زرع في وسادة الفأرة المبيض الدهون

Summary

نحن تصف المبيض وسادة بدعة زرع فحص مناسبة للدراسات ظهائر العادية وتحويلها من الجهاز التناسلي للأنثى. لوحة الماوس الدهون تسمح زرع أجزاء الأنسجة كبيرة، يمكن الوصول إليها بسهولة لإجراء عملية جراحية والتصوير، وتوفر البيئة المحلية الأكثر ملاءمة لأنسجة من أصل مولر.

Abstract

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

Introduction

فحوصات لزراعة الأعضاء، والتي تنطوي على إدخال الخلايا والأنسجة في الجسم مواقع محددة في الفئران، تمثل نهجا أساسيا للدراسات تجديد الأنسجة والتسرطن. زرع مثلي الخلايا، وهذا هو، وضعهم في بيئة الأصلي، أهمية خاصة لتوصيف الخلايا الجذعية البالغة. واقترح وجود الخلايا الجذعية الثديية أول من زرع أجزاء الغدة الثديية الظهارية في منصات الدهون الثديية خالية من الغدة من الفئران ^1. واستخدمت المقايسات Engraftment إلى الماوس أنسنة الدهون ^{وسادة 2} إلى تلخيص تطور التجدد المحتملة وطبيعية من الخلايا الظهارية الثدي الأولي الإنسان. وعلاوة على ذلك، كانت التسلسلية والحد من عمليات زرع التخفيف من أنواع الخلايا متميزة ظاهريا في لوحة الدهون الثديية مسح حاسمة لاختبار قدرة التجديد الذاتي والتمايز multilineage من الخلايا الجذعية الثديية ^3-5. المقايسات زرع في combinatأيون مع النسب الجيني تتبع بمثابة دليل على خلية المنشأ في التسرطن الثديية ^5. وتستخدم عمليات زرع الكلى كبسولة عادة لاختبار خصائص الخلايا الجذعية البروستاتا المفترضة ^6. كشفت زرع مثلي من الفأر العادي والأورام وorganoids البنكرياس البشري الجينات والممرات تغيير في سرطان تقدم ^7. كما تم دعم أهمية البيئة المحلية من قبل مظاهرة للتجديد متنوع بعد engraftments من الغدد العرقية في مواقع مختلفة، مثل منصات الثديية الدهون، ومنصات الدهون الكتف، والخلفي الجلد ^8.

عادة ما تستخدم في التجويف البريتوني والجراب المبيض كأماكن لزرع مثلي من الخلايا الظهارية في الجهاز التناسلي للأنثى ^9-12. كل من هذه الأساليب لديها عدد من القيود. حقن داخل الصفاق من الخلايا يؤدي إلى زرع في مناطق مختلفة من التجويف البريتوني، وبالتالي كومplicating مراقبة نمو الخلايا. وعلاوة على ذلك، والاختلافات في المكروية، مثل مدى الأوعية الدموية، الغدد العرقية وتمثيل الخلايا المناعية، قد تكون كبيرة جدا في مناطق مختلفة من التجويف البريتوني. الجراب المبيض لديها حجم محدود للغاية، مما يسمح للحقن لا يزيد عن 10 ميكرولتر من السائل. وهذا يحد بشكل كبير من كمية الخلايا التي يمكن أن تدار. وعلاوة على ذلك، يمكن حقنها داخل الجراب المبيض يكون تماما تحديا تقنيا والإجراء يتطلب قدرا كبيرا من الوقت.

لمعالجة هذه القيود، وقد استفدنا من خصائص منصة الدهون المبيض. الماوس المبيض منصة الدهون لديها حجم كبير، متاخمة لالمبيض وأنبوب الرحم، ويمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق الجراحة. وقد أفيد أن الأرومة الغاذية الخيول يمكن زرعها في لوحة الماوس المبيض الدهون ^13. لكن تفاصيل هذه الطريقة لم تكن وصفها. كما لم يذكر ما إذا كان هذا ليثود يمكن تطبيقها على خلايا وأنسجة البالغين. هنا، نحن تصف نهج يمكن الاعتماد عليها لزرع الماوس والخلايا البشرية من الجهاز التناسلي للأنثى، وتبين أن هذا الأسلوب ينطبق أيضا على زرع الأعضاء على المدى الطويل.

Protocol

وافق جميع الأعمال في الجسم الحي وصفها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة كورنيل.

