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私たちは、女性の生殖器官の正常な形質転換上皮の研究に適した卵巣流行パッド移植アッセイを説明します。マウスの脂肪パッドは、大規模な組織片の移植を可能にする手術とイメージングのために簡単にアクセスでき、およびミュラー管由来の組織のための最も有利なネイティブ環境を提供します。
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
マウスでの特定の身体部位への細胞および組織の導入を伴う移植アッセイは、組織再生および発癌の研究のために不可欠なアプローチを表します。細胞の同所性移植は、すなわち、天然の環境中へのそれらの配置は、成体幹細胞の特徴付けのために特に重要です。乳腺幹細胞の存在は、第1のマウスの腺無乳房脂肪パッドに上皮乳腺断片の移植によって示唆されました。ヒト化マウスの脂肪パッド2に移植アッセイは、ヒト初代乳房上皮細胞の再生能と正常な発達を再現するために使用しました。さらに、シリアルおよびクリア乳房脂肪パッドに、表現型の異なる細胞型の希釈移植を制限するには、自己再生能力および乳腺幹細胞3-5の多分化を試験することが重要でした。 combinatで移植アッセイ遺伝系統のトレースを持つイオンは乳腺発がん5に起源の細胞の証拠を提供しました。腎カプセル移植は、一般推定前立腺幹細胞6の特性を試験するために使用されます。正常及び腫瘍マウスおよびヒト膵臓オルガノイドの同所移植は、癌の進行7に変更された遺伝子および経路を明らかにしました。ネイティブ環境の重要性も後に、このような乳房脂肪パッド、肩脂肪パッド、および背中の皮膚8と異なる場所へ汗腺のengraftments多様な再生のデモンストレーションによってサポートされています。
腹腔および卵巣嚢は通常、女性の生殖管9-12の上皮細胞の同所移植のための場所として使用されています。これらの方法の両方は、多くの制限を有します。細胞の腹腔内注射は、腹腔の異なる領域にその注入をもたらし、それによってCOM細胞増殖を監視褶壁形成。また、微小環境の変化は、例えば、血管新生、神経支配および免疫細胞の表現の範囲として、腹腔内の異なる領域において非常に重要であり得ます。卵巣嚢は、液体のせいぜい10マイクロリットルの注入を可能にする、非常に限られた容積を有します。これは大幅に投与することができる細胞の量を制限します。また、卵嚢への注射は非常に技術的に挑戦することができ、手順はかなりの時間を必要とします。
これらの制限に対処するために、我々は、卵巣の脂肪パッドの特性を利用してきました。マウスの卵巣の脂肪パッドは、大きなサイズを有し、卵巣と卵管に隣接しており、手術で簡単にアクセスできます。ウマ栄養膜は、マウスの卵巣脂肪パッド13に移植できることが報告されています。しかし、この方法の詳細は記載されませんでした。また、この私の場合は報告されませんでしたTHODは成体細胞および組織に適用することができます。ここでは、女性の生殖器官のマウスおよびヒト細胞の移植のための信頼できる方法を説明し、この方法は、長期の臓器移植にも適用可能であることを示しています。
記載されている全てのin vivoでの作業は、コーネル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
卵巣の脂肪パッドのアッセイのための1.サンプルの準備
2.卵巣の脂肪パッド移植
注:各動物の手術の間に器具を消毒します。事前にすべての機器を準備し、手配。これは脾臓を回避するように、右側の卵巣の脂肪パッドに背移植が優遇されています。ただし、受信者は両方の卵巣の脂肪パッドで移植を有することができます。
3.組織学および画像取得
実験的細胞および組織を正確に解剖顕微鏡( 図1)の下で卵巣脂肪パッドに移植することができます。例としては、遍在EGFP( 図2A)またはDsRedの( 図2B)とHIO118 16,17細胞はmCherryをし、EGFPレンチウイルスで標識したヒト不死化卵巣表面上皮細胞( - F 図2C)を発現するマウス由来の初代マウス卵管上皮細胞が含まれます。アプローチはまた、マウスの卵管などの臓器の長期移植、( 図3)に適用可能です。免疫組織化学染色によると、(FOXJ1正14)繊毛および分泌の両方(PAX8正15)細胞が移植された組織( 図3DおよびE)の卵管上皮に保存されています。
