Murine Beugersehne Verletzung und Reparatur Chirurgie

Zusammenfassung

Flexor Sehnen in der Hand sind häufig verletzt, zu einer Beeinträchtigung der Funktion der Hand führt. Allerdings ist die Narbengewebeheilungsreaktion nicht gut charakterisiert. Ein Mausmodell der Beugesehnenheilung wird hier demonstriert. Dieses Modell kann allgemeine Verständnis des Heilungsprozesses zu verbessern und therapeutische Ansätze zu bewerten, um die Heilung zu verbessern.

Zusammenfassung

Tendon verbindet der Skelettmuskulatur und Knochen, Bewegung fast den gesamten Körper zu erleichtern. In der Hand ermöglichen Beugesehnen (FTS) Beugung der Finger und die allgemeine Funktion der Hand. Verletzungen FTS sind häufig, und eine zufriedenstellende Heilung wird oft durch übermäßige Narbengewebe und Verwachsungen zwischen der Sehne und des umgebenden Gewebes beeinträchtigt. Es ist jedoch wenig über die molekularen und zellulären Bestandteile des FT Reparatur bekannt. Zu diesem Zweck ist ein murines Modell FT Reparatur, die viele Aspekte der Heilung beim Menschen, einschließlich gestörter Bewegungsbereich und verringerte mechanische Eigenschaften rekapituliert, entwickelt und oben beschrieben wurde. Hier eine eingehende Demonstration dieses chirurgischen Verfahrens ist vorgesehen, an denen transection und anschließende Reparatur des Flexor digitorum longus (FDL) Sehne im Maus-Hinterpfote. Diese Technik kann verwendet werden, lineage Analyse verschiedener Zelltypen zu führen, um die Auswirkungen von Gen-Gewinn oder Verlust-of-Funktion zu bewerten und die Effi zu testensamkeit von pharmakologischen Interventionen in den Heilungsprozess. Allerdings gibt es zwei primäre Einschränkungen zu diesem Modell: i) die FDL-Sehne im mittleren Teil des murinen Hinterpfote, wo der Durchtrennung und Reparatur auftreten, wird nicht von einer Synovialscheide umgeben. Daher ist dieses Modell nicht berücksichtigt den möglichen Beitrag der Hülle zur Narbenbildung Prozess. ii) Um die Integrität der Reparaturstelle zu schützen, wird die FT am Muskel-Sehnen-Übergang freigegeben, um die mechanischen Kräfte der Sehne abnimmt, wahrscheinlich zu einer erhöhten Narbenbildung beitragen. Isolation von ausreichender Zellen aus dem Granulationsgewebe des FT während des Heilungsprozesses zur Analyse durchflusszytometrischen hat sich als schwierig; Zytologie Zentrifugation diese Zellen zu konzentrieren, ist eine alternative Methode verwendet wird, und ermöglicht es zur Erzeugung von Zellpräparationen, auf dem Immunofluoreszenz Kennzeichnung durchgeführt werden kann. Bei diesem Verfahren wird die Quantifizierung von Zellen oder Proteine ​​von Interesse während FT Heilung möglich.

Einleitung

Flexor Sehnen in der Hand arbeiten gemeinsam mit den Beugemuskeln des Unterarms und digitale Scheiden Beugung der Ziffern und Greiffunktion der Hand zu ermöglichen. Beugesehnen entlang der Palmarseite der Hand laufen; Diese relativ oberflächliche Lage führt oft zu Verletzungen an den Beugesehnen während eines Traumas auf der Hand. Sehnen heilen durch eine Reaktion von Narbengewebe statt Regeneration von normalen Sehnengewebe ^1. Während diese Narbengewebe Kontinuität der Sehne bereitstellt, wird Funktion verringert sich dramatisch auf gesunde Sehne relativ. Tendon-Narbengewebe Komposite werden durch beeinträchtigte mechanische Eigenschaften ^1, dadurch die reparierten Sehnen eher zu Bruch zu machen. Darüber hinaus mangelt es Narbengewebe, die Organisation der nativen Sehnenkollagen Faserstruktur, was zu einer Erhöhung der Sehne Größe und Masse. die anatomischen Einschränkungen der Sehnenscheide Einheit, selbst eine bescheidene Zunahme der Sehne Größe drastisch rot GegebenUCE die Gleitfunktion der Sehne und damit der Bewegung und Handfunktion einstelligen Bereich.

