Transplantação no Pad Mouse ovário Fat

Resumo

Nós descrevemos um ensaio transplante moda pad ovário adequado para estudos de epitélios normais e transformadas do trato reprodutivo feminino. A almofada de gordura mouse permite que o transplante de grandes fragmentos de tecido, é facilmente acessível para a cirurgia e de imagem, e fornece o ambiente nativo mais favorável para tecidos de origem de Müller.

Resumo

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

Introdução

Os ensaios de transplante, as quais envolvem a introdução de células e tecidos em locais específicos do corpo em ratos, representam uma abordagem essencial para os estudos de regeneração de tecidos e a carcinogénese. ortotópico transplantes de células, isto é, a sua colocação num meio nativo, são particularmente importantes para a caracterização de células estaminais adultas. A existência de células estaminais mamários foi sugerida primeiro pela transplantação de fragmentos epiteliais da glândula mamária em almofadas de gordura mamaria glândula-livre de ratos ^1. Ensaios de enxerto para rato humanizado gordura pad ² foram usadas para recapitular o desenvolvimento potencial e normal regenerativo das células epiteliais mamárias humanas primárias. Além disso, transplantes de diluição em série e limitantes de tipos de células fenotipicamente distintas para a almofada de gordura mamária apuradas foram cruciais para testar a capacidade de auto-renovação e diferenciação multilinhagens de células-tronco mamárias ^3-5. ensaios de transplante em combination com linhagem genética rastreamento forneceram evidências da célula de origem na carcinogênese mamária ^5. Transplantes cápsula renal são comumente usados ​​para testar as propriedades de próstata putativo células-tronco ^6. Transplante ortotópico de camundongo normal e neoplásico e Organóides pancreáticas humanas revelou genes e caminhos alterados na progressão do cancro ^7. A importância do ambiente nativo também tem sido apoiado pela demonstração de regeneração diversificada após engraftments de glândulas sudoríparas em diferentes locais, como almofadas de mamárias de gordura, ombro bolsas de gordura e pele para trás ^8.

A cavidade peritoneal e da bursa ovariana são geralmente usados ​​como locais para transplante ortotópico de células epiteliais do trato reprodutivo feminino ^9-12. Ambos estes métodos apresentam um número de limitações. A injecção intraperitoneal de células leva a suas implantações em diferentes áreas da cavidade peritoneal, assim, complicating acompanhamento do crescimento celular. Além disso, as variações no microambiente, tais como a extensão da vascularização, inervação e representação de células imunitárias, pode ser muito significativa em diferentes áreas da cavidade peritoneal. A bolsa do ovário tem um volume muito limitada, permitindo que a injecção de não mais de 10 ul de líquido. Isto limita significativamente a quantidade de células que pode ser administrada. Além disso, injecções na bolsa do ovário pode ser bastante tecnicamente desafiante e o processo requer uma quantidade significativa de tempo.

Para resolver estas limitações, temos aproveitado as propriedades almofada de gordura ovarianos. O mouse ovário almofada de gordura tem um tamanho grande, fica ao lado do ovário e da tuba uterina, e é facilmente acessível por cirurgia. Tem sido relatado que o trofoblasto equina podem ser transplantadas para a almofada de gordura do ovário do rato ^13. No entanto, os detalhes deste método não foram descritos. Ele também não foi informado se este meTHOD pode ser aplicada a células adultas e tecidos. Aqui, nós descrevemos um método de confiança para o transplante de células humanas do tracto reprodutor feminino e rato e mostram que este método é também aplicável para a transplantação de órgãos a longo prazo.

Protocolo

Todo o trabalho in vivo descrito é aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Cornell.