1. الاستعدادات عينة لالمبيض الدهون وسادة فحوصات

1. العزلة وثقافة الابتدائية توبال الظهارة خلايا (تي)
   1. الموت ببطء المانحة 6- لمن العمر 8 أسابيع البكر تعزيز β أكتين البروتين الفلوري الأخضر (EFGP) أو β-أكتين Discosoma البروتين الأحمر نيون (عن dsRed) الفئران عن طريق CO ₂ إدارة تليها خلع عنق الرحم. تحقق من القتل الرحيم الناجحة التي قام بها قرصة أخمص قدميه.
   2. وضع الماوس الفردية على ثنى ماصة، بطني حتى الجانب، ثم مسح البطن مع الايثانول 70٪. فتح الجلد عن طريق شق الجانبي في خط الوسط الجسم وبأطراف الأصابع سحب الجلد فوق وتحت شق نحو الرأس والذيل من الفأرة.
   3. عقد الصفاق باستخدام الملقط حادة وجعل قطع مع مقص غرامة لفتح تجويف الجسم. دفع بلطف لفائف من intestinالبريد جانبا وتحديد موقع الجهاز التناسلي.
   4. مع ملقط غرامة اختيار واحد قرن الرحم وقطع 0.5 سم فوق النقطة التي تفصل بين قرني الرحم. في حين عقد قرن الرحم، بعيدا تشريح النسيج الضام تعلق على قرن الرحم والأنابيب الرحمية، المبيض والمبيض وسادة دهنية. وضع الجهاز التناسلي تشريح في طبق مع 6 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). المضي قدما في الجهاز التناسلي الثاني.
   5. نقل الطبق إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وغسل الأنسجة 3 مرات في 6 مل العقيمة برنامج تلفزيوني. مواصلة العمل تحت المجهر تشريح تقع في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. الاستيلاء على قرن الرحم مع ملاقط غرامة وقطع قرن الرحم من أنبوب الرحم عن طريق قطع عند تقاطع-الرحم البوق. قطع الجراب المبيض المحيطة المبيض باستخدام إبرة 25 G.
      ملاحظة: بعد أن تم إزالة الجراب المبيض، وتشريح كامل ويبقى أنبوب الرحم الفردي في حل برنامج تلفزيوني.
   6. نقل سينغله أنبوب الرحم إلى انخفاض 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على طبق 3.5 سم واللحم المفروم إلى قطع 0.1 مم باستخدام 28 الإبر قياس. نقل إلى 200 العازلة الهضم ميكرولتر 1 (معدلة المتوسطة (DMEM) F12 النسر Dulbecco و() المتوسط ​​هام لتستكمل مع 300 وحدة ^-1 مل كولاجيناز و 100 وحدة ^-1 مل هيالورونيداز) واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   7. بعد الحضانة، إضافة 1 مل 0.25٪ حمض التربسين Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) وتعليق الحل مع مساعدة من طرف ماصة 1 مل (ويعرف أيضا باسم طرف الأزرق) 20 مرة لمدة 3 دقائق. إضافة 5 مل + 4 ° C DMEM / F12 متوسطة (لحم الخنزير) التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني.
   8. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي (600 إطار التعاون الإقليمي، 5 دقائق، درجة حرارة الغرفة (RT))، وإضافة 1 مل العازلة الهضم 2 (DMEM F12 () المتوسط ​​هام لتستكمل مع 7 ملغ مل ^-1 Dispase الثاني و 10 ميكروغرام مل ^-1 ديوكسي ريبونيوكلياز الأول ( الدناز I)). تعليق بيليه الأنسجة 20 مرات مع مساعدة من 1 مل ماصة منظمة الشفافية الدوليةص.
   9. إضافة 5 مل مصل حر كامل متوسطة النمو الماوس الأنبوبي ظهارة (M-TE-GM، الجدول 1).
   10. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (600 إطار التعاون الإقليمي، 5 دقائق، RT). إضافة 1 مل M-TE-GM، تعليق وعدد الخلايا التي عدادة الكريات. البذور 1 × 10 ⁵ الخلايا في 1 مل لكل بئر في لوحة مرفق منخفضة 24 جيدا واحتضان في M-TE-GM عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة لمدة 4 أيام.
