פגיעת גיד מכופף Murine וכירורגיה תיקון

Summary

גידים מכופפים ביד נפצעים נפוץ, מה שמוביל פונקצית יד לקויה. עם זאת, תגובת ריפוי צלקת הרקמות אינה מאופיינת היטב. מודל Murine של ריפוי גיד מכופף מודגם כאן. מודל זה יכול לשפר את ההבנה הכוללת של תהליך הריפוי ולהעריך גישות טיפוליות כדי לשפר את הריפוי.

Abstract

גיד מתחבר שרירים ועצמות השלד, הקלת התנועה של כמעט את כל הגוף. ביד, גידים מכופפים (FTS) לאפשר כיפוף האצבעות ותפקוד יד בכלל. פציעות FTS נפוצות, וריפוי משביע רצון לעתים קרובות נפגע בשל רקמת צלקתית עודפי הידבקויות בין גיד הרקמה שמסביב. עם זאת, מעט מאוד ידוע על הרכיבים המולקולריים התאיים של תיקון FT. לשם כך, מודל Murine של תיקון FT כי משחזר היבטים רבים של ריפוי בבני אדם, כולל מגוון לקוי של תנועה וירידה תכונות מכניות, פותחה שתואר לעיל. הנה הדגמה מעמיקה של הליך כירורגים זה מסופקת, מעורב חיתוך רוחב והתיקון הבא של longus digitorum המכופף (FDL) גיד הכף האחורית בעכברים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבצע ניתוח שושלת של תאים מסוגים שונים, להעריך את ההשפעות של רווח גן או פסד של פונקציה, וכדי לבדוק את האפיםcacy של התערבויות תרופתיות בתהליך הריפוי. עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות מודל זה: i) גיד FDL באמצע החלק של הכף האחורית בעכברים, שבו חיתוך הרוחב והתיקון להתרחש, אינו מוקף נדן סינוביאלי. לכן מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה הפוטנציאלית של הנדן לתהליך היווצרות צלקת. ii) כדי להגן על היושרה של אתר התיקון, FT הוא שוחרר בצומת myotendinous, ומקטין את הכוחות המכאניים של הגיד, תורם סביר היווצרות צלקת מוגברת. בידוד של תאים מספיק מן הרקמה פרור של FT במהלך תהליך הריפוי עבור ניתוח תזרים cytometric הוכיח מאתגר; צנטריפוגה ציטולוגיה להתרכז תאים אלה היא שיטה חלופית בשימוש, ומאפשר הדור של ההכנות התא שעליו תיוג immunofluorescent יכול להתבצע. באמצעות שיטה זו, כימות של תאים או חלבונים בעלי עניין במהלך ריפוי FT הופכת אפשרית.

Introduction

גידים מכופפים בעבודת היד בתיאום עם השרירים המכופפים של אמת נדנים דיגיטליים כדי לאפשר כיפוף של הספרות ותפקוד אחיזה של היד. גידים מכופפים לרוץ לאורך היבט Palmar של היד; יחסית שטחית במיקום זה לעתים קרובות תוצאות פציעות בגידים המכופפים במהלך טראומה אל היד. גידים לרפא באמצעות תגובת צלקת רקמות ולא התחדשות של גיד נורמלי רקמות ^1. בעוד רקמת צלקת זה מספקת המשכיות לגיד, פונקציה דרמטית פחת יחסית גיד בריא. מרוכבים רקמת גיד-צלקת מאופיינים תכונות מכניות לקוי ^1, טיוח הגידים לתיקון סביר יותר להתפקע. בנוסף, רקמת צלקת חסרה את הארגון של מבנה סיבי קולגן גיד הילידים, וכתוצאה מכך לעלייה בגודל גיד וצובר. בהתחשב במגבלות האנטומי של יחידת-נדן הגיד, אפילו עלייה מתונה גודל גיד יכול דרסטי אדוםתחיקת פונקצית הגלישה של הגיד, ולכן טווח ספרה של תנועה ותפקוד יד.

