الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

Summary

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Abstract

التحقيق ميكروفلويديك (MFP) يسهل أداء الكيمياء المحلي على ركائز البيولوجية عن طريق حصر كميات نانولتر من السوائل. باستخدام تطبيق واحد معين من MFP، وهرمي الهيدروديناميكية الحبس تدفق (hHFC)، يتم جلب السوائل متعددة في وقت واحد في اتصال مع الركيزة. مفعولها الكيميائي المحلي وتشكيل السائل باستخدام hHFC، واستغلالها لخلق أنماط الخلية عن طريق الناشر محليا وإزالة الخلايا. من خلال الاستفادة من القدرة المسح الضوئي من خلال الجهاز نفسه، يتم إنشاء أنماط المعرفة من الطبقات الوحيدة الخلية. هذا البروتوكول يتيح السريع، في الوقت الحقيقي وتسيطر مكانيا الزخرفة الخلية، والتي يمكن أن تسمح انتقائية خلية خلية وخلية مصفوفة دراسات التفاعل.

Introduction

في بيئتهم المحلية، والخلايا في الأنسجة البيولوجية تنظر مجموعة من الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية توجيه نموها، والتنظيم، والتنمية. فهم هذه العظة يتطلب التحقيق الانتقائي للخلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات. وهذا يتطلب تطوير أساليب الطبقات الوحيدة الخلية الزخرفة. الأساليب لمنفصلة هندسيا أنواع مختلفة من الخلايا في الثقافة (الزخرفة) تمكين دراسات واسعة من الإشارات الفيزيائية والكيميائية في بيولوجيا الخلية. معظم النهج الحالية لطبقات الخلايا الزخرفة ^1-4 تعتمد على إيداع بروتينات الخلية الالتصاق على السطوح أو استخدام الإستنسل microfabricated للنمو الانتقائي على ركائز. في المقابل، هنا نقدم طريقة لبسرعة الطبقات الوحيدة الخلية نمط في الموقع، أي خلايا في الثقافة، عن طريق إزالة الخلايا في مناطق مختارة من أحادي الطبقة. الأساليب التي تؤدي هذا مطروح الزخرفة ^5-9 usuaتتطلب LLY ركائز المتخصصة، والمعالجة السطحية، عملية معقدة، الاتصال الجسدي أو الاجتثاث باستخدام الليزر، مما يؤثر عن غير قصد الخلايا الحية. نحن هنا استخدام مسبار ميكروفلويديك (MFP) ^10،11، عدم الاتصال مسح تكنولوجيا ميكروفلويديك أن تحصر hydrodynamically السائل على ركيزة. عنصر واحد مهم من MFP هو رئيس microfabricated تحتوي على microchannels (الشكل 1). تتكون منصة المرتبطة مضخات حقنة من أجل السيطرة السائلة، مراحل لمسح السيطرة ومجهر مقلوب لتصور وردود الفعل (الشكل 2). ، يضم رئيس MFP في التكوين الأساسي وهما microchannels مع فتحات في ذروة، واحدة لحقن السائل تجهيز والآخر لالشفط السائل معالجة حقن جنبا إلى جنب مع بعض السائل الغمر (الشكل 3A). خلال عملية MFP، قمة هي على مسافة ثابتة من الركيزة. عندما يكون معدل تدفق الطموح (QA) هو sufficieأعلى ntly من معدل تدفق الحقن (س _ط)، أي سؤال _من: س _ط ≥ 2.5، يقتصر السائل المعالجة على الركيزة. وهذا يؤدي إلى حبس تدفق الهيدروديناميكية (HFC). ويطلق على المنطقة التي السائل المعالجة في اتصال مباشر مع الركيزة البصمة. لظروف التشغيل العادية، وتدفق السائل المعالجة في إطار HFC يتميز عدد رينولدز منخفضة (إعادة ≈ 10 ^-2) وعدد كبير Péclet (بي ≈ 10 ^2). وهذا يعني تدفق السائل في نظام الصفحي مع الحمل يكون هو الوسيلة الأساسية للنقل الجماعي من الأنواع الكيميائية. يتم وصف النماذج العددية والتحليلية للحبس تدفق أماكن أخرى ^12-14.