図1:卵巣の脂肪パッド移植移植の(A)露出面積(矢印)。 (B)切開は28 G針(矢印)によって行われます。ピペットチップ(矢印)により、(C)UT /基底膜マトリックス混合物の生着。 (D)UT生着(矢印、明るい赤、βアクチンのDsRedマウスのUT)。 FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。スケールバー= 2ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2: 移植マウスプライマリ卵管上皮細胞の検出と人間が卵巣表面上皮細胞を不死化 (A、B)アウト。 8日同系マウスに移植した後、一次βアクチン-EGFPマウス (緑A)のマウス卵管上皮細胞(矢印)およびβアクチンのDsRed(B、赤)の成長。 (C、D)は、10日目移植後NSGマウスにレンチEGFP(緑色)またはレンチmCherryを(赤)のいずれかで標識された混合HIO118細胞(矢印)のEngraftments。 (D)(C、矢印)から拡大エリア。 (E、F)グラフトは、SCIDマウス(矢印)にD、Cのように43日、同じ細胞の移植後に発症しました。 AD、F、蛍光。 E、明視野、FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。 (A、B、DF)スケールバー=500μmの。 (C)スケールバー= 1600ミクロン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3: 卵管移植のキャラクタリゼーション。 (A)βアクチン-DsRedをマウス6日卵巣の脂肪パッドに移植した後の完全な卵管(矢印)(矢印を、明るい赤)。 (B)(A)に示される移植で脂肪パッドの蛍光凍結切片。レッド、のDsRed。ブルー、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、核対比染色。 (C)40日NSGレシピエントマウス(矢印)への移植後の子宮管移植片(矢印)。パラフィン切片。正しいすべての原則卵管コンポーネントの保存、および移植関連線維症および炎症性の欠如に注意してください。ヘマトキシリンおよびエオシン染色。 (D、E)検出卵管上皮マーカーペアボックス遺伝子8(PAX8)とフォークヘッドボックスJ1の(FOXJ1;茶色の核の色、矢頭)に示すグラフト(矢印)の細胞内で( C)。イムノシステム。メチルグリーンで対比染色。 FP、脂肪パッド。 OV、卵巣; UT、卵管。 (A)スケールバー=1000μmで。 (B)スケールバー=200μmの。 (CE)のスケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
成分 | 1×DMEM F12(ハム)培地 |
L-グルタミン | 2 mMの |
ナトリウムpruvate | 1 mMの |
上皮成長因子 | 10 ngのmlの-1 |
塩基性線維芽細胞成長因子-2 | 10 ngのmlの-1 |
ヒドロコルチゾン | 500 ngのmlの-1 |
インスリン | 5μgのmlの-1 |
トラnsferrin | 5μgのmlの-1 |
亜セレン酸ナトリウム | 5 ngのmlの-1 |
ウシアルブミン | 0.10% |
ペニシリン/ストレプトマイシン | 100単位ミリリットル-1 /100μgのミリリットル-1 |
最小必須培地イーグル(MEM)非必須アミノ酸 | 0.1 mMの |
β-メルカプトエタノール | 10 -4 M |
表1:マウスの卵管Epithelim増殖培地(M-TE-GM)コンポーネント左の列に表示されているが、1×DMEM F12を示した濃度の(ハム)培地、右欄に溶解されています。最終的な培地組成は、無血清です。
我々は、上皮細胞や組織の正確な配達および検出を可能にする卵巣の脂肪パッド移植アッセイを確立しています。卵巣の脂肪パッドアッセイ移植手順はintrabursal注入10-12未満技術的に困難であり、より均一で腹腔内注射9と比較して、移植された細胞の正確な位置を可能にします。それはまた、卵管などの臓器全体の長期移植に適しています。
