השתלת לתוך כרית עכבר השחלות שומן

Summary

אנו מתארים assay השתלת כרית תחביב השחלות מתאים מחקרים של אפיתלים נורמלי טרנספורמציה של מערכת הרבייה הנשית. כרית שומן העכבר מאפשרת השתלה של שברי רקמות גדולים, נגיש בקלות לניתוח והדמיה, ומספקת את הסביבה הטבעית הטובה ביותר עבור רקמות ממוצא Müllerian.

Abstract

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

Introduction

מבחני השתלה, אשר כרוך המבוא של תאים ורקמות למתחמי גוף ספציפיים בעכברים, מייצגים גישה חיונית ללימודים של התחדשות רקמות סרטן. השתלות orthotopic של תאים, כלומר, המיקום שלהם לתוך סביבה מקומית, חשובים במיוחד לאפיון של תאי גזע בוגרים. קיומו של בתאי גזע חלב הוצע לראשונה על ידי ההשתלה של שברי בלוטת חלב אפיתל לתוך רפידות שומן חלב ללא בלוטה של עכברי ^1. מבחני engraftment לרפד שומן העכבר האנושי ² שימשו לשחזר את פיתוח הפוטנציאל ונורמלי ההתחדשות של תאי אפיתל שד ראשוני האדם. יתר על כן, השתלות דילול סדרתי והגבלה של סוגי תאים מובחנים phenotypically לתוך כרית שומן חלב הפינה היו מכריעות על מנת לבחון את יכולת התחדשות העצמית והבחנת multilineage של תאי גזע חלב ^3-5. מבחני השתלה ב הקומבינאטיון עם שושלת גנטית איתור ספק עדויות של התא מוצא חלב סרטן ^5. השתלות כליה הקפסולה משמשות לבדיקת תכונות של תאי גזע הערמונית המשוערת ^6. השתלת orthotopic של עכבר רגיל ו אנטינאופלסטיים organoids לבלב אנושיים גילה גנים ושבילים שינו בהתקדמות סרטן ^7. חשיבותה של סביבת היליד גם כבר נתמכה על ידי הפגנת ההתחדשות מגוונת לאחר engraftments של בלוטות זיעה לתוך במקומות שונים, כגון רפידות שומן חלב, רפידות שומן כתף, ו ^-8 עור בחזרה.

חלל הצפק ואת בורסת השחלות בדרך כלל משמשים כמקומות להשתלת orthotopic של תאי אפיתל של דרכי הנשית רביית ^9-12. שתי שיטות אלה יש מספר מגבלות. הזרקת Intraperitoneal של תאים מובילות ההשתלות שלהם בתחומים שונים של חלל הצפק, ובכך complicating מעקב גדילה הסלולר. יתר על כן, שינויים במיקרו-סביבה, כגון היקף כלי הדם, עצבוב וייצוג תא החיסון, עשוי להיות משמעותי למדי באזורים שונים של חלל הצפק. בורסת ההשחלות יש נפח מוגבל מאוד, המאפשר הזרקה לא יותר מ -10 μl של נוזל. זה משמעותי מגביל את כמות תאים שיכולים להינתן. יתר על כן, זריקות לתוך בורסת ההשחלות יכולות להיות מאתגרות למדי מבחינה טכנית ואת ההליך דורש כמות משמעותית של זמן.

כדי לטפל במגבלות אלה, נקטנו מיתרונות החומרים כרית שומן השחלות. כרית שומן עכבר השחלות יש גודל גדול, צמוד השחלה ואת צינור הרחם, והוא נגיש בקלות על ידי ניתוח. זה כבר דווח כי trophoblast סוסים ניתן להשתיל לתוך כרית שומן עכבר שחלות ^13. עם זאת הפרטים של שיטה זו לא תוארו. זה גם לא דווח אם לי זהthod ניתן ליישם תאים בוגרים ורקמות. כאן, אנו מתארים גישה אמינה עבור ההשתלה של עכבר תאים אנושיים של מערכת הרבייה הנשית ולהראות כי שיטה זו תופסת גם לגבי השתלת איבר לטווח ארוכה.

Protocol

כל העבודה in vivo תיאר היא אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת קורנל ועדת שימוש.