   11. تغيير المتوسط ​​كل يوم.
   12. إعداد تعليق خلية واحدة من خلايا تعليق الأساسي TE مثقف من الفئران β أكتين EGFP أو β-الأكتين-عن dsRed.
       1. جمع TE الثقافات تعليق من 24 جيدا لوحات مرفق منخفضة. أجهزة الطرد المركزي (600 إطار التعاون الإقليمي، 5 دقائق، RT)، وتعليق الكريات الخلايا مع 1 مل 0.25٪ التربسين-EDTA. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
       2. وقف النشاط التربسين بإضافة 5 مل DMEM / F12 متوسطة (لحم الخنزير) يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني. جمع الكريات الخلايا بواسطة الطرد المركزي (600 إطار التعاون الإقليمي، 5 دقائق، RT).
   13. الكريات غسل الخلايا مرتين مع 4 مل من البرد برنامج تلفزيوني (4 درجات مئوية)، إضافة 1 مل PBS في الخلية بيليه، وتعليق. عدد الخلايا التي عدادة الكريات ونقل إلى 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي. العمل على الجليد، إضافة 1 × 10 ⁵ خلايا إلى 10 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 10 ميكرولتر الغشاء القاعدي المصفوفة. تعليق ونقل على الجليد إلى غرفة الحيوان.
       ملاحظة: تنفيذ كافة تشريح الأنسجة والعمل والثقافة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية تحت ظروف معقمة.
2. إعداد خط الخلية البشرية مخلد
   1. تنمو بشكل منفصل الفيروسة البطيئة-EGFP و-mCherry المسمى البشرية خلد سطح المبيض الخلية ظهارة lineHIO118 حتى 80-90٪ confluency في 10 سم أطباق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   2. غسل الأطباق مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل 0.25٪ التربسين-EDTA لكل طبق واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة. وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 مل DMEM / F12 متوسطة (لحم الخنزير) يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني. جمعالكريات الخلايا بواسطة الطرد المركزي (600 إطار التعاون الإقليمي، 5 دقائق، RT).
   3. الكريات غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من البرد برنامج تلفزيوني (4 درجات مئوية)، إضافة 1 مل PBS في الخلية بيليه، وتعليق. عدد الخلايا التي عدادة الكريات ونقل إلى 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي.
   4. العمل على الجليد، إضافة 1.0 × 10 ⁶ خلايا Lenti-mCherry المسمى + 1.0 × 10 ⁶ Lenti-EGFP المسمى خلايا إلى 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 10 ميكرولتر الغشاء القاعدي المصفوفة. تعليق ونقل على الجليد إلى غرفة الحيوان.
3. إعداد أنبوب الرحم
   1. تشريح أنابيب الرحم الفردية من 6- إلى 8 أسابيع من العمر البكر الفئران β-الأكتين-عن dsRed في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.1.5. نقل أنابيب الرحم واحدة في انخفاض 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحت المجهر تشريح. حل بلطف أنابيب الرحم بمساعدة من ملاقط و 28 الإبر قياس عن طريق إزالة مسراق البوق، وهو جزء من الرباط العريض التي تدعم شرائح أنبوب الرحم. مكان واحد أنابيب الرحم محلول في قطرة من 200 ميكرولتر الجليد الباردة PBS حتى يتعرض لوحة الدهون المبيض المستلم وعلى استعداد لاستقبال زرع.