1. Preparações de exemplo para o ovário Fat Pad Ensaios

1. Isolamento e Cultura Primária Tubal Epitélio Cells (TE)
   1. Eutanásia dador com 6 a 8 semanas de idade virgem β-actina-Proteína Fluorescente Verde melhorada (EFGP) ou Proteína Fluorescente Vermelha (DsRed) ratinhos β-actina Discosoma-CO ₂ por administração seguido por deslocamento cervical. Verifique a eutanásia bem sucedida por uma pitada dedo do pé.
   2. Coloque um ratinho individual em uma cortina absorvente, ventral lateral-se, em seguida, limpe o abdômen com etanol 70%. Abrir a pele, fazendo uma incisão lateral à linha média do corpo e com a ponta dos dedos puxar a pele acima e abaixo da incisão na direcção da cabeça e cauda do rato.
   3. Segure o peritônio usando uma pinça sem corte e fazer um corte com uma tesoura fina para abrir a cavidade do corpo. Com cuidado, empurre a bobina do intestinum e de lado e localizar os órgãos reprodutores.
   4. Com uma pinça fina pegar um corno uterino e corte de 0,5 cm acima do ponto onde os cornos uterinos separar. Enquanto mantém o corno uterino, dissecar o tecido conjuntivo anexado ao corno uterino, tubas uterinas, almofada de gordura ovário e ovariano. Coloque trato reprodutivo dissecado em um prato com 6 ml estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Prosseguir com a segunda trato reprodutivo.
   5. Colocar a cápsula para uma cabine de segurança biológica e lavar os tecidos 3 vezes em 6 ml de PBS estéril. Continuar o trabalho sob um microscópio de dissecação localizado no armário de Biossegurança. Agarre o corno uterino com uma pinça fina e desligue o corno uterino da tuba uterina, cortando na junção útero-tubária. Cortar a bursa ovariana em torno do ovário usando uma agulha 25 G.
      Nota: Após a bolsa do ovário foi removido, a dissecção está completa e o tubo uterino indivíduo permanece na solução de PBS.
   6. Transferir um single tuba uterina em uma queda de 50 ul de PBS a um 3,5 cm de placa e pique em pedaços de 0,1 mm utilizando 28 agulhas de calibre. Transferir para 200 tampão de digestão ul 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle da Dulbecco () meio de Ham suplementado com 300 unidades de ^ml-1 de colagenase e 100 unidades de ^ml-1 de hialuronidase) e incubar durante 1 hora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora.
   7. Após a incubação, adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e suspender a solução com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de ponta (aka ponta azul) 20 vezes durante 3 minutos. Adicionar 5 ml de + 4 ° C DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 2%.
   8. Recolha de tecidos por centrifugação (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente (RT)), e adicionar 1 ml de tampão de digestão de 2 (DMEM F12 () meio de Ham suplementado com 7 mg mL ^-1 Dispase II e 10 ug ^mL-1 desoxirribonuclease I ( ADNase I)). Suspender sedimento de tecido de 20 vezes com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de TIp.
   9. Adicionar meio completo livre 5 ml de soro de crescimento de camundongo tubária epitélio (M-TE-GM, Tabela 1).
   10. Recolher as células por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT). Adicione 1 ml M-TE-GM, suspender e contagem de células por hemocitômetro. Semente 1 x 10 ⁵ células em 1 ml por poço numa placa de 24 poços e incubar baixo fixação em M-Te-GM a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5% durante 4 dias.
   11. Mudar o meio todos os dias.
   12. Preparar suspensões de células únicas de células TE suspensão primárias cultivadas a partir de murganhos p-actina-EGFP ou β-actina-DsRed.
       1. Recolhe culturas em suspensão de TE de placas de 24 cavidades de fixação de baixo. Centrífuga (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente), e suspendê-peletes de células com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%.
       2. Pare a actividade da tripsina por adição de 5 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação (600 rcf, 5 min, RT).
   13. Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 4 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação. Trabalhar em gelo, adicionar 1 x 10 ⁵ células a 10 uL de PBS, em seguida, adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal.
       Nota: Execute todas dissecção e tecido trabalho de cultura em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis.
2. Preparação de Linha de Células humanas imortalizadas
   1. Separadamente crescer lentivírus-EGFP e -mCherry marcado humana imortalizada lineHIO118 celular do epitélio da superfície do ovário, até 80-90% de confluência em placas de 10 cm a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%.
   2. Lavar pratos duas vezes com 10 ml de PBS, adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por placa e incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de _CO2 a 5%. Parar a reacção por adição de 10 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. coletaros sedimentos celulares por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT).
   3. Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 10 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação.
   4. Trabalhar em gelo, adicionar 1,0 X 10 ⁶ células Lenti-mCherry rotulados + 1,0 x 10 ⁶ Lenti-EGFP células marcadas com 10 ul de PBS. Adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal.
3. Preparação da tuba uterina
   1. Dissecar tubos uterinos individuais a partir de 6 a 8 semanas de idade os ratinhos virgens β-actina-DsRed em PBS como descrito nos passos 1.1.1-1.1.5. Transferir tubos uterinos individuais em uma gota 200 ul de PBS sob um microscópio de dissecção. Suavemente desenrole tubos uterinos com a ajuda de pinças e agulhas de calibre 28 através da remoção do mesossalpinge, uma porção do ligamento largo que é compatível com os segmentos do tubo uterino. Coloque individuais tubas uterinas desenroladas em uma queda de 200 ul PBS gelado até ovário almofada de gordura do destinatário está exposta e preparado para receber o transplante.