1. הכנות לדוגמא עבור מבחני Pad השחלות שומן

1. בידוד והתרבות של ראשי האפיתל תובל (TE) תאים
   1. להרדים תורם 6 ל- משופר β-יקטין בתול בן 8 שבועות חלבון פלואורסצנטי הירוק (EFGP) או β-תקטין Discosoma חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) עכברים על ידי ה- CO ₂ ממשל ואחריו נקע בצוואר רחם. ודא המתת חסד מוצלח ידי קמצוץ הבוהן.
   2. מניח עכבר פרט על וילון סופג, למעלה בצד גחון, ולאחר מכן לנגב את הבטן עם אתנול 70%. פתח את העור על ידי ביצוע חתך לרוחב על קו אמצע הגוף עם אצבעות למשוך את העור מעל ומתחת החתך לכיוון הראש והזנב של העכבר.
   3. החזק את הצפק באמצעות מלקחיים בוטים ולעשות חתך במספריים בסדר כדי לפתוח את חלל הגוף. דחף בעדינות את הסליל של intestinדואר הצידה לאתר את איברי הרבייה.
   4. עם מלקחיים בסדר להרים קרן רחם אחד ופצע 0.5 סנטימטרים מעל לנקודה שבה קרן הרחם להפריד. תוך כדי הלחיצה על קרן הרחם, לנתח משם רקמת חיבור מצורפת קרן הרחם, צינור רחם, כרית שומן שחלות שחלות. מניחים במערכת הרבייה גזור בצלחת עם 6 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS). להמשיך עם מערכת הרבייה השנייה.
   5. מעביר את הצלחת לארון בטיחות ביולוגי ולשטוף את הרקמות 3 פעמים ב 6 מיליליטר סטרילי PBS. המשך העבודה תחת מיקרוסקופ לנתיחה ממוקם ארון הבטיחות הביולוגי. תפוס את קרן הרחם עם פינצטה בסדר וניתקת את קרן הרחם מצינור הרחם על ידי ניתוק בצומת ברחם-תובל. לגזור בורסת השחלות סביב השחלה באמצעות מחט 25 G.
      הערה: לאחר בורסת השחלות הוסרה, לנתיחה לאחר השלימה פעולת צינור רחם האדם נותר בפתרון PBS.
   6. העברת Singlדואר צינור הרחם בטיפת 50 μl של PBS על צלחת 3.5 ס"מ ופשטי- לתוך 0.1 חתיכות מ"מ באמצעות 28 מחטים מד. העברת 200 העיכול μl חיץ 1 (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) F12 () השלימו בינוני של חם עם 300 יחידות מ"ל ^-1 Collagenase ו -100 יחידות מ"ל ^-1 Hyaluronidase) דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס CO 5% ₂ באינקובטור.
   7. לאחר דגירה, להוסיף 1 מ"ל 0.25% חומצה טריפסין-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו להשעות את הפתרון בעזרת קצה פיפטה 1 מ"ל (aka טיפ כחול) 20 פעמים במשך 3 דקות. הוסף 5 מ"ל + 4 ° C DMEM / F12 בינוני (של Ham) המכילה סרום שור 2% עוברית.
   8. דגימות של רקמות על ידי צנטריפוגה (600 RCF, 5 דקות, בטמפרטורת החדר (RT)), ולהוסיף עיכול 1 מ"ל חיץ 2 (F12 DMEM () השלימו בינוני של חם עם 7 מ"ג מ"ל ^-1 Dispase השנייה ו -10 מיקרוגרם מ"ל ^-1 Deoxyribonuclease אני ( אני DNase)). להשעות גלולה רקמת 20 פעמים עם עזרה של ti פיפטה 1 מ"לp.
   9. הוסף 5 מ"ל סרום חינם מדיום הגידול האפיתל תובל העכבר מלאה (M-TE-GM, טבלה 1).