2. المبيض الدهون وسادة زراعة

ملاحظة: تطهير الأدوات بين كل جراحة الحيوان. إعداد وترتيب جميع المعدات مقدما. زرع الظهرية إلى اليمين لوحة الدهون المبيض هي تفضيلية لأن هذا يتجنب الطحال. ومع ذلك، قد يكون متلقي زرع في كل من منصات الدهون المبيض.

1. استخدام الفئران مسانج أو الفئران المناعة المختلط الشديد (SCID / NCR) كمتلقين من الخلايا الأولية. للخلايا البشرية، مثل HIO118 الخلايا، استخدام الإيماءة / SCID / غاما الفئران (مجموعة موردي المواد النووية) أو الفئران SCID.
2. تخدير الماوس المتلقي مع حقنة واحدة داخل الصفاق من 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول في جرعة من 0.15 مل / 10 غرام من وزن الجسم. وضع الحيوان على وسادة التدفئة، في غطاء محرك السيارة الحيوانية وتأكيد التخدير المناسبة عن فقدان دواسة المنعكس (قرصة أخمص قدميه). تطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم على العينين لمنع جفاف في حين أنالحيوان تحت التخدير. حقن تحت الجلد الحيوان وكيتوبروفين مسكن بجرعة 4 ملغ / غرام من وزن الجسم لعلاج لآلام ما بعد الجراحة.
   ملاحظة: وكبديل، استخدم الأيزوفلورين للتخدير. وضع الحيوانات في غرفة تحريض وضبط مقياس الجريان الأكسجين إلى 0،8-1،5 لتر / دقيقة والمرذاذ الأيزوفلورين إلى 2-3٪. إزالة الحيوان تخدير من الغرفة، والسماح لها التنفس الأيزوفلورين من قناع وتعيين مقياس الجريان الأكسجين إلى 0.4-0.8 لتر / دقيقة والمرذاذ الأيزوفلورين إلى 1.5٪، ثم تبدأ عملية جراحية.
3. حلق المنطقة الجراحية مع # 40 كليبرز. إزالة الشعر من منطقة 2 أضعاف مساحة الجراحية، وإعداد الجلد حلق مع ثلاثة الدعك مطهر من بوفيدون اليود، تليها 70٪ من الإيثانول، وتغطي مع ثنى العقيمة.
4. نقل الحيوان تحت المجهر تشريح الموجود في خزانة السلامة البيولوجية. كشف الجهاز التناسلي عن طريق شق في موقف الظهراني الإنسي مباشرة فوق لوحة الدهون المبيض.
   ملاحظة: الحرجةخطوة كال: دقيقة شق الجلد يسهل التئام الجروح، فمن المستحسن استخدام مشرط في الخطوة 2.4.
5. باستخدام ملقط غرامة حادة سحب لوحة الدهون المبيض بعناية من خلال شق نحو خط الوسط، والتقليل من تلف الأعصاب والأوعية الدموية الرئيسية.
   خطوة حاسمة: إذا كان النزيف يحدث، ووقف عملية جراحية والنظر في زرع لحيوان مضيف آخر.
6. تحت سيطرة المجهر تشريح مع مساعدة من 28 إبرة قياس مشطوف جعل شق عميق 2-4 ملم في لوحة الدهون المبيض، 3-4 مم فوق المبيض.
   خطوة حاسمة: ضمان أن شق يذهب فقط من خلال نصف لوحة الدهون. ثقب كل طريق للوصول الى الجانب السفلي يسبب تسرب. يكون سريعا والمضي قدما دون تأخير بعد هذه الخطوة.
7. لزرع الخلايا، وملء حقنة (30 إبرة قياس) مع 10-20 ميكرولتر من خلية الطابق السفلي غشاء مصفوفة الخليط وحقن في شق وحة الدهون. لزرع أنبوب الرحم، والتقاط أنبوب الرحم خفة دمأبقت 20 ميكرولتر الغشاء القاعدي مصفوفة على الجليد - ح ملقط غرامة وقعت في 10. باستخدام ميكرولتر ،1-10 / 20 تخرج XL مرشح طرف (تقصير من قبل 3 مم) تلتقط الأنسجة والغشاء القاعدي تعليق مصفوفة والافراج في شق منصة الدهون.
8. انتظر 5 دقائق للغشاء مصفوفة الطابق السفلي ليصلب ووضع الجهاز التناسلي للمرة أخرى في الغشاء البريتوني. إغلاق العضلات مع 2 غرز لخياطة الجراحية والجلد مع اثنين من لقطات جرح صغير أو خياطة الجراحية.
9. كرر الخطوات من 2،4-2،8 لزرع غشاء PBS-الطابق السفلي مصفوفة الخليط في لوحة الدهون كونترا-الوحشي من الحيوانات التي ستكون بمثابة السيطرة.
   خطوة حاسمة: بعد الجراحة وضع الحيوان على وسادة التدفئة، بسبب فقدان الحرارة سريعا في الفئران تخدير.
10. دعونا الحيوانات على التعافي على وسادة التدفئة في قفص الأصلي ومراقبة الحيوانات حتى مستيقظا تماما من التخدير. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على sternaل رقود. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
11. مكان حفنة من كريات الغذاء قبل الرطب داخل القفص بالإضافة إلى الأغذية الجافة في القفص بعد الجراحة. تطبيق المسكنات ما بعد العمليات الجراحية إذا لزم الأمر خلال الأيام القليلة المقبلة، وفحص الجرح يوميا. تطبيق المضادات الحيوية وفقا لبروتوكول الحيوانية المعتمدة في حالة حدوث عدوى الجرح. إزالة مقاطع الجرح 10 أيام بعد الجراحة عندما يكون الجرح قد أغلقت تماما.