Vor der Verletzungen von 1960 an die Beugesehnen, insbesondere solche , in Zone II der Hand wurden nicht routinemäßig wegen der schweren Komplikationen bei der Heilung repariert , die ² mit diesen Reparaturen entstanden sind . Dieser Bereich der Hand wurde als "Niemandsland" ³ bezeichnet. Allerdings Verbesserungen in der chirurgischen Techniken, Nahtmuster und physikalische Therapie Rehabilitation Protokolle haben sich dramatisch Ergebnisse der Beugesehne Reparaturen verbessert ^2. Trotz dieser Fortschritte bis zu 40% der Reparaturen führen in ausreichender Adhäsionsbildung Handfunktion ⁴ zu behindern. Daher wird eine biologische Ansatz erforderlich Heilung zu verbessern. Leider ist nur sehr wenig auf zellulärer und molekularer Ebene über die Sehne Heilungsprozess bekannt. Somit war das Ziel, ein Mausmodell zu entwickeln, die verwendet werden könnten, die grundlegende understandin zu verbesserng der zellulären und molekularen Komponenten der flexor tendon Heilung und Narbenbildung Antwort als Mittel neue therapeutische Targets zu identifizieren, die Heilung zu verbessern.

Größere Tiermodelle haben dazu beigetragen, bei der Förderung Verständnis des Prozesses der Heilung Beugesehne. Hunde- und Kaninchen Studien haben sowohl die intrinsische als auch extrinsische Heilungsfähigkeit der Beugesehnen ^5,6 gezeigt, die Bedeutung einer frühzeitigen passiven Bewegung gesteuert bei der Minimierung von Adhäsionen in Bezug auf die Immobilisierung ^7, sowie die Auswirkungen unterschiedlicher Nahtmuster auf den Heilungsprozess ^{8 9.} Darüber hinaus hat das canine Modellansätze in Prüfung translatorische gewebe Engineering nützlich gewesen ¹⁰ die Heilung zu verbessern. Allerdings gibt es mehrere wichtige Vorteile in einem murinen Modell relativ zu einem Großtiermodell verwenden, einschließlich der relativen Kosten, Verfügbarkeit von murinen spezifischen Reagenzien und die Leichtigkeit des Erzeugens globalen Knock-outs oder gewebespezifische Löschen / Überexpression Konstrukte. Darüber hinaus zeigen die funktionellen Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Mäusen in Bezug auf Beugesehnen ¹¹ die potentiellen Nutzen eines Mausmodells zu entwickeln.