   10. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (600 RCF, 5 דקות, RT). הוסף 1 מ"ל M-TE-GM, להשעות ולספור את התאים על ידי hemocytometer. זרע 1 x 10 ⁵ תאים ב 1 מיליליטר לכל היטב צלחת מצורפת נמוכה 24 גם דגירת M-TE-GM ב 37 מעלות צלזיוס CO ₂ באינקובטור 5% במשך 4 ימים.
   11. שנה את בינונית כל יום.
   12. כן השעיות תא בודדות של תאי TE השעיה עיקרית תרבותיים מעכברי β-יקטין EGFP או β-יקטין DsRed.
       1. אסוף תרבויות השעית TE מ 24 גם צלחות מצורפות נמוכות. צנטריפוגה (600 RCF, 5 דקות, RT), ו להשעות כדורי תא עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה ₂ 5% CO.
       2. תפסיק פעילות טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר DMEM / F12 בינוני (של Ham) המכיל סרום שור 5% עובריים. אסוף כדורי תא על ידי צנטריפוגה (600 RCF, 5 דקות, RT).
   13. כדורי תא שטפו פעמיים עם 4 מ"ל של PBS קר (4 ° C), להוסיף 1 מ"ל PBS לכל תא גלולה, ולהשהות. ספירת תאים על ידי hemocytometer ולהעביר ל -1.7 מ"ל צינורות צנטריפוגה. עבודה על הקרח, מוסיפים 1 x 10 ⁵ תאים עד 10 PBS μl, ולאחר מכן להוסיף מטריצה ​​קרום במרתף 10 μl. להשעות ולהעביר על הקרח לחדר חיה.
       הערה: בצע את כל העבודה תרבות לנתיחה ורקמות בתוך ארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים.
2. הכנת קו תאים אנושיים הונצח
   1. בנפרד לגדול lentivirus-EGFP ו -mCherry שכותרתו הנציח האנושי תא האפיתל השחלות פני lineHIO118 עד 80 - 90% confluency על 10 מנות ס"מ על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO _2.
   2. לשטוף כלים פעמיים עם 10 מ"ל PBS, להוסיף 1 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל צלחת דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה ₂ 5% CO. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר DMEM / F12 בינוני (של Ham) המכיל סרום שור 5% עובריים. לאסוףכדורי תא על ידי צנטריפוגה (600 RCF, 5 דקות, RT).
   3. כדורי תא שטפו פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר (4 ° C), להוסיף 1 מ"ל PBS לכל תא גלולה, ולהשהות. ספירת תאים על ידי hemocytometer ולהעביר ל -1.7 מ"ל צינורות צנטריפוגה.
   4. עבודה על הקרח, להוסיף 1.0 x 10 ⁶ lenti-mCherry שכותרתו תאים + 1.0 x 10 ⁶ lenti-EGFP שכותרתו תאים עד 10 μl PBS. הוסף 10 μl מטריצת קרום במרתף. להשעות ולהעביר על הקרח לחדר חיה.
3. הכנת תחתית הרחם
   1. לנתח צינורות רחם פרט 6 ל- 8 שבועות עכברים ישנים בתולת β-יקטין DsRed ב- PBS כמתואר בשלבי 1.1.1-1.1.5. העבר צינורות רחם יחידים לתוך ירידת 200 μl של PBS תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעדינות uncoil צינורות רחם בעזרת פינצטה 28 מחטי מד ידי הסרת mesosalpinx, חלק מן הרצועה הרחבה התומכת המגזרים של צינור הרחם. מניחים צינורות הרחם uncoiled אחת בטיפת 200 μl-קרים כקרח PBS עד כרית שומן השחלות של הנמען חשוף מוכן לקבל את ההשתלה.