3. علم الأنسجة والحصول على الصور

1. الكسب غير المشروع جمع وحفظ
   1. إعداد 4٪ حل لامتصاص العرق عن طريق خلط 26 مل ده ₂ O مع 4 مل 10X برنامج تلفزيوني و 10 مل 16٪ محلول امتصاص العرق.
   2. تشريح في كتلة واحدة، والمغروسة المبيض وسادة دهنية، المبيض، أنبوب الرحم، 0.5 سم الرحم كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.1.4. المكان على الفور في 2 مل 4٪ لامتصاص العرق وإصلاح لمدة 2 ساعة، في RT. من نفس الحيوان، تشريح غير المغروسة،المقابل المبيض نظام منصة الدهون المزروعة مع برنامج تلفزيوني-الطابق السفلي خليط غشاء مصفوفة كعنصر تحكم (راجع الخطوة 2.9). إصلاح وعملية في نفس الطريق.
   3. بعد غسل تثبيت الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، واحتضان بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
   4. للتصوير كامل جبل لوحة الدهون المبيض انتقل إلى الخطوة 3.2.1.
      ملاحظة: بعد الأنسجة الحصول على الصور يمكن تجميد (3.3.1) أو تجهيزها لتضمين البارافين (3.3.2). حضانة بين عشية وضحاها في السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية يحسن نوعية الأنسجة المجمدة.
2. الحصول على الصور
   1. المكان كله جبل أنظمة منصة الدهون المبيض في أطباق برنامج تلفزيوني شغل والصورة باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مرفق برنامج التحصين الموسع ومضان وكاميرا عالية الوضوح اللون، مع 4، 10X الأهداف، ومجهر تشريحي مجهزة مرفق مضان، وكاميرا اللون وخطة آبو 1xWD70 والأهداف ED خطة 1.5xWD45.
3. علم الانسجة
   1. التاليكامل جبل الحصول على الصور (3.2.1) وضع قطرة 200-500 ميكرولتر من تضمين المتوسطة لعينات الأنسجة المجمدة على 2 × 1 سم قطعة من الفيلم المختبر وباستخدام ملقط، نقل الأنسجة إلى الهبوط. التقاط فيلم على حافة واحدة ونقل انخفاض الأنسجة المتوسطة إلى 1.8 قارورة المبردة مل. إغلاق القارورة ويغرق في النيتروجين السائل. تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية.
   2. بدلا من ذلك، المضي قدما في تضمين البارافين العادي. استخدام 20-40 حجم حجم الأنسجة لكل خطوة.
      1. تزج الأنسجة مرة واحدة في 65٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT.
      2. تزج الأنسجة مرة واحدة في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT. في هذه المرحلة يمكن تخزين العينات لمدة أشهر في RT.
      3. تزج الأنسجة مرة واحدة في 90٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT.
      4. تزج الأنسجة مرة واحدة في 95٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT.
      5. تزج الأنسجة مرتين في الإيثانول المطلق (200 دليل) لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT.
      <لى> تزج الأنسجة مرتين في الكلوروفورم لمدة 30 دقيقة، والهز برفق في RT.
      6. تزج الأنسجة مرة واحدة في البارافين لمدة 30 دقيقة، والهز برفق على 58 درجة مئوية.
      7. تزج الأنسجة مرة واحدة في البارافين لمدة 12 ساعة، والهز برفق على 58 درجة مئوية.
      8. تزج الأنسجة مرة واحدة في البارافين لمدة 3 ساعة، في 58 درجة مئوية.
      9. وضع الأنسجة في قوالب الأنسجة المعدنية وملء قوالب مع 58 ° C البارافين. إضافة الأنسجة كاسيت البلاستيك على أعلى من البارافين وتهدئة البارافين ل+4 درجة مئوية. استخراج كتلة البارافين الأنسجة وتخزينها في RT.
         ملاحظة: يجب أن درجة الحرارة البارافين لا تتجاوز 58 درجة مئوية للحفاظ الأمثل للأنسجة مناسبة لتلطيخ المناعى.
   3. بدلا من ذلك، التحضير لتضمين البارافين مع جل تجهيز العينات.
      1. نضح في برنامج تلفزيوني ونقل الأنسجة جبل بأكمله إلى 70٪ من الإيثانول. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. في حمام مائي، عينة سخن تجهيز هلام إلى 60 درجة مئوية.
      2. Pipettه 200 ميكرولتر من هلام معالجة عينة على طبق بيتري اصطف الفيلم المختبر. باستخدام ملقط تشريح غرامة نقل النظام النسيج كله جبل لانخفاض عينة معالجة هلام.
      3. السماح للعينة معالجة جل المكونات ليصلب في درجة حرارة الغرفة، أو يصلب المكونات لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. وضع جزءا لا يتجزأ من النسيج تجهيز عينة هلام في أشرطة الأنسجة الأنسجة التي تقع بين منصات خزعة رغوة. تضمينها في البارافين كما في الخطوات 3.3.2-3.3.2.10.
         ملاحظة: عينة تجهيز تضمين هلام يمنع فقدان ويسمح بالحفاظ على عينات صغيرة الأنسجة الهشة.
         ملاحظة: الأنسجة عن طريق الحفاظ على تجميد أو تضمين البارافين هي مناسبة لتلطيخ المناعى ^14،15.