في هذه الورقة، ونحن نستخدم هذا النهج من حصر في وقت واحد السوائل معالجة متعددة، وهو ما يسمى HFC الهرمي (hHFC) ^14. لتنفيذ hHFC مع MFP، وهما additionaوهناك حاجة إلى فتحات لتر إلى توفير مصدر ثانوي للحقن والطموح. وهذا يتيح لنا أن نحصر السائل واحدة داخل السائل الثاني. والداخلية فوائد (معالجة) السائل من أن محمية من الحطام طائشة على الركيزة التي (التدريع) السائل الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، hHFC يسمح العملية في وضعين: (ط) وضع المتداخلة، التي السائل المعالجة في الاتصالات HFC الداخلية السطح (الشكل 3B)، و (ب) وضع مقروص، والذي يفقد السائل الداخلي الاتصال و فقط السائل الخارجي في اتصال مع الركيزة (الشكل 3C). التبديل بين وضعي يسمح للمستخدمين لإحداث أو إيقاف معالجة الركيزة ويتحقق عن طريق التحكم في الفجوة الرأس إلى السطح أو عن طريق تغيير النسبة بين التدفقات حقن (Q _{شركة i2} / س _I1). للهندسة قناة معينة، البصمة للسائل المعالجة على ركيزة يمكن السيطرة عليها عن طريق تحوير ظروف تدفق (الشكل 3D). HYDR الصوديومأكسيد (هيدروكسيد الصوديوم) يتم استخدام السائل تجهيز الداخلي لليز الخلايا، ويستنشق المحللة باستمرار من السطح. لأنه يتم ترجمة الآثار الكيميائية للسائل المعالجة إلى بصمة HFC الداخلية، تبقى الخلايا المجاورة رابط الجأش، والذي يسمح الدراسات الزمانية المكانية من التفاعلات خلية خلية. وظيفة المسح الضوئي للطابعة متعددة الوظائف تسمح للإنشاء وهندستها المعرفة من أنماط الخلية (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، واختيار من هيدروكسيد الصوديوم مثل تجهيز السائل يستوعب تحليل الحمض النووي المصب (الشكل 7).

Protocol

1. MFP رئيس ومنهاج تنظيف وتحضير

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول موجه عموديا الهجين السيليكون والزجاج MFP يرأس ^15،16. عنصر السيليكون الرأس يحتوي و microchannels، والتي هي محفورا على عمق 100 ميكرون. والمستعبدين السيليكون محفورا على الزجاج باستخدام الربط انوديك. ويضم تصميم قناة نمط تتكون من ست قنوات، كل منهما للحقن والطموح، واثنين من لحقن السائل الغمر (الشكل 1). القنوات المستخدمة لحقن الغمر السائل تجدد وسائل الإعلام المحيطة العينة البيولوجية، وبالتالي تجنب الخسائر الناجمة عن الطموح والتبخر. القنوات الداخلية والخارجية القنوات المستخدمة في العمل الحالي هي 100 × 100 ميكرون و 200 × 100 ميكرون على التوالي. ويتم الحصول على تلفيق ما بعد وتجهيزها، ورؤساء MFP مع قنوات واضحة ووالحصان مصقول.