2. השתלת Pad השחלות שומן

הערה: לחטא מכשירים בין כל ניתוח חיה. כן ולסדר את כל הציוד מראש. השתלות הגבו אל כרית השומן התקינה שחלות הן מועדפות כמו זה ימנע את הטחול. עם זאת, מקבלים ייתכן שיהיו השתלות בשתי כריות שומן השחלות.

1. משתמשים בעכברים syngeneic או כשל חיסוני חמור (SCID / NCR) עכברים כמקבל תאים ראשוניים. עבור תאים אנושיים, כגון HIO118 תאים, נוד שימוש / SCID / גמא (NSG) עכברים או עכברים SCID.
2. להרדים עכבר הנמען עם הזרקה תוך הצפק יחיד של 2,2,2-Tribromoethanol במינון של משקל הגוף גרם 0.15 מ"ל / 10. מניח את החיה על כרית חימום, בשכונת החיה ולאשר הרדמה תקינה על ידי אובדן של רפלקס הדוושה (קמצוץ בוהן). החל משח וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש בעודחיה היא בהרדמה. להזריק את תת עורי חיה עם Ketoprofen משכך כאבים במינון של משקל הגוף 4 מ"ג / g לטיפול נגד כאבים לאחר ניתוח.
   הערה: כחלופה, להשתמש isoflurane עבור הרדמה. מניחים את החיה בחדר אינדוקציה ולהתאים את flowmeter חמצן 0.8-1.5 L / min ואת מאדה isoflurane ל 2-3%. הסר את החיה הרדים מהאולם, ולתת לו לנשום isoflurane מן מסכה ולהגדיר את flowmeter חמצן 0.4-0.8 L / min ואת מאדה isoflurane ל -1.5%, ולאחר מכן להתחיל את הניתוח.
3. לגלח את אזור הניתוח עם # 40 קוצץ; להסיר שיער מאזור 2 פעמים את אזור הניתוח, להכין את העור מגולח עם שלושה עלובי חיטוי של יוד povidone, ואחריו אתנול 70%, ולכסות עם וילון סטרילית.
4. הזז את החיה תחת מיקרוסקופ לנתיחה ממוקם בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לחשוף את מערכת הרבייה על ידי חתך את עמדת dorsomedial ישירות מעל כרית שומן השחלות.
   הערה: Critצעד iCal: חתך בעור מדויק מקל ריפוי פצע, שימוש אזמל מומלץ בשלב 2.4.
5. בעזרת מלקחיים בסדר בוטים למשוך את כרית שומן השחלות בזהירות דרך החתך כלפי קו האמצע, מזעור ניזק עצב וכלי דם גדולים.
   שלב קריטי: אם דימום מתרחש, להפסיק את הניתוח ולשקול השתלה לחיית מארחת שונה.
6. בשליטת המיקרוסקופ לנתיחה עם עזרה של מחט משופע 28 מד לעשות חתך עמוק 2-4 מ"מ לתוך כרית שומן שחלות, 3-4 מ"מ מעל השחלה.
   צעד קריטי: ודא כי החתך עובר רק דרך מחצית כרית השומן; ניקוב לאורך כל הדרך אל הצד התחתון גורם דליפה. להיות מהירים ללא דיחוי לאחר שלב זה.
7. עבור השתלות תאיות, למלא מזרק (מחט 30 מד) עם 10-20 μl של-תערובת מטריצת קרום תא-המרתף להזריק לתוך חתך כרית השומן. להשתלת צינור רחם, להרים את שנינות צינור הרחםמלקחיים ומניחים h קנס 10 - 20 μl מטריצה ​​קרום במרתף כל הזמן על הקרח. באמצעות μl 0.1-10 / 20 XL סיימו הפילטר (מקוצר על ידי 3 מ"מ) להרים את השעית מטריצת קרום רקמות מרתף ולשחרר לתוך חתך כרית שומן.
8. מתן 5 דקות עבור מטריצת הקרום במרתף כדי לחזק ומניחה במערכת הרבייה בחזרה לתוך הצפק. סגור את השרירים עם 2 stiches של תפר כירורגי והעור עם שני קליפים פצע קטן או תפר כירורגי.
9. חזור על שלבים 2.4-2.8 להשתיל א-תערובת מטריצה ​​קרום PBS-המרתף לתוך כרית שומן קונטרה-לרוחב של החיה אשר תשמש שליטה.
   צעד קריטי: לאחר הניתוח ומקום חי על כרית חימום, בגלל איבוד חום הוא מהיר בעכברים מורדמים.
10. בואו החיה להתאושש על כרית חימום בכלוב יליד ולבחון את החיה עד ער לחלוטין מן ההרדמה. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור Sternal recumbence. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
11. מניחים חופן כדורי מזון טרום רטוב בתוך הכלוב בנוסף לייבוש מזון על הכלוב לאחר הניתוח. החל משככי כאבים לאחר ניתוח אם הדבר נדרש לצורך בימים הקרובים ולבחון את הפצע יומי. החל אנטיביוטיקה לפי פרוטוקול החיה אשר אם זיהום פצע מתרחש. הסר קליפים הפצע 10 ימים לאחר הניתוח כאשר הפצע נסגר לחלוטין.