2. ovário Fat Pad Transplantation

Nota: Desinfetar instrumentos entre cada cirurgia animal. Preparar e organizar todos os equipamentos com antecedência. transplantes dorsal para a almofada de gordura ovário direito são preferenciais, pois isso evita o baço. No entanto, os destinatários podem ter transplantes em ambas as bolsas de gordura ovarianos.

1. Use ratinhos singénicos ou camundongos Imunodeficiência Combinada Grave (SCID / NCR) como receptores de células primárias. Para as células humanas, tais como HIO118 células, / SCID / gama ratos uso Nod (NSG) ou SCID.
2. Anestesiar rato destinatário com uma única injecção intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a uma dosagem de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar o animal numa almofada de aquecimento, na capa de animais anestesiados e confirmar adequada pela perda de reflexo do pedal (aperto do dedo do pé). Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura, enquanto oanimal está sob anestesia. Injectar o subcutaneamente animal com o Cetoprofeno analgésico a uma dosagem de 4 mg / g de peso corporal para o tratamento de dor pós-cirúrgica.
   Nota: Como alternativa, use o isoflurano para a anestesia. Colocar o animal na câmara de indução e ajustar o medidor de fluxo de oxigénio para 0,8-1,5 L / min e o vaporizador de isoflurano para 2-3%. Remover o animal anestesiado da câmara, deixá-lo respirar isoflurano a partir de uma máscara e definir o medidor de fluxo de oxigênio para 0,4-0,8 L / min e o vaporizador isoflurano a 1,5%, em seguida, iniciar a cirurgia.
3. Raspar a área cirúrgica com # 40 clippers; remover o cabelo de uma área de 2 vezes a área cirúrgica, preparar a pele raspada com três esfrega anti-séptico de iodo-povidona, seguido por 70% de etanol, e cobrir com uma cortina estéril.
4. Mova o animal sob um microscópio de dissecação localizado em uma cabine de segurança biológica. Expor o tracto reprodutor por uma incisão na posição dorsomedial directamente por cima da almofada de gordura do ovário.
   Nota: Critetapa ica: incisão da pele preciso facilita a cura de feridas, a utilização de um bisturi é recomendada na etapa 2.4.
5. Usando uma pinça fina sem corte puxar a almofada de gordura ovário cuidadosamente através da incisão em direção à linha média, minimizando danos aos nervos e vasos sanguíneos principais.
   Passo Crítico: Se ocorrer sangramento, pare a cirurgia e considerar o transplante de um animal hospedeiro diferente.
6. Sob o controlo do microscópio de dissecção com a ajuda de uma agulha de calibre 28 chanfrada fazer uma incisão de 2-4 mm de profundidade dentro da almofada de gordura dos ovários, 3-4 mm acima do ovário.
   passo crítico: Certifique-se que a incisão única atravessa metade da camada de gordura; perfurando todo o caminho até a parte inferior faz com que o vazamento. Seja rápido e proceder sem demora após esta etapa.
7. Para transplantes de células, encher uma seringa (agulha de calibre 30) com 10-20 ul da membrana matriz de mistura de células-cave e injetar na incisão almofada de gordura. Para transplante tuba uterina, pegar a sagacidade tuba uterinah pinça fina e coloque em 10 - matriz de membrana basal 20 l mantido em gelo. Usando um 0,1-10 / 20 l XL formou ponta de filtro (encurtado em 3 mm) pegar a suspensão matriz de tecido e membrana basal e solte na incisão almofada de gordura.
8. Esperar 5 minutos para a matriz da membrana basal para solidificar e colocar o aparelho reprodutor de volta para o peritoneu. Feche os músculos com 2 stiches de sutura cirúrgica e a pele com dois clipes pequena ferida ou sutura cirúrgica.
9. Repita os passos de 2,4-2,8 para transplantar uma matriz de mistura de membrana PBS-cave na almofada de gordura contra-lateral do animal que servirá como controle.
   passo crítico: Após a cirurgia colocar o animal numa almofada de aquecimento, porque a perda de calor é rápida, em ratos anestesiados.
10. Vamos animais recuperar em uma almofada de aquecimento na gaiola nativa e observar o animal até totalmente acordado da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter esternosl decúbito. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
11. Coloque um punhado de peletes alimentares pré-molhados no interior da gaiola para além secar os alimentos na gaiola após a cirurgia. Aplicar analgésicos pós-cirúrgicas, se necessário para os próximos dias e examinar a ferida diariamente. Aplicar antibióticos de acordo com o protocolo de animais aprovados se infecção da ferida ocorre. Remover grampos de feridas 10 dias após a cirurgia, quando a ferida foi totalmente fechada.