1. إعداد محطة ضخ ومعالجة السوائلجهاز
   1. استخدام الشعيرات الدموية مع 1/16 '' (1.59 مم) القطر الخارجي و 0.02 '' (0.51 مم) القطر الداخلي لجميع الأنابيب المتصلة الحقن. تختلف حجم الشعرية بناء على الطلب والحصول على وصلات والتجهيزات المناسبة للربط بين رئيس MFP مع الحقن. استخدام الماء عالى النقاء أينما ضرورية التخفيفات.
   2. الحقن النظيفة (250-500 حجم ميكرولتر) والمحاقن الغطاسون صوتنة في محلول التبييض 0.5٪ في الماء عالى النقاء ل- قبل وما بعد التجارب الخلية الحية. شطف لهم جيدا بالماء. ملئها بالماء عن طريق غمر النصائح تماما في حمام مائي والشفط باستخدام المكبس. تطهير السائل بينما في حمام مائي مع رمح حقنة الاتصال ختم في الخروج من الحقنة. وينظر إلى تكرار نضح وتطهير حتى عدم وجود فقاعات الهواء في الأعمدة حقنة.
   3. توصيل الحقن لشغل مضخات الحقن باستخدام موصلات لور قفل. استخدام صمام التبديل التي شنت علىمضخات لتوجيه السائل من المحقنة إلى واحد من اثنين من الشعيرات الدموية مما يؤدي إما إلى رئيس MFP أو إلى خزانات السائل (الشكل 6). (إذا لم يكن هناك صمام التبديل متاح انظر القسم 1.4.4). تطهير كل من الشعيرات الدموية مع الماء من الحقن بمعدل تدفق حوالي 10 - 50 ميكرولتر / دقيقة، اعتمادا على حجم الحقنة حتى لا يتبقى حوالي 10 ميكرولتر من المياه في الحقن.
   4. قبل إدراج الشعيرات الدموية تطهير الى المناسب ميكروفلويديك موصل / محول التي واجهات مع فيا القناة في الرأس (على سبيل المثال، M1 الموصل - انظر المواد).
2. MFP إعداد الرأس
   1. تنظيف رأس MFP صوتنة استخدام المنظفات لتنظيف الأواني الزجاجية القياسية أو 0.5٪ التبييض لتنظيف صرامة، لمدة 5 دقائق. تطهير قنوات مع الماء بغمر قمة في المياه وتطبيق فراغ لفيا.
   2. تفقد قنوات تحت مجهر تشريحي للعوائق المحتملة (انسداد) وإعادةالجفت الخطوة السابقة إذا لزم الأمر.
   3. جبل الرأس نظيفة على صاحب الرأس والمسمار موصل مع الأنبوب قبل إدراج وتطهير على الرأس. المسمار صاحب الرأس إلى مرحلة Z، والذي يستخدم للتحكم في مسافة الفجوة بين الرأس وأحادي الطبقة الخلية.
3. معايرة مراحل المسح من منصة MFP
   1. أداء المعايرة نقطة النهاية للX-، Y- وZ-مراحل قبل ربط الرأس إلى المنصة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع واجهة البرامج المناسبة. مراحل معايرة ضمان الدقة في تحديد المواقع ورئيس MFP.
   2. الحصول على الخام بعد الفجوة صفر (التصفير) من خلال جلب رأس MFP على شريحة الغرفة دون الخلايا وينزل ببطء في 5 ميكرون الخطوات. على اتصال التحقيق مع الركيزة، ينبغي مراعاة حلقات نيوتن. هذا هو تقدير الخام. موقف دقيق التي يمكن الحصول عليها بعد تعديل اشتراك في المستوى من قمة التحقيق الى substratه.
   3. لضمان اشتراك في المستوى من قمة التحقيق، وضبط الميل للرئيس باستخدام مقياس الزوايا (في واجهة الرأس والمرحلة Z). عندما شكل ضمان حلقات نيوتن هي متماثل (الشكل 1). نقل ميكرون MFP رأس 20 بعيدا عن الركيزة وضبط الميل باستخدام مقياس الزوايا. تكرار الهبوط، التصفير وتعديل الميل إلى حلقات نيوتن هم متماثل على اتصال. مع تعديل الميل، وتعيين موضع ض التي تنتج حلقات نيوتن متماثل صفر.
      ملاحظة: المرحلة Z تسيطر على مسافة وجها لالركيزة، في حين أن المرحلة XY تسيطر على مسح الركيزة (الشكل 2). ويمكن الاطلاع على شرح مفصل في عملنا السابق ^14.
4. التحضيرات الكيميائية لإزالة المحلية من طبقات الخلايا
   تحذير: أين المعدات المناسبة استخدام سلامة (على سبيل المثال، قفازات النتريل، ونظارات السلامة) للمواد الكيميائية التي يجري إعدادها. استخدام هوو الدخاند إذا لزم الأمر لإعداد الحلول. إعداد جميع المواد الكيميائية ومخازن مع الماء عالى النقاء كما مخفف.
   1. تجهيز 50 حل ملي هيدروكسيد الصوديوم كما السائل تجهيز لقناة حقن الداخلية (شركة i2 مع _I2 تدفق س في الشكل 1).
   2. إعداد الحل استخراج العازلة اللازمة لحقن الخارجي (I1 مع _I1 تدفق س في الشكل 1)، ويتألف من 1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 0.5٪ توين 20، و 10 ميكرومتر رودامين B في 50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane في درجة الحموضة 8. لتطهير، واستخدام الماء في الحقن الطموح.
   3. تصفية كل الحلول باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرون. ديغا جميع الحلول التي تمت تصفيتها باستخدام مجفف حتى توقف الهواء المذاب محتدما إلى السطح.
   4. استخدام خط هجرة متصلا مضخات المحاقن، وتطهير المياه بقايا ونضح الحلول نزع الغاز في الحقن الحقن في 40 ميكرولتر / دقيقة حتى الحقن هي كاملة (250 أو 500 ميكرولتر).وهذا يضمن ملء فقاعة خالية من الحقن، وصلات، والشعيرات الدموية. نظام صمام ثنائي الشعرية حقنة التبديل يسمح ملء المحاقن منتصف التجربة. في حالة عدم وجود مثل هذا صمام التبديل، قطع الشعيرات الدموية من الرأس وملء الشعيرات الدموية وحقنة بواسطة الشفط الحلول نزع الغاز قبل إعادة عليهم في الرأس.
   5. الشفط معالجة وقائية السوائل من خلال الشعيرات الدموية يسمح لاستخدام كميات صغيرة خلال العملية. إذا كانت المواد الكيميائية يمكن أن تكون مستعدة بكميات كبيرة، وملء المحاقن مع الحلول المطلوبة مباشرة. على سبيل المثال، المحاقن الطموح التي تحتوي على الماء ويمكن ملء باستخدام هذا النهج.
   6. تطهير الشعيرات الدموية في الرأس MFP مع السوائل المخصصة لكل قناة كما هو محدد في 1.4.1 و1.4.2.
      ملاحظة: الحل استخراج العازلة الدروع هيدروكسيد الصوديوم في الحبس الداخلي والمكون رودامين في المخزن المؤقت يسهل التصور من الالبريد hHFC خلال العملية.
   7. إذا كانت الخلايا الإفراط في متموجة، مع المجاميع الخلية التي تظهر على سطح مثقف، استكمال استخراج العازلة مع 10٪ بروتين K. يكمل هذا العمل من هيدروكسيد الصوديوم على هذه المجاميع عن طريق إذابة البروتينات التشويه والتحريف كما المحللة يدخل قنوات الطموح. هذا يمنع انسداد القنوات خلال العملية.
5. إعداد الطبقات الوحيدة الخلية على الشرائح غرفة
   تحذير: استخدام غطاء الثقافة خلية لزراعة الخلايا والتعامل مع المعدات وفقا للوائح التي وضعتها ضابط السلامة البيولوجية في المختبر. ملاحظة الاحتياجات الخاصة من خطوط الخلايا المحددة والتكيف مع بروتوكول والمعدات وفقا لذلك.
   1. حاضنات ثقافة استخدام الخلية (في 5٪ CO ₂ وفي 37 درجة مئوية) للثقافة وتوسيع الخلايا لتكون منقوشة. أداء التوسع باستخدام بروتوكولات الثقافة الخلية القياسية ^17،18 في قوارير تي. استخدام وسائل الإعلام زراعة وفقا لمتطلبات محددة سلخط ل (على سبيل المثال، في الدم والمضادات الحيوية تستكمل DMEM لزراعة MCF7 وMDAMB 231).
   2. على الوصول إلى نقطة التقاء خلية في قوارير الثقافة، يعرض للتريبسين وجمع الخلايا والبذور 2 × 10 ⁵ خلية / سم ² في كل من الشرائح 2-غرفة للالزخرفة والثقافة أكثر من 48 ساعة. استخدام الخلايا في إحدى الغرف وجهاز تحكم لنمو الخلايا وقدرتها على البقاء.
   3. على الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا على الشرائح غرفة، واحتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة مع 500 ميكرولتر محلول الصبغة خلية تعقب (على سبيل المثال، اللون الأخضر - CMFDA أو البرتقال - CMRA) بتركيز 10 ميكرومتر أعدت في المصل خالية المتوسطة. ويتم ذلك عن التصور الخلية خلال الزخرفة. غسل الخلايا المسمى مع برنامج تلفزيوني عن طريق تنظيف بلطف كل غرفة باستخدام ماصة، وبعد ذلك ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام تستكمل المصل للتجارب الزخرفة.
   4. الحصول على صورة مرجع من سطح الخلية الملون خلية تعقب لغرض عد الخلايا. ويتم ذلك لضمانconfluency من طبقة الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يخدم كمساعد للتجارب الكمي إذا انتعاش عينة وتحليل الحمض النووي هي أهداف.
      ملاحظة: في حالة أن يتم تقييم قابلية الخلية خلال الزخرفة، يمكن أن تكون ملطخة الخلايا مع مجموعة سمية الخلايا الحية / الميت وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

