar profundidade de sedação através de ausência de reflexo toe-pitada.
3. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg) via injecção subcutânea. Aplicar pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem.
4. Prepare o local da cirurgia grampeando a pele em toda a pata traseira. Esterilizar a pele por lavagem sequencial com iodo povidona, seguido por 70% de etanol, e novamente com iodo povidona.

2. Murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação (~ 10 min)

1. Encontrar o tendão flexor longo dos dedos (FDL), visto superficialmente na face medial da panturrilha. Utilizando um bisturi, fazer uma pequena incisão 0,5-1 cm na pele com micro-tesouras para expor o tendão.
2. Use uma pinça para separar o tendão FDL do tecido circundante e segui-lo até a junção miotendínea. Cortar o tendão nesta junção com uma tesoura de mola para liberá-lo, tomando cuidado para evitar a artéria tibial posterior.
3. Feche a pele com 5-0 nylon.
   Nota: A transecção e reparação (passos 2.4) FDL deve ser efectuada utilizando um estereomicroscópio.
4. Faça uma incisão 3 milímetros sobre o aspecto póstero da pata traseira com molas micro-tesoura. Gentilmente retirar o tecido mole ao redor e músculo com uma pinça, tomando cuidado para minimizar danos nos tecidos, e identificar o tendão FDL.
   1. Delicadamente levantar o tendão FDL e transecto-lo completamente usando micro-tesoura. Suturar as extremidades do tendão FDL em conjunto num padrão de Kessler modificada com 8-0 suturas, evitando a secagem do tendão por molhar periodicamente com solução salina.
   2. Substituir tecidos moles e músculos sobre o tendão, em seguida, fechar a incisão com 5-0 nylon.
5. Coloque ratos sobre uma lâmina quente conjunto a 37 ° C, para manter a temperatura corporal até recuperado da anestesia.
6. Monitorar ratos pós-operatório para os sinais de deterioração ou infecção, incluindo o aumento da vocalização e de peles de babados. Injectar buprenorfina (50 ul / mouse) como analgésico a cada 12 horas até que os ratos não mostrar sinais de dor ou angústia.
7. Permitir que os ratos para curar por um período de 10 dias após a cirurgia, antes de continuar com as próximas etapas.
   Nota: As células podem ser colhidas em qualquer ponto de tempo de pós-cirurgia. Aqui, 10 dias são escolhidos para estas experiências representativas, dada a relativamente alta celularidade do tecido, neste momento.

3. Labeling de células em divisão (~ 10 min)

1. Prepare EdU (5-etinil-2'desoxiuridina) solução (10 mg / ml em tampão fosfato salino estéril [PBS] + 1% de dimetilsulfóxido [DMSO] para aumentar a solubilidade).
2. Injectar murganhos com 100 ul EdU (50 mg / kg) via injecção ip de 24 horas antes do sacrifício.

4. Células colheita para Citologia centrifugação (2,5 horas, ~ 30 min Hands-on Time)

1. Prepare a 3 mg / ml de colagenase I em PBS.
2. Eutanásia rato através de asfixia com dióxido de carbono a uma taxa de fluxo de não mais de 3 L / min, e efectuar o deslocamento cervical como uma medida secundária.
3. Localize o tendão reparado usando o passo 2.4 acima, e isolar tecido do tendão pelo corte de cerca de 2 mm de cada lado do sítio de lesão com micro-tesouras.
   1. tecido tritura com escalpelo em uma placa de Petri com 1 ml de 3 mg / ml de colagenase, em seguida, passar mistura através de um 18 G agulha várias vezes para quebrar o tecido. Recolhe mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
   2. Digerir tecido do tendão durante 1 hora a 37 ° C com agitação.
   3. Rotação tecido para baixo (300 xg durante 5 min), colagenase aspirado, em seguida, ressuspender as células / tecido com albumina de soro bovino a 500 ul de 3% (BSA) em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
   4. suspensão de células do filtro através de um filtro de células 70 mm para remover detritos e pedaços grandes de tendão, e reserve em um 37 ° C incubadora.
   5. Coloque tecido do tendão em outra 1,5 ml tubo de centrífuga, e refrescar-se com 1 ml de solução de colagenase, pipetando para cima e para baixo para misturar.
   6. Incubar tecido mais uma hora a 37 ° C com agitação.
   7. Girar tecido do tendão digerido (300 xg durante 5 min), em seguida ressuspender em 500 ul de 3% BSA em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
   8. Filtro de suspensão de células através de um filtro de células 70 mm, combinam com suspensão isolado no 4.3.3, em seguida, contar as células com um hemocitómetro.
   9. Lave as células uma vez mais com 3% de BSA em PBS, em seguida ressuspender a 6/3x 10 ^4/100 ul.
4. Anexar um funil de citologia para um slide carregado positivamente e bloquear no suporte de slides. Inserir todo o aparelho numa centrífuga citologia e adicionar 100 ul de suspensão de células para o funil. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos para dispersar as células para a corrediça.

5. Imunocitoqu�ica para detectar EdU (2 h, ~ 45 min Hands-on Time)

Nota: Todos os passos de incubação deve ser realizada no escuro para limitar a fotodegradação de fluoróforos.

1. células de círculo com uma caneta barreira hidrofóbica para minimizar a solução necessária para as seguintes etapas, em seguida, fixar imediatamente com 150 ul de 3% de paraformaldeído em PBS, 15 min à temperatura ambiente (RT).
   1. Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de BSA a 3% em PBS.
   2. permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 em PBS de 20 minutos à temperatura ambiente.
   3. Repita o passo de lavagem como em 5.1.1.
2. Prepare EdU cockt reaçãoAil de acordo com as instruções do kit de não mais do que 30 minutos antes da utilização.
   1. Adicionar 150 ul de coquetel para cada lâmina, incubar 30 min a RT.
   2. Repita o passo de lavagem como em 5.1.1.
3. Incubar com 150 ul de contraste nuclear Hoechst33342 diluído 1: 2000 em PBS 30 min à temperatura ambiente.
   1. Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de PBS 1x.
4. Adicionar 1-2 gotas de médio a células de montagem anti-fade, em seguida, lentamente lamela inferior para evitar bolhas.
   1. Permitir que o meio de montagem para curar durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
   2. Use unha polonês clara para selar a lamela ao slide.
5. imagem desliza em 40X usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de excitação / emissão capazes de detectar DAPI (Hoeschst33342) e Texas Red (Alexa Fluor 594).

Resultados

O flexor longo dos dedos (FDL) muscular, localizada na panturrilha, age para flexionar os dígitos da pata de camundongo traseira através do tendão flexor (esboçada em azul na Figura 1A, e mostrado histologicamente na Figura 2A), que funciona proximal do miotendínea junção e termina nas falanges distais. Neste modelo de cicatrização do tendão flexor, o tendão FDL é seccionado e reparado no mid-pé, proximal à bifurcação para os dígitos da ...

Discussão

O procedimento cirúrgico para um modelo murino de transecção completa e reparação do flexor longo dos dedos tendão é apresentado neste estudo. Além disso, uma nova aplicação de concentrar populações de células pequenas com citologia centrífuga é demonstrada, permitindo a análise imunocitoquímica quantitativa do ambiente celular durante a cicatrização do tendão flexor. Este modelo de reparação do tendão flexor demonstra uma resposta de cura reprodutível, que pode ser utilizado para avaliar mudanç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1 ml syringe	BD	309659
30 G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200 g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5
Clear nail polish