3. Histologia e Aquisição de Imagem

1. Coleção do enxerto e Preservação
   1. Preparar solução de paraformaldeído a 4% por mistura de 26 ml _ddH2O com 4 ml de PBS 10X e 10 ml de solução de paraformaldeído a 16%.
   2. Dissecar em um bloco, o bloco enxertados ovário gordura, ovário, trompa uterina, 0,5 centímetros útero, tal como descrito nos passos 1.1.1-1.1.4. Colocar imediatamente em 2 ml de 4% de paraformaldeído e fixar durante 2 h, à TA. A partir do mesmo animal, dissecar o não-enxertadoscontralateral sistema de almofada de gordura ovário transplantado com a mistura de matriz de membrana PBS-cave como um controle (veja o passo 2.9). Fix e processo da mesma forma.
   3. Após lavagem fixação tecidos três vezes com PBS durante 5 min e incubar durante a noite em PBS a 4 ° C.
   4. Para todo o monte a imagem da camada de gordura ovário avançar para o passo 3.2.1.
      Nota: Depois de os tecidos de aquisição de imagem pode ser congelada (3.3.1) ou processados ​​para inclusão em parafina (3.3.2). incubação durante a noite em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C melhora a qualidade de tecidos congelados.
2. Aquisição de imagem
   1. O lugar todo-montar sistemas de almofada de gordura ovarianos em pratos PBS cheios e imagem usando um microscópio invertido equipado com o acessório de epi-fluorescência e câmera colorida de alta definição, com 4, 10x objetivos e um estereomicroscópio equipado com um acessório de fluorescência, câmera colorida e Plano Apo 1xWD70, objectivos ED Plano 1.5xWD45.
3. Histologia
   1. Segueaquisição de imagem todo-mount (3.2.1) coloque uma gota 200-500 mL de incorporar meio de amostras de tecidos congelados em um pedaço 2 x 1 cm de filme de laboratório e usando uma pinça, transferir o tecido para a queda. Pegar o filme em uma borda e transferir a gota tecido de médio para um frasco criogênico ml 1.8. Feche o frasco e mergulhar em azoto líquido. Armazenar tecidos congelados a -80 ° C.
   2. Como alternativa, proceder à inclusão em parafina padrão. Use 20-40 volumes de volume de tecido, para cada passo.
      1. Imergir tecidos uma vez em etanol a 65% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      2. Imergir tecidos uma vez em etanol a 70% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas durante meses à TA.
      3. Imergir tecidos uma vez em etanol a 90% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      4. Imergir tecidos uma vez em etanol a 95% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      5. Imergir tecidos duas vezes em etanol absoluto (200 prova) durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      6. Imergir tecidos duas vezes em clorofórmio, durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      7. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 30 min, agitando suavemente a 58 ° C.
      8. Mergulhe tecidos vez em parafina para 12 horas, agitando a 58 ° C.
      9. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 3 h, a 58 ° C.
      10. Coloque tecidos em moldes de histologia de metal e encher moldes com 58 ° C de parafina. Adicionar uma cassete de histologia de plástico no topo da parafina arrefecer e parafina para 4 ° C. Extraia bloco de parafina de tecido e armazenar a RT.
          Nota: Parafina temperatura não deve exceder os 58 ° C durante a preservação óptima de tecido adequado para coloração imuno-histoquímica.
   3. Alternativamente, Prepare-se para o Parafina com Gel processamento das amostras.
      1. Aspirar o PBS e transferir tecidos Todo-mount a 70% de etanol. Incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Em um banho de água, a amostra de pré-aquecimento para o processamento de gel de 60 ° C.
      2. pipetae 200 ul de gel de processamento de espécimes sobre uma placa de Petri de laboratório filme forrado. Utilizando uma pinça de dissecção fina transferir o sistema de tecido todo-mount à queda espécime de gel de processamento.
      3. Permitir que a amostra tampão de gel de processamento a solidificar à temperatura ambiente, ou solidificar o tampão durante 10 min a 4 ° C.
      4. Colocar o tecido embebido em gel de processamento de espécimes em cassetes de tecido ensanduichada entre a histologia de biópsia almofadas de espuma. Incorporar em parafina como nos passos 3.3.2-3.3.2.10.
         Nota: Specimen processamento incorporação gel evita a perda e permite a preservação de amostras de tecidos frágeis pequenas.
         Nota: Os tecidos congelados ou inclusão em parafina são adequados para coloração imuno-histoquímica ^14,15.