2. إنشاء الهرمي هيدرودينامي تدفق الحبس (hHFC)

1. نقل MFP على أحادي الطبقة الخلية إلى مسافة الفجوة من 50 ميكرومتر من شريحة زجاجية. هذه المسافة الفجوة مع ضمان الاتصال من hHFC حسابات أيضا عن سطح أحادي الطبقة واختلاف سماكة.
2. حقن هيدروكسيد الصوديوم في 6 أو 8 ميكرولتر / دقيقة من خلال شركة i2. تقييم معدلات تدفق الأخرى (أي، س _I1، س _A1 و _A2 س) باستخدام القواعد التدفق في الشكل (3).
3. تعدل حجم HFC الداخلي عن طريق تغيير نسبة س _I2 / س _I1 باستخدام الحقن الحقن.على سبيل المثال، استخدام س _I1 بين 1.3 ميكرولتر / دقيقة و 4 ميكرولتر / دقيقة، مع س _I2 الثابتة في 8 ميكرولتر / دقيقة، مما يؤدي إلى بصمة هيدروكسيد الصوديوم من 150-300 الخلايا (100-200 ميكرون ² / خلية) ( الشكل 3D).
4. حقن المتوسطة كاملة من الخارجية، حيث ان معظم فتحات على رأسه MFP بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة لحساب التبخر من وسائل الإعلام وتطلع خلال تشغيل hHFC.

3. الطبقات الوحيدة الخلية الزخرفة عن طريق hHFC

ملاحظة: يحدد نمط المسح مجالات أحادي الطبقة الخلية حيث يتم استخراج الخلايا (الزخرفة مطروح)، وترك الخلايا المتبقية لدراسة المسائل البيولوجية المحددة. هذا النمط يمكن أن يكون خطوط مستقيمة أو مجموعة من النقاط، على سبيل المثال. تتطلب الأنماط المعقدة تصميم مسار المسح مناسبة. على سبيل المثال، يوفر مسح مسار متقلب شبكة من المناطق خلية (كما هو موضح على سبيل المثال في الشكل 4A )، والتي من شأنها أن تمكن دراسة تأثير محفزات مختلفة على الخلايا في الساحات المختلفة في حين يجري على مقربة. يمكن إنشاء هذه الأنماط باستخدام السيطرة على مراحل XY من المنصة، حيث يسمح للبرنامج حاسوبي لمراقبة برمجة مسارات المسح الضوئي للرئيس MFP على أحادي الطبقة الخلية.

1. تعيين البرمجيات مرحلة لمسح رأس مسبار على أحادي الطبقة خلية في أنماط المعرفة من قبل المستخدم (عن طريق وضع X، Y والإحداثيات Z) في سرعة المسح الضوئي من 10 ميكرون / ثانية على مسافة الفجوة من 50 ميكرون.
2. مع hHFC متداخلة في عملية وفي اتصال مع أحادي الطبقة، مسح MFP مع مسار النمط المطلوب لإحداث إزالة الخلايا نمط.
3. لثقافة مشتركة بعد أول إزالة نوع من الخلايا، البذور خط خلايا مختلفة لملء الفجوات، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة في القسم 1.5. التنقل بين وسائط المتداخلة ومقروص (عن طريق زيادة المسافة الفجوة، على سبيل المثال) للسيطرة على إزالة الخلايا.
   ملاحظة: قد يكون سرعة المسح الضوئي ليكون investiبوابات للخطوط الخلايا الأخرى. سرعة المسح الضوئي المستخدمة في هذه الآثار مظاهرة إزالة الخلايا كاملة على المناطق الممسوحة ضوئيا لخطوط الخلايا المستخدمة.