النتائج

الخلايا والأنسجة التجريبية يمكن زرعها بدقة في لوحة الدهون المبيض تحت المجهر تشريح (الشكل 1). وتشمل الأمثلة الماوس الأساسي خلايا ظهارة الأنبوبي المستمدة من الفئران معربا عن بتواجد مطلق EGFP (الشكل 2A) أو عن dsRed (الشكل 2B) والإنسان خلد سطح المبيض خلايا ظهارة HIO118 ^16،17 الخلايا المسمى مع mCherry وEGFP lentiviruses (الشكل 2C - F). هذا النهج هو أيضا ينطبق على زرع على المدى الطويل من الأجهزة، مثل أنبوب الماوس الرحم (الشكل 3). وفقا لتلطيخ المناعى، سواء مهدبة (FOXJ1 إيجابية ^14)، ويتم الاحتفاظ إفرازية (PAX8 إيجابي ¹⁵⁾ الخلايا في ظهارة الأنبوبي للأنسجة المزروعة (الشكل 3D و E).

الشكل 1: المبيض الدهون وسادة زراعة (A) منطقة مكشوف من زرع (السهم). (ب) يتم إجراء شق من 28 إبرة G (السهم). (C) UT / الطابق السفلي غشاء مصفوفة خليط engraftment بواسطة ماصة (السهم). (D) UT المغروسة (السهم، أحمر، UT من-β أكتين عن dsRed الفئران). FP، وسادة من الدهون. اوف والمبيض. UT، أنبوب الرحم. شريط مقياس = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الكشف عن زرع ماوس الابتدائية الخلايا الطلائية توبال والإنسان مخلد المبيض سطح الظهارة خلايا (A، B) خارج زوائد من الماوس الأساسي خلايا ظهارة الأنبوبي (الأسهم) من الفئران β-الأكتين-EGFP (A، خضراء) وβ أكتين عن dsRed (B، الأحمر) بعد 8 أيام زرع في الماوس مسانج. (C، D) Engraftments الخلايا المختلطة HIO118 (السهام) المسمى إما Lenti-EGFP (الأخضر) أو Lenti-mCherry (أحمر) بعد 10 يوما زرع في الفئران مجموعة موردي المواد النووية. (د) منطقة الموسع من (C، السهم). (E، F) وضعت الكسب غير المشروع بعد 43 يوما زرع الخلايا نفسها كما هو الحال في C، D على الماوس SCID (السهام). م، F، مضان. E، مشرق الميدان، FP، وسادة من الدهون. اوف والمبيض. UT، أنبوب الرحم. (A، B، DF) شريط مقياس = 500 ميكرون. (C) مقياس بار = 1600 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعلان / 54444 / 54444fig3.jpg "/>
الرقم 3: توصيف زرع الرحم أنبوب. (A) أنبوب الرحم الكامل (السهم) من β-الأكتين-عن dsRed الماوس بعد 6 أيام زرع في لوحة الدهون المبيض (السهم، أحمر). (ب) قسم المجمدة الفلورسنت لوحة الدهون مع زرع هو مبين في (A). الأحمر، عن dsRed. الأزرق، 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) counterstaining النووي. (ج) أنبوب الرحم الكسب غير المشروع (السهم) بعد 40 يوما من زرع في مجموعة موردي المواد النووية الماوس المتلقي (السهم). قسم البارافين. ملاحظة الحفاظ على الصحيح من جميع مكونات أنبوب الرحم من حيث المبدأ، وعدم وجود التليف المصاحب زرع والالتهابات. الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين. (D، E) كشف علامات ظهارة الأنبوبي المقترنة مربع الجينات 8 (PAX8) وForkhead مربع J1 (FOXJ1؛ اللون البني النووي، النصال) في خلايا الكسب غير المشروع (سهام) هو مبين في ( C). النظام المناعي. Counterstaining مع الأخضر الميثيل. FP، وسادة من الدهون. اوف والمبيض. UT، أنبوب الرحم. (A) شريط مقياس = 1000 ميكرون. (ب) شريط مقياس = 200 ميكرون. (CE) مقياس بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون	1X DMEM F12 (لحم الخنزير) المتوسطة
L-الجلوتامين	2 مم
pruvate الصوديوم	1 ملم
عامل نمو البشرة	10 نانوغرام مل -1
الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية 2	10 نانوغرام مل -1
الهيدروكورتيزون	500 نانوغرام مل -1
الأنسولين	5 ميكروغرام مل -1
هيئة تنظيم الاتصالاتnsferrin	5 ميكروغرام مل -1
سيلينيت الصوديوم	5 نانوغرام مل -1
الزلال البقري	0.10٪
البنسلين / الستربتوميسين	100 وحدة مل -1 / 100 ميكروغرام مل -1
النسر متوسطة (MEM) الأحماض الأمينية غير الأساسية الأساسية الدنيا	0.1 ملم
بيتا المركابتويثانول	10 -4 M

