דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

Summary

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Abstract

החללית microfluidic (MFP) הופך לפשוט ביצוע כימיה המקומית על מצעים ביולוגיים ידי כליאת כרכים nanoliter של נוזלים. באמצעות יישום המיוחד של MFP, כליאת הזרימה הידרודינמית ההיררכית (hHFC), נוזלים מרובים מובאים במקביל מגעים עם מצע. פעולה כימית מקומית ועיצוב נוזלי באמצעות hHFC, מנוצל כדי ליצור דפוסי תא על ידי מקומי lysing והסרת תאים. על ידי ניצול יכולת הסריקה של MFP, דפוסים המוגדר על ידי משתמש של monolayers תא נוצרים. פרוטוקול זה מאפשר דפוסים תאים מהירה, בזמן אמת ומבוקר מרחבית, אשר יכול לאפשר מחקרים אינטראקציה תאים תאים ותא-מטריקס סלקטיבית.

Introduction

בסביבה מולדתם, תאים ברקמות ביולוגיות תופסים מגוון של רמזים ביוכימיים ופיזיים בהכוונת הצמיחה, הארגון שלהם, ופיתוח. הבנת רמזים אלה מחייב חקירה סלקטיבית של אינטראקציות תאים תאים ותא-מטריקס. זה מחייב פיתוח של שיטות monolayers התא דפוסים. שיטות תאים מסוגים שונים נפרדים גיאומטרי בתרבות (דפוסים) לאפשר לימודים רחבים של רמזים פיסיים וכימיים בביולוגיה של תא. רוב הגישות הנוכחיות עבור שכבות תאי דפוסים ^{1 - 4} תלוי הפקדת חלבונים-הידבקות תא על גבי משטחים או באמצעות שבלונות microfabricated לצמיחה סלקטיבית על מצעים. לעומת זאת, כאן אנו מציגים שיטת monolayers תא דפוס במהירות באתרו, כלומר, תאים בתרבית, על ידי הסרת תאים באזורים נבחרים של בשכבה. שיטות מבצע דפוסי תוסף כזה ^{5 - 9} usually דורש מצעים מיוחדים, טיפול פני שטח, מבצע מורכב, מגע פיזי או אבלציה באמצעות ליזר, המשפיע על תאי חיים בטעות. אנחנו כאן להשתמש בדיקת microfluidic (MFP) ^10,11, טכנולוגית microfluidic סריקה ללא מגע כי hydrodynamically תוחמת נוזל על מצע. אחד המרכיבים החשובים של MFP הוא ראש microfabricated המכיל microchannels (איור 1). הפלטפורמה הקשורה מורכבת משאבות מזרק לבקרה נוזלית, בשלבים לסריקה מלא מיקרוסקופ הפוכה להדמיה ומשוב (איור 2). בתצורה הבסיסית שלו, ראש MFP כולל שני microchannels עם פתחים בשיא, אחד להזרקת נוזל עיבוד ושני עבור aspirating נוזל העיבוד מוזרק יחד עם מעט נוזל טבילה (איור 3 א). במהלך מבצע MFP, איפקס הוא במרחק קבוע מן המצע. כאשר קצב זרימת שאיפה (QA) הוא sufficiently גבוה משיעור זרימת זריקה _(אני Q), כלומר, Q _א: Q _אני ≥ 2.5, נוזל העיבוד מוגבל על פני המצע. התוצאה היא כליאה זרימה הידרודינמית (פיקוד העורף). האזור שבו נוזל העיבוד נמצא בקשר ישיר עם המצע נקרא את טביעת הרגל. לקבלת תנאי הפעלה טיפוסיות, את זרימת נוזל העיבוד בתוך HFC מאופיין מספר ריינולדס נמוך (Re ≈ 10 ^-2) ומספר Péclet הגבוה (PE ≈ 10 ^2). זה מרמז תזרימי נזילים המשטר למינרית בלהיות הסעה במצב הראשוני של העברת מסה של לתרכובות כימיות. המודלים המספריים ואנליטית כליאת זרימה מתואר במקומות אחרים ^{12 - 14.}