Entwicklung eines Mausmodell der Beugesehne durchtrennt und die Reparatur imitiert viele Aspekte der klinischen Heilung, einschließlich der Bildung von Narbengewebe reichlich vorhanden und die Beeinträchtigung der mechanischen Eigenschaften. Das hier beschriebene Modell ist keine echte Reprise der klinischen Praxis aufgrund Trennung der FDL am Muskel-Sehnen-Übergang, um die Reparaturstelle zu schützen. Darüber hinaus ist Konto dieses Modell nicht für den Beitrag der Synovialscheide Zellen zur Heilung Antwort, da es keine Synovialscheide ist der Mittelteil der Sehne bedeckt, wo die Reparatur erfolgt. Trotz dieser Einschränkungen hat dieses Modell den Vorteil der Erzeugung Bewegungsbereich beschränkende Verwachsungen, die noch in Mausmodellen, die mehr clos nachgewiesen werden muss,ely das klinische Szenario nähern. Dieses Modell wurde verwendet, Knock-out - Modelle Maus ^12,13, zu bewerten und verschiedene pharmakologische Ansätze zu testen Heilung ^14-17 zu verbessern. Die histologische Analysen dieses Modells, Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung können wichtige Einblicke in die Lokalisierung von Schlüsselgenen und Proteinen während der Heilung bieten. Jedoch stellt die Histologie nur eine Querschnitts räumliche Analyse und Quantifizierung nicht während des gesamten Gewebes ermöglichen. Flow ist Zytometrie eine quantitative Ansatz, aber nur eine sehr begrenzte Anzahl von Zellen aus der Heilungssehnengewebe im Mausmodell, isoliert werden, und diese Zahl wird weiter verringert während der Fixierung, Permeabilisierung und Waschschritte. Wenn man dies in Rechnung, um, Durchflusszytometrie eine undurchführbar Ansatz wird aufgrund der Anzahl der Tiere, die erforderlich wäre. Ein alternatives Verfahren ist notwendig, um die Mehrheit der kleinen Zellpopulation zu erhalten, umweiter zu den Heilungs milieu charakterisieren. Das verwendete Verfahren, dies zu erreichen, ist hier dargestellt, beinhaltet Konzentration der isolierten Zellen über Zentrifugation Zytologie auf einen Glasträger, gefolgt von Immunzytochemie. In der vorliegenden Studie EdU (5-Ethinyl-2'deoxyuridine, ein Thymidin-Analogon) Einbau und nachfolgende Markierung wurde verwendet, um die relativen proliferative Zustand der Zellen bei der Heilungsstelle zu bestimmen. Dieser Ansatz kann die Wirksamkeit von pharmakologischen Behandlungen auf die Zellproliferation, Gen-Knock-out oder Überexpression oder zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedenen Zellpopulationen zu testen, angewendet werden.

Protokoll

Die Universität Ausschuss für Tierforschung an der Universität von Rochester genehmigt alle Tierversuche. Ten-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6J-Mäuse wurden verwendet.

1. Vorbereitung der Tiere für Beugersehne Chirurgie (~ 15 min)

1. Autoklav chirurgische Instrumente zu sterilisieren, tragen sterile Handschuhe im gesamten Gebäude, und ein steriles Operationsfeld halten.
2. Anästhesieren die Maus über intraperitoneale Injektion (ip) mit einem Volumen von Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) Körpergewicht entspricht. Bestätigen Tiefe der Sedierung über Abwesenheit von Zehen Prise Reflex.
3. Verabreichen präemptive Analgesie (Buprenorphin, 0,05-0,1 mg / kg) als subkutane Injektion. Anwenden ophthalmische Salbe zu verhindern Augen vor dem Austrocknen.
4. Bereiten Sie die Operationsstelle durch das Fell auf der gesamten hinteren Gliedmaßen Clipping. Sterilisieren Sie die Haut, indem nacheinander mit Povidonjodid Schrubben, gefolgt von 70% Ethanol und wieder mit Povidonjodid.