לפני של פציעות 1960 עד הגידים המכופפים, בעיקר אלו המופיעות Zone II של היד, לא תוקנו באופן שיגרתי עקב הסיבוכים החמורים בריפוי שהתעוררו עם תיקונים אלה ^2. אזור זה של היד כונה "שטח הפקר" ^3. עם זאת, שיפורים בטכניקות הכירורגיות, דפוסי תפר ופרוטוקולים שיקום פיזיותרפיה השתפרו באופן דרמטי התוצאות של תיקונים גיד מכופף ^2. למרות ההתפתחויות הללו, עד 40% של תיקונים לגרום להיווצרות הדבקה מספיק כדי לעכב ביד פונקציה ^4. לכן, גישה ביולוגית נדרשה לשפר את הריפוי. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על תהליך ריפוי הגיד ברמה התאית ומולקולרית. לכן, המטרה הייתה לפתח מודל בעכברים שיכולים לשמש כדי לשפר את מבין מה היסודגרם של רכיבים התאיים ומולקולריים של ריפוי גיד מכופף ותגובת היווצרות הצלקת, כאמצעי לזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות כדי לשפר את הריפוי.

גדולים יותר במודלים של בעלי חיים כבר סייעו לקדם הבנה של תהליך ריפוי הגיד המכופף. מחקרים בכלבי ארנב הוכיחו הוא את יכולת הריפוי הפנימית וחיצונית של גידים מכופפים ^5,6, את החשיבות של תנועה פסיבית מבוקרת מוקדם מזעור ביחס היווצרות הידבקות לחוסר מעש ^7, כמו גם את ההשפעות של דפוסי תפר שונים על תהליך הריפוי ^{8 , 9.} בנוסף, מודל הכלבים כבר שימושי בבדיקת גישות רקמות הנדסת translational כדי לשפר את הריפוי ^10. עם זאת, ישנם מספר יתרונות חשובים באמצעות קרוב משפחה במודל Murine מודל חיה גדולה, כולל בעלות היחסית, זמינות של ריאגנטים ספציפיים בעכברים, ואת הקלות של יצירת knoc העולמיk-outs או בונת מחיקה / ביטוי יתר רקמות ספציפיות. יתר על כן, את הדמיון התפקודי בין אדם ועכברים ביחס גידים מכופפים ¹¹ מצביע על התועלת הפוטנציאלית בפיתוח מודל בעכברים.

פיתוח של מודל Murine של מחקת תיקון חיתוך רוחב ו גיד מכופף היבטים רבים של ריפוי קליני, כוללים ההיווצרות של רקמת צלקתית שופעת תכונות מכאניות לקויות. המודל המתואר כאן אינו ששחזור אמיתי של פרקטיקה קלינית עקב חיתוך רוחב של FDL בצומת myotendinous כדי להגן על האתר לתקן. יתר על כן, מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה של תאי נדן סינוביאלי לתגובת הריפוי, כפי שאין נדן סינוביאלי כיסוי החלק באמצע של הגיד שבו התיקון מתרחש. למרות מגבלות אלה, מודל זה יש את היתרון של מגוון המניב של הידבקויות הגבלת תנועה, אשר טרם הוכיח במודלי Murine שיותר קלואיליי להיות קרובים ככל האפשר תרחיש הקליני. מודל זה נעשה שימוש כדי להעריך מודלים עכבר נוק-אאוט ^12,13, וכדי לבחון גישות פרמקולוגיות שונות כדי לשפר את הריפוי ^14-17. היסטולוגית מנתח של מודל זה, באמצעות אימונוהיסטוכימיה ו הכלאה באתרו, יכול לספק תובנות חשובות ל לוקליזציה של גנים מפתח וחלבונים במהלך הריפוי. עם זאת, היסטולוגיה מספק רק ניתוח מרחבי חתך ואינו מאפשר כימות ברחבי הרקמה כולה. Cytometry זרימה מייצגת גישה כמותית יותר, אך רק מספר מצומצם מאוד של תאים יכול להיות מבודד רקמת גיד ריפוי במודל העכבר, ומספר זה ירד עוד יותר במהלך שלבי קיבעון, permeabilization, ואת כביסה. אם תיקח את זה לחשבון, cytometry זרימה הופך גישה ישימה בשל מספר בעלי החיים אשר יידרש. שיטה חלופית יש צורך לשמר את רוב האוכלוסייה תא קטן זה כדיעוד לאפיין את סביבת הריפוי. השיטה המשמשת להשגת יעד זה, המוצג כאן, כרוך ריכוז של תאים בודדים באמצעות צנטריפוגה ציטולוגיה לשקופית זכוכית, ואחריו immunocytochemistry. במחקר הנוכחי EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine, אנלוגי thymidine) התאגדות התיוג הבא שמשה כדי לקבוע את מצב השגשוג היחסי של תאים באתר הריפוי. גישה זו ניתן ליישם על מנת לבחון את היעילות של טיפול תרופתי על התפשטות תאים, גני נוק-אאוט או ביטוי יתר, או לזהות ולכמת אוכלוסיות תאים שונות.