Resultados

As células experimentais e tecidos podem ser transplantadas com precisão na almofada de gordura do ovário sob um microscópio de dissecção (Figura 1). Os exemplos incluem o mouse células primárias de epitélio tubário derivadas de ratinhos que expressam EGFP ubiquamente (Figura 2A) ou DsRed (Figura 2B) e as células humanas imortalizadas superfície do epitélio do ovário HIO118 ^16,17 células marcadas com mCherry EGFP e lentivírus (Figura 2C - F). A abordagem é também aplicável para a transplantação de longo prazo de órgãos, tais como o tubo uterino do rato (Figura 3). De acordo com a coloração imuno-histoquímica, tanto ciliadas (Foxj1 positiva ¹⁴⁾ e células secretoras (PAX8 positiva ¹⁵⁾ são preservados no epitélio das trompas de tecidos transplantados (Figura 3D e E).

Figura 1:. Do ovário do rato gordo Transplantation (A) área exposta do transplante (seta). (B) Uma incisão é feita por uma agulha G 28 (seta). (C) UT / cave matriz da membrana enxerto mistura pela ponta da pipeta (seta). (D) UT enxertada (seta, vermelho brilhante, UT de ratos-DsRed β-actina). FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. Barra de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detecção de Transplantado. Mouse células primárias de epitélio e Tubal humanas imortalizadas superfície do ovário Epitélio células (A, B) para fora tumores de rato primária células epitélio tubário (setas) de ratinhos β-actina-EGFP (A, verde) e de p-actina-DsRed (B, vermelho) 8 dias após o transplante num ratinho singeneico. (C, D) Engraftments de células mistas HIO118 (setas) marcada ou com Lenti-EGFP (verde) ou Lenti-mCherry (vermelho) 10 dias após o transplante em ratos NSG. (D) Área ampliada a partir de (C, seta). (E, F) de enxerto desenvolvida 43 dias após a transplantação de células os mesmos como em C, D de ratinho SCID (setas). AD, F, fluorescência; E, campo claro, FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. (A, B, DF) Barra de escala = 500 mm; (C) Scale bar = 1.600 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Caracterização de Transplante uterina Tube. (A) tuba uterina completa (seta) de β-actina-DsRed rato 6 dias após o transplante na almofada de gordura do ovário (seta, vermelho brilhante). (B) secção congelada fluorescente da almofada de gordura com transplante mostrado em (A). Vermelho, DsRed; Azul, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) contracoloração nuclear. (C) tuba uterina enxerto (seta) 40 dias após o transplante em NSG rato destinatário (seta). seção de parafina. Nota preservação correta de todos os componentes tubário princípio, ea falta de fibrose associada ao transplante e inflamação. Hematoxilina e eosina. (D, E) A detecção de genes marcadores epitélio tubário-box Emparelhado 8 (PAX8) e caixa de forkhead J1 (Foxj1; cor nuclear marrom, pontas de seta) em células do enxerto (setas) mostrados na ( C). sistema de imunoperoxidase. Contracoloração com verde de metilo. FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. (A) Barra de escala = 1,000 m; (B) Barra de escala = 200 mm; (CE) Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente	1x DMEM F12 médio (de Ham)
L-Glutamina	2 mM
pruvate de sódio	1 mM
factor de crescimento epidérmico	10 ng mL -1
Básico factor-2 de crescimento de fibroblastos	10 ng mL -1
hidrocortisona	500 ng mL -1
Insulina	5 ug mL1
Transferrin	5 ug mL1
selenito de sódio	5 ng ml -1
albumina bovina	0,10%
Penicilina / Estreptomicina	100 unidades mL -1 / 100 ug mL1
Meio de Eagle (MEM) ácidos essenciais mínimos aminoácidos não essenciais	0,1 mM
O beta-mercaptoetanol	10 -4 M