4. التجهيز النهائي لأخذ عينات الحمض النووي والتضخيم

1. تجهيز محطة لأخذ العينات للتحليل المصب من المحللة. لوحات قياس، استخدم طبع 3D 8 الشريط حامل أنبوب PCR. بدلا من ذلك، اختيار حامل أنبوب المناسب لتكون بمثابة هذا المحول، التي هي قادرة على أن تكون محمولة ضمن نطاق المسح من الرأس خارج الركيزة. مسح حامل أنبوب مع 70٪ من الإيثانول أو غيرها من المواد المزيلة للتلوث سطح بناء على التقشف المطلوبة للتطبيق. استخدام مشبك مغناطيسي على حامل أنبوب لنعلق عليه على حامل الركيزة.
2. بعد إعداد محطة أخذ العينات، ووضع MFP رأس 100 ميكرون من أحادي الطبقة. بدء تشغيل hHFC مع 50 ملي حل هيدروكسيد الصوديوم كما السائل تجهيز لقناة حقن الداخلية مع معدلات التدفق من 1 6، -7 و-17.5 ميكرولتر / دقيقة لس _{I1، I2} س، س _A1 و _A2 س على التوالي.
   1. بمجرد استقرار الحبس تدفق (في حوالي 10 ثانية)، ينزل رأس مسبار لمسافة الفجوة من 50 ميكرون لأداء تحلل المحلي هيدروكسيد الصوديوم مقرها المختار شبه السكان من الخلايا التي تحتوي على hHFC. مرة واحدة تحلل من سكان شبه كاملة (حوالي 30 ثانية لكل البصمة)، وإدارة يتجه نحو الأنابيب في محطة أخذ العينات. إخراج المحللة التي تم جمعها في أنابيب PCR مباشرة (الشكل 6).
3. لمعالجة المصب من المحللة، أولا تحييد الحموضة من الحل عن طريق خلط المحللة مع العازلة تريس (1: 1). بعد تحييد حرارة المحللة إلى 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم تحميل مباشرة المحللة في سير العمل QPCR القياسية التي وضعها المورد من الصك.

النتائج

ويتجلى بروتوكول صفها لتنميط مطروح السريع من الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام منصة متعددة عنصر MFP (الشكلان 1 و 2). بروتوكول توظف الهرمي الهيدروديناميكية تدفق الحبس (hHFC، الشكل 3) لعلاج محليا وإزالة الخلايا من الطبقات الوحيدة الخلية، وذلك باستخدام هيدروكسيد الصوديوم كما السائل المعالجة. ويتألف التكوين hHFC على HFC الداخلي والخارجي HFC. وهيدروكسيد الصوديوم محصورة في hHFC الداخلية يدخل مفعولها الكيميائي والقص على الخلايا على اتصال. ضمن هذه البصمة، تتعرض الخلايا متجانس لعمل مادة كيميائية من هيدروكسيد الصوديوم، بسبب الحمل الحراري مدفوعة نقل الجماعي داخل ومع نشر يذكر أن هذه المنطقة خارج الحبس. القص على الخلايا من ناحية أخرى، يمكن أن يتغير من خلال تغيير معدل التدفق من هيدروكسيد الصوديوم. لتبسيط المعايير التشغيلية، اخترنا لجعل العمل الكيميائي الآلية الغالبة على إزالة الخلايا بالمقارنة مع القص. إلىتقدير قوة القص المطبقة من قبل hHFC على السطح، تم بناء نموذج محدود عنصر باستخدام COMSOL Multiphysics 5.0. تم تشغيل المحاكاة باستخدام وحدة CFD للتدفقات الصفحي. تم تطبيق شرطين الحدود مدخل إلى فتحات حقن للهندسة واثنين من الشروط الحدية منفذ لفتحات الطموح (الشكل 5) لمجموعة من معدلات التدفق وأبعاد الفتحة المستخدمة في مظاهرة الحالية. في نموذج تم الحصول عليها، أملت قواعد تدفق البيانات الشخصية القص، في حين أن معدلات تدفق حددت حجم القص على السطح. عمليا، مزيج من الاثنين معا يحدد إذا كان hHFC الاتصالات السطح. حفظ هذه العوامل في الاعتبار، وشرعنا في العثور على مجموعة من معدلات تدفق للتشغيل من أجل الحصول على إزالة الخلايا المسيطرة كيميائيا. لإنشاء hHFC، ونحن نستخدم القاعدة تدفق من الطموح الكلي لحقن نسبة معدل تدفق 3.5. لقد حددت القواعد تدفق الأخرى المستخدمة للحد من انسداد في قنوات الطموح،والتي يمكن أن تسببها البروتينات التشويه والتحريف التمسك الأسطح القناة. باستخدام النموذج المطور، وجدنا معدلات تدفق 5-10 ميكرولتر / دقيقة ترجمة لإجهاد القص بين 1 و 3 N / م ^2. دون التأثير الكيميائي للهيدروكسيد الصوديوم، على سبيل المثال في حالة استخراج العازلة، وإجهاد القص لن تكون مرتفعة بما يكفي لإزالة الخلايا ^19. ضمن نطاق الملحوظ، نلاحظ أن العملية في معدلات التدفق العالي هي أكثر واقعية نظرا للاضطرابات في مسار التدفق في انخفاض معدلات تدفق الطموح (أي س _I2 <4 ميكرولتر / دقيقة) بسبب الحطام خلية في القنوات.