Protocol

ועדת אוניברסיטת על בעלי חיים למחקר באוניברסיטת רוצ'סטר אישר את כל הניסויים בבעלי חיים. עשרה-12 בשבוע C57BL נקבה בת / 6J שמש.

1. הכנת בעלי חיים לכירורגיה גיד מכופף (~ 15 דקות)

1. מכשירי ניתוח חיטוי לעקר, ללבוש כפפות סטריליות במהלך, ולשמור על שדה הפעלה סטרילי.
2. להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal (IP) עם נפח של קטמין (80 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) המתאים למשקל הגוף. אשר עומק הרגעה באמצעות העדר רפלקס הבוהן קמצוץ.
3. נהל שיכוך כאבים מנע (עצירות, 0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית. החל משחת עיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
4. מכין את האתר כירורגית על ידי גזירה את הפרווה על הגפיים האחוריים כולו. לעקר את העור על ידי שפשוף ברצף עם יוד povidone, ואחריו אתנול 70%, ושוב עם יוד povidone.

ילדה = "jove_title"> 2. Murine מכופף פגיעה גיד וכירורגיה תיקון (~ 10 דקות)

1. מצא את longus digitorum המכופף (FDL) הגיד, ראה שטחי בהיבט המדיאלי של העגל. באמצעות אזמל, לעשות חתך 0.5-1 ס"מ קטן בעור עם מספריים מיקרו לחשוף את הגיד.
2. שימוש במלקחיים כדי להפריד את גיד FDL מן הרקמה שמסביב ואת עקבות אותו עד לצומת myotendinous. חותך את הגיד בצומת זה במספריים באביב כדי לשחרר אותו, מקפיד להימנע עורק הטיביאלי האחורי.
3. סגור את העור עם 5-0 תפרי ניילון.
   הערה: חיתוך רוחב ותיקון FDL (שלבים 2.4) צריך להתבצע באמצעות סטראו.
4. ביצוע חתך 3 מ"מ מעל היבט posterolateral של הכף האחורית באמצעות באביב-מספרי מייקרו. בעדינות לחזור בו רקמות שריר הרכות שמסביב עם מלקחיים, והקפד למזער נזק לרקמות, ולזהות את גיד FDL.
   1. בעדינות להעלות את גיד FDL והוא לחלוטין transect אותו באמצעות מיילהקרו-מספריים. לתפור את הקצוות של FDL יחד גיד בדפוס קסלר שונה עם 8-0 תפרים, הימנעות ייבוש של גיד באמצעות הרטבתה עם מי מלח מעת לעת.
   2. חלף רקמות שריר רכים מעל הגיד, ואז לסגור את החתך עם 5-0 תפרי ניילון.
5. מניחים עכברים בשקופית סט חם עד 37 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד התאושש מן ההרדמה.
6. צג עכברים שלאחר ניתוח עבור סימנים לירידת ערך או זיהום כוללים בדיבור מוגבר ופרווה פרועה. להזריק עצירות (50 μl / עכבר) כמו משכך כאבים כל 12 שעות עד העכברים כבר לא מראים סימנים של כאב או מצוקה.
7. אפשר עכברים לרפא לתקופה של 10 ימים שלאחר ניתוח לפני שתמשיך אל השלבים הבאים.
   הערה: תאים ניתן לקצור בכל עת נקודות שלאחר ניתוח. הנה, 10 ימים הם נבחרו ניסויי נציגים אלה בהתחשב cellularity הגבוהה יחסית של הרקמה בשלב זה.

3. Labeling של תאי רכיבה על אופניים (~ 10 דקות)

1. הכן EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine) פתרון (10 מ"ג / מ"ל ​​ב בופר פוספט סטרילי [PBS] + 1% דימתיל sulfoxide [DMSO] להגדיל מסיסות).
2. להזריק עכברים עם 100 μl EDU (50 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה IP 24 שעות לפני להקריב.