تذاب ماوس توبال Epithelim النمو المتوسطة (M-TE-GM) مكونات المدرجة في العمود الأيسر في 1X DMEM F12 متوسطة (لحم الخنزير) في تركيزات المشار إليها، العمود الأيمن: الجدول 1. تكوين المتوسط ​​النهائي هو المصل مجانا.

Discussion

أنشأنا المبيض منصة الدهون زرع الفحص الذي يسمح لتسليم دقيقة والكشف عن الخلايا والأنسجة الظهارية. لوحة الدهون إجراء زرع فحص المبيض هو أقل تحديا من الناحية الفنية من حقن intrabursal ^10-12 ويسمح لأكثر تجانسا والموقع الدقيق للخلايا المزروعة بالمقارنة مع حقن داخل الصفاق ^9. كما تناسب بشكل جيد بالنسبة زرع على المدى الطويل من جهاز بأكمله، مثل أنبوب الرحم.

الأهم من ذلك، توفر لوحة الدهون المبيض المكروية مألوفة لظهائر من الجهاز التناسلي للأنثى. يجب أن تكون مناسبة بشكل خاص للدراسات الخصائص الجزيئية والخلوية من المبيض البشري والفأر وخلايا ظهارة الأنبوبي أثناء تجديد والتحول السرطاني. وعلى النقيض من الأجهزة الأخرى، وركزت بعض الدراسات على تحديد وتوصيف الخلايا الجذعية في ظهائر من ص الإناثالجهاز eproductive ^18،19. مثل هذه الدراسات هي ذات أهمية خاصة، إذ يعتقد العديد من أنواع السرطان أن تنشأ من خلايا جذعية للبالغين ^20. لا تزال حتى الان أصول الخلوية من سرطان المبيض الظهاري مثيرة للجدل للغاية ^(18). حساب سرطان المبيض الظهاري لمعظم سرطانات المبيض وهي في 5th مكان بين جميع الوفيات الناجمة عن السرطان من النساء في الولايات المتحدة ^21. وبالتالي تطوير فحص مثلي مع العديد من المزايا على تقنيات زرع القائمة ^9-12 يجب أن يسهل كثيرا من الدراسات في هذا المجال.

ونظرا لموقع سطحي من لوحة الدهون المبيض، نظم التصوير الحيوانات الصغيرة يمكن استخدامها لمتابعة engraftments المسمى مع الفلورسنت قوي أو صحفيين إضاءة الحيوية. كما ينبغي أن يكون من الممكن تحديد الحد الأدنى الغازية عالية الدقة فحوصات التصوير الحية، مثل المجهر غير الخطية ^(22). ويمكن أيضا أن تبقى لوحة الدهون المبيض في الثقافات الجهاز، مما يسمحجي ثقافة ثلاثية الأبعاد من ظهائر العادية والأورام في ظل ظروف تلخص بشكل وثيق تنظيم الخلايا والمصفوفة خارج الخلية. ينبغي أن الدراسات المستقبلية معالجة هذه الاحتمالات الواعدة.