وبالنظر إلى الملف الشخصي القص درس والاعتبارات العملية، ومعدلات تدفق هيدروكسيد الصوديوم (س _I2) بين 6 و 8 ميكرولتر / دقيقة تستخدم لتجارب الزخرفة وس _I1، س _A1 وس _A2 وفقا للقواعد تدفق هو مبين في الشكل (3). ونسبة التدفقات حقن (س _I2 / س _I1) يسمح شالصورة لمواصلة تعدل حجم البصمة hHFC (الشكل 3D) والشكل (4B)، مع المبدأ الأساسي الذي وضعته Autebert وآخرون. ^14. باستخدام قدرة السائل تشكيل لhHFC مقرونا عالية الدقة قدرة المسح من منصة MFP، علينا أن نظهر الجيل شبكة الخلية الحية على مستويات متعددة وتظهر علاوة على ذلك تطبيق بروتوكول معين في تطوير المشترك الثقافات (الشكل 4C).

كما يسمح النظام الأساسي لنا لأداء عينة استرجاع المحللة لتحليل المصب. لإظهار جودة المحللة التي تم الحصول عليها، ونحن عينات هي lysed محليا الخلايا من واحد وخمسة أقدام في تجربتين مستقلة، والتي تبين الاختلاف في كميات من الحمض النووي التي تم الحصول عليها من المحللة (الشكل 7). هنا، نحن تضخيم الحمض النووي الواردة في المحللة باستخدام بادئات بيتا الأكتين (إلى الأمام: GGATGCAGAAGGAGATCACT وعكس: CGATCCACACGGAGTACTTG ) باستخدام 4 ميكرولتر من المحللة تحييد في كل رد فعل PCR.

الشكل 1. وحدات من منصة MFP والرأس. (A) وحدات التشغيلية للمنصة تشتمل بمحركات الحقن، ومراحل الآلية وحدة تحكم. توصيل MFP إلى Z-مرحلة الآلية للسيطرة على مسافة الفجوة بين الرأس والركيزة، ويتم إرفاق حامل الركيزة إلى X- ومراحل بمحركات Y-تشكل نظام المسح الضوئي. (ب) رئيس MFP ديه فيا الموائعية لربط محطة الضخ، وتصاعد الثقوب لتركيب رأس على المرحلة Z، والقنوات التي يخرج من قمة مصقول. تم تعيين قمة متحد المستوى إلى الركيزة ثقافة الخلية. حلقات متماثل نيوتن يمكن ملاحظتها عند قمة والركيزة هي متحد المستوى وعلى اتصال. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. منصة MFP. وقد تم تجهيز منصة المسح الضوئي عالية الدقة مع صاحب الرأس تشكيله التواصل مع Z-مرحلة عالية الدقة المزودة بمحركات. توصيل حامل الركيزة لمرحلة XY لأغراض الفحص. لاسترداد المحللة لتحليل المصب، يتم قص محطة أخذ العينات 3D المطبوعة مغناطيسيا إلى جانب حامل الركيزة (كما هو موضح في الشكل). وتقع مضخات الحقنة، مجهر مقلوب، وأجهزة التحكم ويعرض في جميع أنحاء منصة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
الشكل 3. الهرمي الحبس تدفق الهيدروديناميكية (hHFC) من أجل السيطرة المكانية والزمانية لإزالة الخلايا. (A) تخطيطي لHFC واحد. (ب) متداخل و (C) مقروص طريقة عملها hHFC. (D) صورة البصمة لمدة نسب مختلفة تدفق الحقن / الطموح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. أنماط الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام طابعة متعددة الوظائف. (A) الجيل الخلوي الشبكة عن طريق المسح الضوئي المبرمج للMFP على خلية أحادي الطبقة MDA-MB-231. كانت ملطخة الخلايا مع الأخضر خلية تعقب صبغ. (ب) بصمة لنسب حقن مختلفة (ن) على الخلية أحادي الطبقة MCF7. يظهر التخطيطي الاختلاف المتوقع في شكل HFC الداخلي مع وجود تغيير في ن. (C) منقوشة الثقافة المشتركة التي كتبها الزخرفة مطروح من MCF7 أحادي الطبقة تليها البذر MDA-MB-231 الخلايا في مناطق مطروح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. الإجهاد القص على السطح عند تطبيق hHFC. وإجهاد القص على ارتفاع سطح خطيا مع معدل تدفق الحقن الداخلي. وتوجد أعلى نقطة القص بين اثنين من فتحات الداخلية (أقحم الأيمن السفلي)، حيث يقتصر السائل تجهيز (خطوط تدفق الأحمر، أكبر أقحم الأيسر). أبعاد الفتحة المستخدمة في النموذج محدود عنصر هم 200 و 100 و 100 و 200 ميكرون لI1، I2، A1و A2 على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6. تشغيل وسائط من منصة MFP لأداء إزالة الخلايا والزخرفة. (A) تخطيطي لمسار تدفق للالزخرفة مطروح من قبل تحلل الخلية. للبساطة، وتظهر واحدة فقط من كل الحقن وتدفق طموح المسارات. تمتلئ الحقن باستخدام صمام استنزاف في المضخات. وتستخدم I1 و I2 لحقن استخراج العازلة وهيدروكسيد الصوديوم، على التوالي. (ب) رسم تخطيطي للمسار تدفق للانتعاش المحللة. يتم تنشيط هذا مسار تدفق بعد جمع الخلايا المحللة للتحليل باستخدام مسار تدفق في الفقرة (أ). الرجاء أنقرك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. تحليل المصب من الحمض النووي من المحللة الخلية باستخدام QPCR. المؤامرات (A) التضخيم من الحمض النووي في المحللة المستخرجة من 5 أقدام (5 FP) و 1 بصمة (1 FP). تم استخراج الضوابط بعد جمع المحللة لكلتا الحالتين. (ب) تذوب منحنيات تضخيم الحمض النووي من المحللة تبين نوعية الحمض النووي المستخرج. تم تنفيذ QPCR (N = 2، ن = 3) لتضخيم الجينات β الأكتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شخصية S1. صورة مصغرة من تصميم قناة لرئيس MFP 6 قنواتتستخدم للتجارب الزخرفة. القنوات أداء hHFC هي 200، 100، 100، 200 ميكرون واسع، و 100 ميكرون عميق. القنوات الأبعد اللذين تجديد الغمر السائل هي 500 ميكرون واسع و 100 ميكرون عميقة. وقد تم تقديم ملف GDS لنفس التصميم ومكملا لهذه المادة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نقدم بروتوكول تنوعا للالزخرفة مطروح من الطبقات الوحيدة الخلية التي تمكن جيل السريع لأنماط الخلايا المحددة مكانيا. يتم تنفيذ تحلل الانتقائي من الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام هيدروكسيد الصوديوم كما السائل التجهيز في hHFC. وهيدروكسيد الصوديوم يبدل طبيعة الفور البروتينات الموجودة في غشاء الخلية. نحن نوصي باستخدام 50 التركيز ملي من هيدروكسيد الصوديوم لضمان التجهيز النهائي للالمحللة. ويمكن زيادة هذا التركيز لمزيد من إزالة الخلايا السريعة، شريطة المحللة التجهيز النهائي ليس هدفا. وhHFC يضمن أن المناطق المحيطة بها غير المجهزة من أحادي الطبقة الخلية لا تزال تتأثر وتتوفر لأي توسيع نمط أو التحقيق خصائص أخرى من الخلايا.