4. קציר תאים ציטולוגיה צנטריפוגה (2.5 שעות, ~ 30 hands-on דקות זמן)

1. הכן 3 מ"ג / מ"ל ​​collagenase אני PBS.
2. להרדים העכבר באמצעות מחנק פחמן דו חמצני בקצב זרימה של לא יותר מ -3 ליטר / דקה, ולבצע נקע בצוואר הרחם כאמצעי משני.
3. אתר את הגיד לתקן אותה בעזרת צעד 2.4 לעיל, ולבודד רקמת גיד ידי קיצוץ של כ 2 מ"מ משני צדי במקום פציעה עם מספרי מייקרו.
   1. רקמת בשר טחון עם אזמל בצלחת פטרי עם 1 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל ​​collagenase, ולאחר מכן להעביר התערובת דרך מחט G 18 מספר פעמים כדי לשבור את הרקמה. אסוף התערובת לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
   2. תקציר רקמת גיד במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
   3. ספין רקמות למטה (300 XG במשך 5 דקות), collagenase לשאוב, ואז התאים resuspend / רקמות עם 500 μl 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
   4. תא ההשעיה סינון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר להסיר פסולת חתיכות גדולות של גיד, ומניחים בצד בתוך 37 ° C חממה.
   5. מניחים רקמות גיד לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל אחר, ולרענן עם פתרון collagenase 1 מ"ל, pipetting מעלה ומטה כדי לערבב.
   6. דגירה רקמת עוד שעה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
   7. ספין למטה רקמת גיד מתעכל (300 XG במשך 5 דקות), resuspend אז BSA 500 μl 3% ב PBS על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
   8. סנן השעית תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, לשלב עם ההשעיה מבודדת 4.3.3, ואז לספור תאים עם hemocytometer.
   9. שטפו תאים פעם נוספת עם 3% BSA ב PBS, ואז resuspend 3-6x 10 ^4/100 μl.
4. צרף משפך ציטולוגיה לשקופית בעלי מטען חשמלי חיובי וכלא לתוך המוביל שקופית. הכנס את המנגנון כולו לתוך צנטריפוגות ציטולוגיה ולהוסיף 100 השעית תא μl אל המשפך. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות כדי לפזר את התאים על לשקופית.

5. Immunocytochemistry כדי זיהוי edu (2 hr, ~ 45 hands-on דקות זמן)

הערה: כל שלבי הדגירה צריכות להתבצע בחושך להגביל photobleaching של fluorophores.

1. תאים מעגל עם עט מחסום הידרופובי למזער הפתרון הנדרש עבור השלבים הבאים, ולאחר מכן מיד לתקן עם 150 μl paraformaldehyde 3% ב 15 דקות PBS בטמפרטורת החדר (RT).
   1. שטפו פעמיים במשך 5 דקות עם BSA 150 μl 3% ב PBS.
   2. תאים Permeabilize עם 0.5% Triton-X 100 ב 20 דקות PBS ב RT.
   3. שלב לשטוף חזור כמו 5.1.1.
2. כן cockt תגובת eduail בהתאם להוראות ערכה לא יותר מ -30 דקות לפני השימוש.
   1. להוסיף 150 μl קוקטייל כל שקופית, דגירה 30 דקות ב RT.
   2. שלב לשטוף חזור כמו 5.1.1.
3. דגירה עם 150 μl גרעיני counterstain Hoechst33342 בדילול 1: 2,000 ב 30 דקות PBS ב RT.
   1. שטפו פעמיים במשך 5 דקות עם 150 μl 1x PBS.
4. להוסיף 1-2 טיפות לדעוך אנטי הרכבה בינונית לתאים, ואז coverslip התחתון לאט כדי למנוע בועות.
   1. אפשר הרכבה בינונית לרפא לילה בחושך ב RT.
   2. השתמש ברור לק כדי לאטום את coverslip לשקופית.
5. שקופיות תמונה בהגדלה 40X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסנני עירור / פליטה של ​​מסוגלים גילוי DAPI (Hoeschst33342), וטקסס אדומה (אלקסה פלואוריד 594).

תוצאות

Longus digitorum מכופף השרירים (FDL), הממוקמים העגל, פועל כדי להגמיש את הספרות של הכף האחורית עכבר באמצעות הגיד המכופף (התווה בכחול באיור 1A, והראה היסטולוגית באיור 2 א), אשר פועלת proximally מן myotendinous צומת של דבר הוא מגיע הפלנגות דיסטלי. במודל זה של...

Discussion

הליך כירורגי עבור מודל Murine של חיתוך רוחב מלא ותיקון של גיד longus digitorum מכופף מוצג במחקר זה. בנוסף יישום רומן לרכז אוכלוסיות תאים קטנות עם צנטריפוגות ציטולוגיה מודגם, המאפשר ניתוח immunocytochemical כמוני של הסביבה הסלולר במהלך ריפוי גיד מכופף. מודל זה של תיקון גיד מכופף מדגים תג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1 ml syringe	BD	309659
30 G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200 g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5
Clear nail polish