Tabela 1:. Rato Tubal Epithelim Meio de Crescimento (M-Te-GM) componentes listados na coluna da esquerda são dissolvidos em meio F12 de DMEM 1x (de Ham) nas concentrações indicadas, coluna da direita. A composição do meio final é livre de soro.

Discussão

Nós estabelecemos um ensaio de transplante de almofada de gordura dos ovários, que permite a entrega precisa e detecção de células epiteliais e tecidos. O procedimento de transplante de ensaio almofada de gordura de ovário é tecnicamente menos exigente do que a injeção intrabursal ^10-12 e permite mais uniforme e localização precisa das células transplantadas em relação à injeção intraperitoneal ^9. Também é bem adequado para o transplante a longo prazo de um órgão inteiro, tal como o tubo uterino.

Importante, a almofada de gordura dos ovários proporciona um micro-ambiente familiar para os epitélios do sistema reprodutivo feminino. Deve ser particularmente adequada para estudos das propriedades moleculares e celulares do ovário de humano e de ratinho e células do epitélio das trompas durante a regeneração e transformação maligna. Em contraste com outros órgãos, poucos estudos têm-se centrado na identificação e caracterização de células-tronco no epitélio da r femininatrato eproductive ^18,19. Tais estudos são de particular importância porque muitos cancros são acreditados para se originam de células-tronco adultas ^20. Ainda origens celulares de cancro do ovário epiteliais permanecem altamente discutível ^18. Cancros do ovário epiteliais são responsáveis ​​pela maioria dos casos de câncer de ovário e está em quinto lugar entre todas as mortes relacionadas ao câncer de mulheres em os EUA ^21. Assim, o desenvolvimento de um ensaio com ortotópico várias vantagens sobre as técnicas de transplante existentes ^9-12 deve facilitar grandemente os estudos nesta área.

Dada a localização superficial da camada de gordura ovário, sistemas de imagens de pequenos animais podem ser usados ​​para acompanhar engraftments marcadas com fluorescente forte ou repórteres bioluminescentes. Também deve ser possível estabelecer ensaios de imagiologia minimamente invasivos alta resolução vivos, tais como a microscopia não-linear ^22. A almofada de gordura dos ovários, também podem ser mantidos em culturas de órgãos, desse modo, permitiring cultura tri-dimensional de epitélio normal e neoplásico sob condições recapitulando estreitamente a organização das células e a matriz extracelular. Estudos futuros devem abordar estas possibilidades promissoras.