يجب مراعاة العديد من الخطوات الهامة. توفير وسادة التدفئة والحفاظ على القوارض دافئة أثناء الجراحة يحسن كثيرا من معدل البقاء على قيد الحياة. العقم من أدوات التعامل مع لوحة الدهون يضمن أن يتم الاحتفاظ الأنظمة المغروسة عقيمة. في تجربتنا، والنتائج نزيف كبير في تخلف نمو الزرع. الأهم من ذلك، ينبغي بذل الدهون وسادة شق على وجه التحديد بسبب تمزيق لوحة الدهون أو ثقب من خلال أسباب النزيف. وينبغي أن تستخدم التخثر لوقف النزيف عند الضرورة. إذا engraftments لا تتطور، ينبغي النظر على تركيز أعلى من حقن الخلايا. والامتداد الناجحة الأولى يمكن ملاحظتها في أقرب وقت بعد أسبوع من زرع والأكثر engraftments يجب أن يكون واحدا مرئيةشهر بعد العملية. للزرع، والإبر مع أكبر قطر (23-25 ​​G) يمكن استخدامها لمنع القص من الخلايا الكبيرة (أكثر من 10 ميكرون في القطر). ومع ذلك، قد تكون هذه الإبر أكثر الصدمة إلى لوحة الدهون ويجب أن يتم اختبارها استخدامها مسبقا. لتجاربنا استخدمنا 6-8 الاسبوع القديمة المانحة والمتلقية الفئران. للأغراض الفئران الأصغر أو الأكبر سنا يمكن استخدامها. ومع ذلك، قد تحتاج إلى تعديل عدد من حقن الخلايا. فإن حجم أصغر من منصات الدهون المبيض في الجهات المانحة الأصغر سنا في حاجة أيضا إلى النظر فيها.

كما هو الحال مع أي طرق، وهناك بعض القيود المفروضة على الماوس الدهون المبيض زرع وحة الفحص. على الرغم من أن الفئران المناعية المختصة مسانج يمكن استخدامها لالفئران الخلايا / الأنسجة الابتدائية، لدينا تقنية تتطلب مجموعة موردي المواد النووية أو الفئران SCID لزرع المواد البشرية. ومن المرجح ممكن من اجل انسنة لوحة الدهون لدعم نمو الخلايا الظهارية الإنسان. ومع ذلك، فإننا لم تختبر هذا النهج حتى الان. استخدام الحديد الأصغرالذكور قد يؤدي إلى انخفاض تكاليف تربية. ومع ذلك، ناضجة إناث الفئران البكر (عمر 8 إلى 10 أسابيع) لديها وسادة أكبر من الدهون، مما يتيح زرع العينات أكبر. وأخيرا، يجب تدريب العاملين في المختبرات في جراحة الحيوان لضمان التنفيذ في الوقت المناسب والناجح لهذا الإجراء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 gauge needle	BD Becton Dickinson	305122
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)	Kendall	30339	Part Number: 8881500014
basic fibroblast growth factor-2	Sigma-Aldrich	F9786
basement membrane matrix (Geltrex)	Invitrogen	A1413202
β-actin-DsRed mice	The Jackson Laboratory	6051	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actin-EGFP mice	The Jackson Laboratory	3291	C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
bovine albumin	Sigma-Aldrich	A3311
chloroform	VWR	EM-CX1058-1
collagenase/hyaluronidase	Stem Cell Technologies	7912
cryogenic vials	Thermo Scientific Nunc	377267
dispase II	Worthington	NPRO2
DMEM F12 (HAM's)	Corning	10-092-CV
DNaseI (Deoxyribonuclease I)	Stem Cell Technologies	7900
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)	Sakura Finetek	4583
epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E4127
ethanol 200 proof	Koptec	V1001	to prepare 70%
fetal bovine serum	Sigma	F4135
filter tip 0.1-10/20 µl XL	USA Scientific	1120-3810
FOXJ1 antibody	eBioscience	E10109-1632	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
hydrocortisone	Sigma	H0135
Ketoprofen	Zoetis	4396H
laboratory film (Parafilm M)	American National Can	PM-999
L-Glutamine	Corning	25-005-Cl
insulin-transferin-sodium selenite	Sigma-Aldrich	I884
isoflurane, 250 ml	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx
low attachment plate 24-well	Costar	3473
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
metal histology molds	Electron Microscopy Sciences	62527-22
microscope, inverted	Nikon	Eclipse TS 100
microscope, stereo	Nikon	SMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG) mice	The Jackson Laboratory	05557	NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
paraffin (Paraplast, X-TRA)	Fisher Thermo Scientific	23-021-401
PAX8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-030-CV
penicillin streptomycin	Corning	30-002-Cl
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)	NCI-Frederick Animal Production Program	01S11
sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
specimen processing gel (HISTOGEL)	Richard-Allan Scientific	HG-4000-012
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Trypsin-EDTA, 25%	Corning	25-053-Cl