2. Murine Beugersehne Verletzung und Reparatur Chirurgie (~ 10 min)

1. Finden Sie den langen Zehenbeugers (FDL) Sehne, oberflächlich in der medialen Seite der Wade gesehen. Mit einem Skalpell, machen einen kleinen 0,5-1 cm Schnitt in der Haut mit Mikro Schere, um die Sehne zu belichten.
2. Verwenden einer Pinzette, die FDL-Sehne zu trennen von dem umgebenden Gewebe und Spuren es dem Muskel-Sehnen-Übergang auf. Schneiden Sie die Sehne an dieser Kreuzung mit Feder Schere um sie zu lösen, wobei darauf geachtet, die A. tibialis posterior zu vermeiden.
3. Schließen Sie die Haut mit 5-0 Nylonnaht.
   Hinweis: Die FDL transection und Reparatur (Schritte 2.4) sollte ein Stereomikroskop durchgeführt werden.
4. Machen Sie einen 3 mm Schnitt über dem dorsolateralen Aspekt der Hinterpfote mit Federmikro Schere. Vorsichtig fahren Sie das umgebende Weichgewebe und Muskeln mit einer Pinzette, um sicherzustellen, Gewebeschäden zu minimieren und die FDL-Sehne zu identifizieren.
   1. Sie vorsichtig die FDL-Sehne erhöhen und es vollständig mi mit transectcro-Schere. Vernähen der Enden der Sehne FDL zusammen in einem modifizierten Kessler Muster mit 8-0 Nähten, die Vermeidung Trocknen der Sehne durch periodisches es mit Kochsalzlösung benetzen.
   2. Ersetzen Weichgewebe und Muskulatur über die Sehne, und schließen Sie den Schnitt mit 5-0 Nylonnaht.
5. Platzieren Mäuse auf einem Objektträger wärmeren Satz auf 37 ° C, die Körpertemperatur zu halten, bis von der Anästhesie erholt.
6. Monitor-Mäuse postoperativ auf Anzeichen einer Beeinträchtigung oder Infektion einschließlich erhöhter vocalizing und zerzauste Fell. Injizieren Buprenorphin (50 ul / Maus) als Analgetikum alle 12 h bis Mäuse nicht mehr Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zeigen.
7. Erlauben Mäuse für einen Zeitraum von 10 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff zu heilen, bevor sie zu den nächsten Schritten fortfahren.
   Hinweis: Die Zellen können jederzeit Punkt nach der Operation geerntet werden. Hier werden 10 Tage für diese repräsentativen Experimenten die relativ hohe Zellularität des Gewebes zu diesem Zeitpunkt gegeben ausgewählt.

3. LABÉLIng Cycling Zellen (~ 10 min)

1. Bereiten EdU (5-Ethinyl-2'deoxyuridine) -Lösung (10 mg / ml in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung [PBS] + 1% Dimethylsulfoxid [DMSO] zur Erhöhung der Löslichkeit).
2. Injizieren von Mäusen mit 100 & mgr; l EdU (50 mg / kg) über intraperitoneale Injektion 24 Stunden vor der Tötung.

4. Ernte Zellen für Zytologie Zentrifugation (2,5 h, ~ 30 min Hands-on-Zeit)

1. Bereiten Sie 3 mg / ml Kollagenase I in PBS.
2. Euthanize Maus über Erstickung mit Kohlendioxid bei einer Strömungsgeschwindigkeit von nicht mehr als 3 l / min, und zervikale Dislokation als Sekundärmaßnahme durchführen.
3. Suchen Sie die reparierte Sehne Schritt unter Verwendung von 2.4 oben und Sehnengewebe isolieren, indem man etwa 2 mm auf beiden Seiten der Verletzungsstelle mit Mikro-Schere schneiden.
   1. Mince Gewebe mit Skalpell in einer Petrischale mit 1 ml 3 mg / ml Kollagenase, dann passieren Mischung durch eine 18 G-Nadel mehrmals um das Gewebe zu brechen. Sammeln Gemisch in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Digest Sehnengewebe für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln.
   3. Spin Gewebe nach unten (300 g für 5 min), Kollagenase absaugen, dann durch Auf- und Abpipettieren mehrmals Zellen / Gewebe mit 500 ul 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS resuspendieren.
   4. Filter Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb Schutt und große Stücke von Sehne zu entfernen und beiseite in einem 37 ° C Inkubator eingestellt.
   5. Legen Sie Sehnengewebe in ein anderes 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und Refresh mit 1 ml Kollagenase-Lösung, Pipettieren nach oben und unten zu mischen.
   6. Inkubieren Gewebe noch eine Stunde bei 37 ° C unter Schütteln.
   7. Spin down verdaute Sehnengewebe (300 g für 5 min), dann resuspendieren in 500 ul 3% BSA in PBS durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
   8. Filter Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb, verbinden sich mit Suspension isoliert in 4.3.3, dann zählen die Zellen mit einem Hämozytometer.
   9. Waschen Zellen noch einmal mit 3% BSA in PBS, dann Resuspendieren bis 3-6x 10 ^4/100 & mgr; l.
4. Bringen Sie einen Zytologie-Trichter auf eine positiv geladene Objektträger und rasten in den Schlittenträger. Legen Sie die gesamte Vorrichtung in eine Zytologie Zentrifuge und fügen dem Trichter 100 ul Zellsuspension. Zentrifuge bei 300 xg für 5 min die Zellen auf dem Objektträger zu verteilen.