היסטולוגיה 3. רכישת תמונה

1. איסוף שימור שתל
   1. הכן פתרון paraformaldehyde 4% על ידי ערבוב 26 מ"ל DDH ₂ O עם 4 מ"ל 10x PBS ו -10 מ"ל פתרון paraformaldehyde 16%.
   2. לנתח כמקשה אחת, כרית שומן השחלות engrafted, השחלה, צינור הרחם, 0.5 ס"מ הרחם כמתואר בשלבים 1.1.1-1.1.4. מיד למקום ב 2 מ"ל 4% paraformaldehyde ולתקן עבור שעה 2, ב RT. מאותו חיה, לנתח את הלא engraftedמערכת כרית שומן נגדית שחלות מושתלות עם תערובת מטריצת קרום PBS-מרתף כביקורת (ראה שלב 2.9). תקן ולעבד באותו אופן.
   3. לאחר לשטוף קיבעון רקמות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות ו דגירה לילה PBS ב 4 ° C.
   4. עבור הדמית הר השלמה של כרית שומן השחלות המשך לשלב 3.2.1.
      הערה: לאחר רקמות רכישת תמונה אפשר להקפיא (3.3.1) או מעובד להטבעת פרפין (3.3.2). דגירת לילה סוכרוז 30% PBS ב 4 ° C משפרת את האיכות של רקמות קפוא.
2. רכישת תמונה
   1. מקום כולו הר מערכות כרית שומן שחלות במנות PBS מלאים ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידות מצורף עלית קרינה ואת מצלמת צבע בחדות גבוהה, עם 4, מטרות 10x, ו- סטראו מאובזר עם קובץ מצורף קרינה, מצלמת צבע תכנית Apo 1xWD70, מטרות 1.5xWD45 תוכנית ED.
3. היסטולוגיה
   1. הבארכישת תמונה כל ההר (3.2.1) במקום ירידת 200-500 μl של הטבעה בינונית עבור דגימות רקמה קפוא על פיסת 2 x 1 סנטימטר של סרט במעבדה באמצעות מלקחיים, להעביר את הרקמה עד הטיפה. תרימי את הסרט בקצה אחד ולהעביר את הירידה בינוני רקמות בקבוקון קריוגני 1.8 מ"ל. סגור את הבקבוקון לצלול לתוך חנקן נוזלי. אחסן רקמות קפוא ב -80 מעלות צלזיוס.
   2. לחלופין, להמשיך עם הטבעת פרפין סטנדרטית. השתמש 20-40 כרכים של נפח הרקמה לכל שלב.
      1. לטבול רקמות פעם באתנול 65% למשך 30 דקות, רועד קל ב RT.
      2. לטבול רקמות פעם באתנול 70% למשך 30 דקות, רועד קל ב RT. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן במשך חודשים ב RT.
      3. לטבול רקמות פעם באתנול 90% למשך 30 דקות, רועד קל ב RT.
      4. לטבול רקמות פעם באתנול 95% למשך 30 דקות, רועד קל ב RT.
      5. לטבול רקמות פעמי אתנול אבסולוטי (200 הוכחה) למשך 30 דקות, רועד קל ב RT.
      6. לטבול רקמות פעמים כלורופורם למשך 30 דקות, רועד קל ב RT.
      7. לטבול רקמות פעם פרפין למשך 30 דקות, רועד קל ב -58 מעלות צלזיוס.
      8. לטבול רקמות פעם פרפין במשך 12 שעות, רועד בעדינות ב -58 מעלות צלזיוס.
      9. לטבול רקמות פעם פרפין עבור 3 שעות, ב -58 מעלות צלזיוס.
      10. מניחים רקמות בתוך תבניות מתכת היסטולוגיה ולמלא תבניות עם 58 ° C פרפין. הוספת קלטת היסטולוגיה פלסטיק על גבי פרפין להתקרר פרפין עד 4+ מעלות צלזיוס. חלץ לחסום ולאחסן פרפין רקמות ב RT.
          הערה: טמפרטורת פרפין לא תעלה על 58 מעלות צלזיוס במשך שימור מיטבים של רקמות מתאימות מכתים immunohistochemical.
   3. לחלופין, היכון והטבעת פרפין עם דגימת עיבוד ג'ל.
      1. לשאוב PBS ולהעביר כל הר רקמות אתנול 70%. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. באמבט מים, דגימה מחממת עיבוד ג'ל עד 60 ° C.
      2. Pipettדואר 200 μl של ג'ל עיבוד הדגימה על מעבדה הסרט מצופה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים בסדר לנתיחה להעביר את מערכת רקמת כל הר עד טיפת ג'ל עיבוד הדגימה.
      3. אפשר את התקע ג'ל עיבוד הדגימה כדי לחזק בטמפרטורת החדר, או לחזק את התקע במשך 10 דקות ב 4 ° C.
      4. הנח את רקמת מוטבע הדגימה עיבוד ג'ל קלטות רקמות היסטולוגיה דחוקה בין כריות קצף ביופסיה. להטביע פרפין כפי בצעדים 3.3.2-3.3.2.10.
         הערה: הטבעת ג'ל עיבוד דגימה מונעת אובדן ומאפשרת שימור דגימות רקמה שברירי קטנות.
         הערה: הרקמות נשמרו על ידי הקפאה או הטבעת פרפין מתאימות מכתים immunohistochemical ^14,15.