معدل إزالة الخلايا هي وظيفة كل من الكيمياء والقص التي قدمها التدفق. نختار مجموعة التشغيل من معدلات تدفق لديك الكيمياء إزالة الخلايا المهيمنة. سرعات المسح الضوئي من 10-20 & #تستخدم 8 ميكرولتر / دقيقة لتسهيل "السريع" الزخرفة مطروح - م / ثانية باستخدام معدل تدفق الحقن هيدروكسيد الصوديوم من 6؛ 181. المعدل السريع للإزالة الخلايا يتناول بعض التحديات التي تواجه الطباعة سطح نهج الزخرفة على أساس ^20،21. تتطلب هذه الأساليب آلية للحد من نمو الخلايا في مناطق محددة مكانيا، على سبيل المثال، من خلال ترسب الانتقائي للبروتينات التصاق الخلية عن طريق الطباعة الاتصال الصغرى والبذر لاحق من الخلايا للحصول على نمط. تقتصر من قبل إنتاجية منخفضة وتتطلب عدة خطوات متتابعة لتوليد نمط فضلا عن الاستنسل / ختم جديد لكل نمط. لا يتطلب الأسلوب هو موضح النمو الانتقائي للخلايا في مجالات محددة، ويتغلب على العديد من القيود عن طريق أداء الزخرفة مطروح على النقيض من الطباعة، في حين لا تتطلب أي علاج إضافي من الركيزة ثقافة الخلية.

مع بروتوكول الواردة في هذه الورقة، ومرت من الطبقات الوحيدة الخلية الزخرفةوزيادة، في حين الحصول على التغذية الراجعة البصرية الفوري للنمط الذي تم إنشاؤه. هذا يسهل تعديل في الوقت الحقيقي من الأنماط. قد تكون هذه السيطرة حاسما في سيناريوهات بقاء الخلية على سطح معين ليست متجانسة. ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أن نفس الرأس والكيمياء يمكن استخدامها لتوليد أنماط متعددة، مما يقلل من عدد من الخطوات المتبعة في توليد أحادي الطبقة خلية المزخرفة.