5. Immunzytochemie zu erkennen EDU (2 h, ~ 45 min Hands-on-Zeit)

Hinweis: Alle Inkubationsschritte sollten im Dunkeln durchgeführt werden Photobleichens Fluorophore zu begrenzen.

1. Kreis-Zellen mit einer hydrophoben Barriere Stiftlösung zu minimieren, die für Schritte folgen, dann fixieren sofort mit 150 ul 3% Paraformaldehyd in PBS 15 min bei Raumtemperatur (RT).
   1. zweimal für 5 min mit 150 ul 3% BSA in PBS waschen.
   2. Permeabilisieren Zellen mit 0,5% Triton-X 100 in PBS 20 min bei RT.
   3. Wiederholen Waschschritt wie in Abschnitt 5.1.1.
2. Bereiten Sie EdU Reaktion Cocktail gemäß Kit Anweisungen nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch.
   1. In 150 ul Cocktail zu jeder Folie, Inkubation 30 min bei RT.
   2. Wiederholen Waschschritt wie in Abschnitt 5.1.1.
3. Inkubieren mit 150 & mgr; l Kern Gegenfärbemittel Hoechst33342 verdünnt 1: 2.000 in PBS 30 min bei RT.
   1. Zweimal waschen für 5 min mit 150 ul 1x PBS.
4. Fügen Sie 1-2 Tropfen anti-fade Eindeckmediums an Zellen, dann langsam niedriger Deck Blasen zu verhindern.
   1. Lassen Sie Eindeckmediums über Nacht im Dunkeln bei RT zu heilen.
   2. Verwenden Sie polieren klaren Nagel das Deckglas auf die Folie zu versiegeln.
5. Bildfolien bei 40-facher Vergrößerung eines Fluoreszenzmikroskops mit Anregungs- / Emissionsfiltern ausgestattet mit erfassen kann DAPI (Hoeschst33342) und Texas Red (Alexa Fluor 594).

Ergebnisse

Der Flexor digitorum longus (FDL) Muskel, in der Wade befindet, wirkt die Ziffern der Maus Hinterpfote über die Beugesehne (umrissen in blau in 1A und histologisch in 2A gezeigt) zu biegen, die sich von der Muskel - Sehnen läuft proximal Kreuzung und endet in den Endphalangen. In diesem Modell der Beugesehnenheilung wird der FDL - Sehne durchtrennt und in der Mitte Fuß, proximal der Bifurkation in den Ziffern der Hinterpfote (rote Pfeile, Abbi...

Diskussion

Das chirurgische Verfahren für ein Mausmodell der vollständigen Durchtrennung und die Reparatur der digitorum longus Flexor wird in dieser Studie vorgestellt. Zusätzlich wird eine neuartige Anwendung der Konzentration kleiner Zellpopulationen mit Zytologie Zentrifuge gezeigt, was eine quantitative immunocytochemische Analyse der zellulären Umgebung während der Beugesehnenheilung. Dieses Modell der Beugesehnenreparatur zeigt eine reproduzierbare Heilungsreaktion, die verwendet werden können Veränderungen in den He...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1 ml syringe	BD	309659
30 G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200 g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5
Clear nail polish