重要なことは、卵巣の脂肪パッドは、女性の生殖器系の上皮のためのおなじみの微小環境を提供します。これは、再生および悪性形質転換の間に、ヒトおよびマウスの卵巣と卵管上皮細胞の分子および細胞特性の研究のために特に適していなければなりません。他の器官とは対照的に、いくつかの研究は、女性Rの上皮幹細胞の同定および特徴付けに焦点を当てていますeproductive管18,19。多くの癌は、成体幹細胞20に由来すると考えられるので、このような試験は特に重要です。しかし、上皮性卵巣癌の細胞の起源は、18非常に議論の余地が残ります。上皮性卵巣癌は、卵巣癌の大部分を占めると米国21の女性の全ての癌関連死の中で5位にあります。したがって、既存の移植技術に比べていくつかの利点を持つ同所アッセイの開発9-12が大幅にこの分野での研究を促進すべきです。
卵巣の脂肪パッドの表面的な場所を考えると、小動物イメージングシステムは、強い蛍光または生物発光レポーターで標識されたengraftmentsをフォローアップするために使用することができます。また、このような非線形顕微鏡22のような低侵襲性の高解像度ライブイメージングアッセイを確立することが可能であるべきです。卵巣の脂肪パッドも器官培養で維持することができ、それによって可能密接に細胞の組織と細胞外マトリックスを反復する条件の下で正常及び腫瘍性上皮の三次元培養をる。今後の研究では、これらの有望な可能性に対処すべきです。
いくつかの重要なステップを考慮しなければなりません。加熱パッドを提供し、手術中に暖かいげっ歯類を維持することが大幅に生存率を向上させます。脂肪パッドを扱う機器の無菌性は、移植されたシステムが無菌に保たれることが保証されます。我々の経験では、重大な出血は、移植の成長遅延をもたらします。重要なのは、脂肪パッドの切開が正確に脂肪パッドを引き裂くまたは出血の原因を介して穿刺するためなされるべきです。凝固剤は、必要に応じて出血を止めるために使用されるべきです。発達しないengraftments場合、注入された細胞のより高い濃度を考慮すべきです。最初に成功した派生物は、移植後1週間早けれとして観察され、最も目に見えるものでなければならないengraftmentsすることができます手続き後の月。移植のために、より大きな直径(23-25 G)を有する針は、大きなセル(直径10μm程度以上)の剪断を防止するために使用することができます。しかしながら、そのような針は、脂肪パッドに、より外傷性であってもよく、それらの使用は、事前に試験されるべきです。我々の実験のために我々は6〜8週齢のドナーとレシピエントマウスを使用しています。両方の目的のために、若いまたは古いマウスを使用することができます。しかし、注入した細胞の数を調整する必要があります。若年ドナーにおける卵巣の脂肪パッドの小型化も考慮される必要があります。
いずれの方法と同様に、マウスの卵巣の脂肪パッド移植アッセイのいくつかの制限があります。同系免疫適格マウスは、マウス初代細胞/組織のために使用することができますが、私たちの技術は、人間の体の移植のためのNSGまたはSCIDマウスが必要です。ヒト上皮細胞の増殖を支持するために脂肪パッドをヒト化することが可能と思われます。しかし、我々はまだこのアプローチをテストしていません。若いFEの使用男性は下繁殖コストをリードすることができ、しかし、成熟した処女雌マウス(年齢8〜10週間)は、それによって、より大きな標本の移植を可能にする、より大きな脂肪パッドを持っています。最後に、実験者は、手順のタイムリーで正常に実行されたことを確実にするために、動物の手術で訓練する必要があります。
The authors have nothing to disclose.
我々は、ヒト細胞HIO118を提供するために、博士アンドリューK.ゴドウィン、カンザス大学メディカルセンターに感謝したいと思います。 (; T028095 NYSTEM)と子の健康とAFNの人間開発(P50HD076210)の健康/国立研究所の国立研究所、およびNYSTEM(C028125、C024174からの助成金によってこれらの研究は、ニューヨーク幹細胞プログラムからの助成金によってサポートされていましたT028095)、アインへの健康/国立癌研究所(CA182413)および卵巣がん研究基金(327516)の国立研究所。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
dispase II | Worthington | NPRO2 | |
DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
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