أبعاد القنوات في الرأس والهندسة رئيس يمكن زيادتها وفقا لمتطلبات التطبيق، مما يسمح بالسيطرة على قرار من الزخرفة. تم إجراء جميع التجارب في العمل الحالي باستخدام رأس MFP ذات أبعاد الفتحة الثابتة، وتحديدا مع فتحات داخلية في 100 × 100 ميكرون وفتحات الخارجية في 200 × 100 ميكرون. وقد تم اختيار هذا التصميم مع فتحات الخارجية أكبر لضمان التشغيل المستمر من hHFC دون انسداد فتحات من قبلحطام خلية طائشة. لقد اختبرنا رؤساء ذات أبعاد الفتحة الداخلية 50 × 50 ميكرون و 50 ميكرون تباعد بينهما، وكانت النتائج ناجحة في إزالة الخلايا. استخدام فتحات صغيرة، وصولا الى 10 × 10 ميكرون مع 10 ميكرون تباعد، من شأنه أن يسمح التحجيم إلى حجم البصمة أصغر (~ 30 × 30 ميكرون)، وبالتالي توفير دقة أعلى في الزخرفة. لاحظنا المسائل التشغيلية مع فتحة أحجام أصغر من 10 ميكرون بسبب انسداد من الجسيمات. بسبب هذه الصعوبات التشغيلية، و 100 ميكرون هو الحد الحالي من القرار، وبالتالي الحد من تقنية وصفها. ومع ذلك، يمكننا معالجة هذه باستخدام القدرة تشكيل السائلة من hHFC. لقد أثبتنا أن حل إزالة الخلايا يمكن ضبطها لمجموعة معينة من أبعاد الفتحة عن طريق التحكم س _I2 / س _I1 (الشكل 4B) والفجوة قمة إلى الركيزة ^10،14. المراحل المستخدمة في العمل الحالي لديه الحد الأدنى من حجم خطوة من 100 نانومتر.مزيج من هذه المعلمات السيطرة عليها يمكن أن تحسن دقة مكانية إزالة الخلايا من حيث حجم البصمة وبعد المسح.

وإذا رغبت نمط المشترك الثقافات لدراسة التفاعلات خلية خلية معينة بين أنواع مختلفة من الخلايا، بذر متسلسل والزخرفة يمكن القيام بها باستخدام بروتوكول صفها. وأخيرا، الحمض النووي amplifiable ذات جودة عالية يمكن الحصول عليها من المحللة، كما يتضح من ذروة فريدة في الحمض النووي تذوب منحنى (انظر الشكل 7). قمنا بتقييم كمية الحمض النووي لنحو 1.6 نانوغرام من بصمة واحدة (حوالي 300 خلية) باستخدام QPCR، التي هي قريبة من التوقع النظري (6-8 غ / الخلية). وهذا يدل على كمية من الحمض النووي المستخرج مناسبة لعدة عمليات المصب في حين تفادي استخدام أي أساليب عزل الحمض النووي. هذا يفتح آفاقا لالحمض النووي التحليل المستندة المحلية تحقق من الخلايا المستزرعة. ويمكن أيضا القدرة على hHFC لتشكيل السوائل استخدامها لإيداع الخلايا والبروتينات الحية على ميلانالسطوح tivated، والتي في تركيبة مع الزخرفة مطروح ومتتابعة شارك في زراعة الواردة في هذا البروتوكول تمكن من خلق خلية وخلية مصفوفة أنماط معقدة على ركائز الثقافة. براعة والسيطرة التي تقدمها الزخرفة مطروح على أساس hHFC من الطبقات الوحيدة الخلية وإمكانية إجراء تحليل الحمض النووي في الخلايا المستخرجة، ويوفر أداة قوية جديدة لتعيين علماء الأحياء إلى إجراء دراسات حل مكانيا التي تنطوي على تفاعلات الخلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Microfluidic Probe (MFP)			Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers	ThermoFisher scientific, USA	154461	2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume
Chemicals and cell lines
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B	SigmaAldrich chemicals, USA	S5881, 252859,  E9884, R6626	Chemicals used for processing and shielding liquids
Proteinase K	Qiagen, Germany	19131	protease to digest denatuired proteins
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Switzerland		Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.
DNA away	ThermoFisher scientific, USA	7010	Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement	ThermoFisher scientific, USA	10566-016	Culturing medium for epithelial cells.
CellTracker Green CMFDA dye	ThermoFisher scientific, USA	C7025	Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.
CellTracker Orange CMRA dye	ThermoFisher scientific, USA	C34551
β-actin genomic primers for qPCR	Integrated DNA technologies, USA		Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.
MCF7 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-22	Cell lines used to produce co-cultures.
MDA-MB-231 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-26
Equipment and fluidic connections
Motorized high precision stages	Custom machined components.  Linear axis motors from LANG GmBH, Germany	Customized linear axis stages from LT series	3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.
Syringes	Hamilton, Switzerland	1700 TLLX series	Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range.
Nemesys low pressure syringe pumps	cetoni GmbH, Germany		Component of pumping station.
Circular M1-connector	Dolomite microfluidics, United Kingdom	3000051	Interface between vias in MFP head and tubing
Tilt/rotation stage Goniometer	OptoSigma, USA	KKD-25C	Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex
DS Fi2 HD color camera (CCD)	Nikon, Switzerland		Controlled using DS-U3 controller unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Germany		Stage control software.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Germany		Pump control software.
NIS Elements	Nikon, Switzerland		Basic research module for image acquisition and analysis.