תוצאות

ניתן תאים ורקמות ניסיוני המושתלים במדויק לתוך כרית שומן השחלות תחת מיקרוסקופ לנתיחה (איור 1). הדוגמאות כוללות תאים אפיתל תובל העכבר העיקרי נגזר עכברים בכל מקום בגוף להביע EGFP (איור 2 א) או DsRed (תרשים 2B) ותאי אפיתל משטח השחלות הנציח אדם HIO118 ^16,17 תאים שכותרתו עם lentiviruses mCherry ו EGFP (איור 2C - F). הגישה היא גם ישימה להשתלה ארוכת טווח של איברים, כגון צינור רחם עכבר (איור 3). לדברי מכתים immunohistochemical, הוא הריסים (FOXJ1 חיובי ¹⁴⁾ פרשה (PAX8 חיובי ¹⁵⁾ תאים נשמרים האפיתל תובל של רקמות מושתלות (איור 3D ו- E).

איור 1:. שומן שחלות Pad השתלה (A) חשוף בתחום השתלה (חץ). (ב) חתך נעשה על ידי מחט G 28 (חץ). (C) מטריקס קרום UT / מרתף engraftment תערובת ידי קצה פיפטה (חץ). (ד) UT engrafted (חץ, אדום בוהק, UT של עכברים β-אקטין DsRed). FP, כרית שומן; OV, שחלה; UT, צינור הרחם. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. זיהוי של תאי אפיתל תובל המושתלים עכבר ראשיים אדם הונצח תאי האפיתל Surface שחלות (A, B) מתוך גידולים של תאי אפיתל תובל עכבר עיקרי (חיצים) של עכברים β-תקטין EGFP (A, ירוקים) β-יקטין DsRed (B, אדום) 8 ימים לאחר ההשתלה לעכבר syngeneic. (C, D) Engraftments של תאי HIO118 המעורבים (חיצים) שכותרתו עם או lenti-EGFP (ירוק) או lenti-mCherry (אדום) 10 ימים לאחר ההשתלה לעכברי NSG. (D) אזור מוגדל מ (C, חץ). (E, F) שתל שפותח 43 ימים לאחר ההשתלה של תאים באותו כמו C, D כדי העכבר SCID (חיצים). לספירה, F, קרינה; E, שדה בהיר, FP, כרית שומן; OV, שחלה; UT, צינור הרחם. (A, B, DF) בר סולם = 500 מיקרומטר; (C) סרגל קנה מידה = 1,600 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המודעה / 54,444 / 54444fig3.jpg "/>
איור 3: אפיון השתלת רחם Tube. (א) צינור רחם שלם (חץ) של β-תקטין DsRed עכבר 6 ימים לאחר ההשתלה לתוך כרית שומן שחלות (חץ, אדום בהיר). (ב) בסעיף קפוא פלורסנט של כרית השומן עם השתלה שמוצגת (א). אדום, DsRed; כחול, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstaining גרעיני. (C) הרחם צינור השתל (חץ) 40 ימים לאחר ההשתלה לעכבר הנמען NSG (חץ). סעיף פרפין. הערת שימור נכון של כל רכיבי צינור רחם העקרוניים, וחוסר סיסטיק הקשורים השתלה ודלקת. Hematoxylin והכתים eosin. (D, E) איתור של הסמנים האפיתל תובל מותאם-box גן 8 (PAX8) ותיבת forkhead J1 (FOXJ1; צבע גרעיני חום, ראשי חץ) בתאים של השתל (חיצים) שמוצגים ( C). מערכת אימונו. Counterstaining עם ירוק מתיל. FP, כרית שומן; OV, שחלה; UT, צינור הרחם. (א) בר סולם = 1,000 מיקרומטר; (ב) בר סולם = 200 מיקרומטר; (CE) סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רְכִיב	בינוני 1x DMEM F12 (של Ham)
L-Glutamine	2 מ"מ
נתרן pruvate	1 מ"מ
אפידרמיס גורם גדילה	10 ng מ"ל -1
גורם-2 צמיחה פיברובלסטים בסיסית	10 ng מ"ל -1
הידרוקורטיזון	500 ng מ"ל -1
אִינסוּלִין	5 מיקרוגרם מ"ל -1
transferrin	5 מיקרוגרם מ"ל -1
סלניט נתרן	5 ng מ"ל -1
אלבומין שור	0.10%
פניצילין / סטרפטומיצין	100 יחידות מ"ל -1 / 100 מיקרוגרם מ"ל -1
הנשר בינוני Essential Minimum (ממ) חומצות אמינו לא חיוניות	0.1 מ"מ
בטא mercaptoethanol	10 -4 M