Vários passos críticos tem que ser considerada. Proporcionando uma almofada de aquecimento e manter roedores quente durante a cirurgia melhora a taxa de sobrevivência. Esterilidade de instrumentos de manipulação a almofada de gordura garante que os sistemas enxertados são mantidos estéril. Em nossa experiência, significativos resultados de sangramento em retardo do crescimento de transplantes. É importante ressaltar que a almofada de incisão de gordura deve ser feita precisamente porque rasgar a almofada de gordura ou perfurando-o através de causas de sangramento. Coagulantes deve ser usado para parar a hemorragia, como necessário. Se engraftments não se desenvolvem, uma concentração mais elevada de células injectadas deve ser considerada. As primeiras protuberâncias bem sucedidos podem ser observadas tão cedo quanto uma semana após o transplante e mais engraftments deve ser uma visívelmeses após o procedimento. Para o transplante, agulhas com diâmetro maior (23-25 ​​L) pode ser utilizada para prevenir cisalhamento de células grandes (mais de 10 um de diâmetro). No entanto, essas agulhas pode ser mais traumático para a almofada de gordura e seu uso deve ser testada antecipadamente. Para nossas experiências que usaram ratinhos dadores e receptores de idade de 6 a 8 semanas. Em ambas as finalidades ratos mais jovens ou mais velhas pode ser usado. No entanto, o número de células injectadas podem precisar de ser ajustadas. Quanto menor o tamanho de bolsas de gordura ovarianos em doadores mais jovens também precisam ser considerados.

Tal como acontece com qualquer método, existem algumas limitações do ensaio de transplante de almofada de gordura ovário mouse. Embora os ratos imuno-competentes singeneicas podem ser utilizados para murino primários células / tecidos, a técnica requer GFN ou ratinhos SCID para o transplante de material humano. É provável possível para humanizar a almofada de gordura para suportar o crescimento de células epiteliais humanas. No entanto, nós não testei essa abordagem ainda. Uso de Fe mais jovemos machos podem levar a custos mais baixos de reprodução; No entanto, os ratos fêmeas virgens maduras (com idade de 8 a 10 semanas) tem uma almofada de gordura maiores, permitindo assim que o transplante de amostras maiores. Finalmente, o pessoal do laboratório deve ser treinado em cirurgia animal para assegurar a execução oportuna e bem-sucedida do procedimento.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 gauge needle	BD Becton Dickinson	305122
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)	Kendall	30339	Part Number: 8881500014
basic fibroblast growth factor-2	Sigma-Aldrich	F9786
basement membrane matrix (Geltrex)	Invitrogen	A1413202
β-actin-DsRed mice	The Jackson Laboratory	6051	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actin-EGFP mice	The Jackson Laboratory	3291	C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
bovine albumin	Sigma-Aldrich	A3311
chloroform	VWR	EM-CX1058-1
collagenase/hyaluronidase	Stem Cell Technologies	7912
cryogenic vials	Thermo Scientific Nunc	377267
dispase II	Worthington	NPRO2
DMEM F12 (HAM's)	Corning	10-092-CV
DNaseI (Deoxyribonuclease I)	Stem Cell Technologies	7900
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)	Sakura Finetek	4583
epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E4127
ethanol 200 proof	Koptec	V1001	to prepare 70%
fetal bovine serum	Sigma	F4135
filter tip 0.1-10/20 µl XL	USA Scientific	1120-3810
FOXJ1 antibody	eBioscience	E10109-1632	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
hydrocortisone	Sigma	H0135
Ketoprofen	Zoetis	4396H
laboratory film (Parafilm M)	American National Can	PM-999
L-Glutamine	Corning	25-005-Cl
insulin-transferin-sodium selenite	Sigma-Aldrich	I884
isoflurane, 250 ml	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx
low attachment plate 24-well	Costar	3473
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
metal histology molds	Electron Microscopy Sciences	62527-22
microscope, inverted	Nikon	Eclipse TS 100
microscope, stereo	Nikon	SMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG) mice	The Jackson Laboratory	05557	NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
paraffin (Paraplast, X-TRA)	Fisher Thermo Scientific	23-021-401
PAX8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-030-CV
penicillin streptomycin	Corning	30-002-Cl
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)	NCI-Frederick Animal Production Program	01S11
sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
specimen processing gel (HISTOGEL)	Richard-Allan Scientific	HG-4000-012
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Trypsin-EDTA, 25%	Corning	25-053-Cl