טבלה 1:. עכבר תובל Epithelim צמיחה בינוני (M-TE-GM) רכיבים המפורטים בעמודה השמאלית המומסים 1x DMEM F12 (של Ham) בינוני בריכוזים המצוין, בעמודה הימנית. הרכב הבינוני הסופי הוא בסרום חינם.

Discussion

הקמנו assay השתלת כרית שומן השחלות המאפשרת משלוח וזיהוי מדויק של תאים ורקמות האפיתל. הליך השתלת assay כרית שומן השחלות הוא פחות מאתגר מבחינה טכנית מאשר זריקת intrabursal ^10-12 ומאפשר אחידים יותר ומיקום מדויק של תאים מושתלים לעומת הזרקת intraperitoneal ^9. כמו כן הוא מתאים היטב להשתלה לטווח ארוך של איבר שלם, כגון צינור הרחם.

חשוב לציין, כרית שומן השחלות מספק microenvironment מוכר epithelia של מערכת הרבייה הנשית. זה צריך להיות מתאים במיוחד עבור מחקרים של המאפיינים המולקולריים התאיים של שחלות אדם ועכבר ותאים אפיתל תובל במהלך רגנרציה, שינוי ממאיר. בניגוד לאיברים אחרים, כמה מחקרים התמקדו זיהוי ואפיון של תאי גזע האפיטל של r הנקבהeproductive בדרך ^18,19. מחקרים כאלה הם בעלי חשיבות מיוחדת בגלל סרטן רבים הם האמינו מקורן בתאי גזע בוגרים ^20. עם זאת מקור תאי של סרטן שחלות אפיתל להישאר מאוד במחלוקת ^18. סרטן השחלות אפיתל להסביר את רוב מקרי סרטן השחלות והיא נמצאת במקום ה -5 בין כל מקרי המוות הקשורים לסרטן של נשים בארצות הברית ^21. לכן פיתוח של assay orthotopic עם מספר יתרונות על פני שיטות ההשתלה קיימת ^9-12 אמור להקל מאוד מחקרים בתחום זה.

בהתחשב במיקום השטחי של כרית שומן שחלות, מערכות הדמית חיה קטנות שניתן להשתמש בם כדי לעקוב אחר engraftments שכותרתו עם פלורסנט החזק או כתבי bioluminescent. זה גם צריך להיות אפשרי להקים מבחני הדמיה לחיות פולשנית ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה שאינו ליניארי ^22. כרית שומן השחלות יכול גם להיות כל הזמן בתרבויות איברים, ובכך לאפשרing תרבות תלת מימדי של אפיתלים נורמלי נאופלסטיות בתנאים מקרוב משחזרת הארגון של תאים הבין-תאי. מחקרים עתידיים צריכים להתייחס האפשרויות המבטיחות הללו.

יש שלבים קריטיים כמה שיש לקחת בחשבון. מתן כרית חימום ושמירת מכרסמים חמים במהלך הניתוח משפרת את שיעור ההישרדות מאוד. עקרות של מכשירי טיפול כרית השומן מבטיחות כי מערכות engrafted נשמרות סטרילי. מניסיוננו, תוצאות דימום משמעותי בגדילה של השתלות. חשוב לציין, חתך כרית השומן צריך להיעשות דווקא משום קורע כרית השומן או תיקבו אותו דרך גורמי דימום. יש להשתמש מקריש כדי לעצור את הדימום לפי הצורך. אם engraftments אינם מפתחים, ריכוז גבוה יותר של התאים מוזרקים צריך להיחשב. בצמחים המוצלחים הראשונים ניתן להבחין מוקדם ככל שבוע לאחר ההשתלה ורוב engraftments צריך להיות אחד גלויחודש לאחר ההליך. להשתלה, מחטים עם קוטר גדול יותר (23-25 ​​G) יכולות לשמש כדי למנוע מריחה של תאים גדולים (מעל 10 מיקרומטר קוטר). עם זאת, מחטים כאלה עשויות להיות יותר טראומטיות כרית השומן והשימוש בם צריך להיבדק מראש. בניסויים שלנו השתמשנו עכברים תורמים ומקבל ישנים 6 עד 8 בשבוע. עבור שתי המטרות עכברים צעירים או מבוגרים יכולים לשמש. עם זאת, מספר תאים המוזרקים ייתכן שיהיה צורך מותאם. הגודל הקטן יותר של רפידות שומן השחלות תורמות צעיר גם צריך להיחשב.

כמו עם כל שיטות, ישנן מספר מגבלות של assay השתלת כרית שומן עכבר שחלות. למרות עכברים חיסוניים מוסמכת syngeneic יכולים לשמש תאים / רקמות עיקריות בעכברים, הטכניקה שלנו דורשת NSG או עכברי SCID להשתלה של חומר אנושי. סביר להניח שאפשר להאניש את כרית השומן כדי לתמוך בצמיחה של תאי אפיתל אנושיים. עם זאת, אנחנו עדיין לא נבחנו גישה זו עדיין. שימוש צעיר Feזכרים עשויים להוביל לעלויות גידול נמוכות; יש עם זאת, עכברות שלא הרו בוגרות (גיל 8 עד 10 שבועות) כרית שומן גדולה יותר, ובכך לאפשר השתלה של דגימות גדולות. לבסוף, אנשי מעבדה צריכים להיות מיושמים על בכירורגיה חי כדי להבטיח את ביצוע בזמן והמוצלח של ההליך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 gauge needle	BD Becton Dickinson	305122
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)	Kendall	30339	Part Number: 8881500014
basic fibroblast growth factor-2	Sigma-Aldrich	F9786
basement membrane matrix (Geltrex)	Invitrogen	A1413202
β-actin-DsRed mice	The Jackson Laboratory	6051	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actin-EGFP mice	The Jackson Laboratory	3291	C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
bovine albumin	Sigma-Aldrich	A3311
chloroform	VWR	EM-CX1058-1
collagenase/hyaluronidase	Stem Cell Technologies	7912
cryogenic vials	Thermo Scientific Nunc	377267
dispase II	Worthington	NPRO2
DMEM F12 (HAM's)	Corning	10-092-CV
DNaseI (Deoxyribonuclease I)	Stem Cell Technologies	7900
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)	Sakura Finetek	4583
epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E4127
ethanol 200 proof	Koptec	V1001	to prepare 70%
fetal bovine serum	Sigma	F4135
filter tip 0.1-10/20 µl XL	USA Scientific	1120-3810
FOXJ1 antibody	eBioscience	E10109-1632	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
hydrocortisone	Sigma	H0135
Ketoprofen	Zoetis	4396H
laboratory film (Parafilm M)	American National Can	PM-999
L-Glutamine	Corning	25-005-Cl
insulin-transferin-sodium selenite	Sigma-Aldrich	I884
isoflurane, 250 ml	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx
low attachment plate 24-well	Costar	3473
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
metal histology molds	Electron Microscopy Sciences	62527-22
microscope, inverted	Nikon	Eclipse TS 100
microscope, stereo	Nikon	SMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG) mice	The Jackson Laboratory	05557	NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
paraffin (Paraplast, X-TRA)	Fisher Thermo Scientific	23-021-401
PAX8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	used at concentration 1:1,000 (no unmasking)
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-030-CV
penicillin streptomycin	Corning	30-002-Cl
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)	NCI-Frederick Animal Production Program	01S11
sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
specimen processing gel (HISTOGEL)	Richard-Allan Scientific	HG-4000-012
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Trypsin-EDTA, 25%	Corning	25-053-Cl