במאמר זה, אנו משתמשים בגישה של נוזלי עיבוד מרובים כליאת זמנית, אשר נקראת HFC ההיררכי (hHFC) ^14. כדי ליישם hHFC עם MFP, שני additionaפתחי l נדרשים לספק מקור משני של הזרקה ושאיפה. זה מאפשר לנו להגביל נוזל אחד בתוך נוזל שני. היתרונות הפנימיים (עיבוד) הנוזלים מלהיות מוגנים מפני פסולת תועה על פני המצע על ידי הנוזל החיצוני (מיגון). בנוסף, hHFC מאפשר פעולה בשני מצבים: (i) המצב המקונן, שבו נוזל העיבוד במגעי HFC הפנימיים פני השטח (איור 3), וכן (ii) במצב הצבוט, שבו הנוזל הפנימי מאבד קשר רק הנוזל החיצוני נמצא בקשר עם המצע (איור 3 ג). מעבר בין שני המצבים מאפשר למשתמשים לבצע או להפסיק את טיפול המצע מושג על ידי שליטה על הראש-קרקע הפער או על ידי שינוי היחס בין שני שיעורי זרימת ההזרקה (Q _i2 / Q _i1). עבור גיאומטרית ערוץ נתונה, את טביעת הרגל של נוזל העיבוד על פני המצע יכולה להיות נשלטה על ידי ויסות תנאי זרימה (איור 3D). נתרן hydrתחמוצת (NaOH) משמשת נוזל העיבוד הפנימי lyse התאים, ואת lysate הוא aspirated ברציפות מפני השטח. מכיוון ההשפעות הכימיות של נוזל העיבוד הן נקודות כדי טביעת רגל HFC הפנימית, מהתאים הסמוכים להישאר רגועים, המאפשר מחקרי spatiotemporal של אינטראקציות תאי תאים. פונקציונלי הסריקה של MFP מאפשרת יצירת גיאומטריות המוגדרים על ידי משתמש של דפוסי תא (איור 4). יתר על כן, הבחירה של NaOH כמו נוזל עיבוד להכיל ניתוח דנ"א במורד הזרם (איור 7).

Protocol

1. ראש MFP ואת פלטפורמת ניקוי והכנה

הערה: פרוטוקול זה משתמש-בכיוון אנכי היברידית סיליקון זכוכית MFP בראש ^15,16. המרכיב סיליקון של הראש מכיל את microchannels, אשר חרוט עד לעומק של 100 מיקרומטר. סיליקון החרוט הוא קשור זכוכית באמצעות מליטת anodic. עיצוב הערוץ מורכב דפוס מורכב משישה ערוצים, שתי כל להזרקה ושאיפה, ושתי להזרקת נוזל הטבילה (איור 1). הערוצים המשמשים להזרקת נוזל טבילה לחדש את התקשורת סביב הדגימה הביולוגית, וכך למנוע הפסדים בשל שאיפה ואידוי. הערוצים הפנימיים והערוצים חיצוניים המשמשים ביצירה הנוכחית הם 100 × 100 מיקרומטר ו -200 × 100 מיקרומטר בהתאמה. ייצור ועיבוד פוסט, ראשי MFP עם ערוצים ברורים רכס מלוטש מתקבלים.

1. הכנת תחנת השאיבה-טיפול נוזלמַנגָנוֹן
   1. השתמשו נימים עם 1/16 '' (1.59 מ"מ) קוטר חיצוני ו 0.02 '' (0.51 מ"מ) קוטר פנימי לכל וצינור מחובר המזרקים. וארי גודל נימי מבוסס על יישום ולקבל המחברים ואביזרים המתאימים להתממשק ראש MFP עם מזרקים. השתמש במים ultrapure מקום דילולים נחוצים.
   2. מזרקים נקיים (250 - 500 נפח μl) ו בוכנות מזרק על ידי sonication בתמיסה אקונומיקה 0.5% ל-לפני המים ultrapure ופוסט דוקטורנטים ניסויים תא חי. יש לשטוף אותן היטב במים. למלא אותם במים על ידי טבילת הטיפים שלהם לחלוטין בתוך אמבט מי aspirating באמצעות הבוכנה. טהר את הנוזל תוך בתוך אמבט מים עם פיר מזרק פנייה חותמת ביציאה של המזרק. לשאוב טיהור חוזר על פעולה עד שאין בועות אוויר נראים במדורי המזרק.
   3. חבר מזרקים מלאים עד משאבות המזרק באמצעות מחברי Luer נעילה. השתמש שסתום מתג רכוב עלמשאבות לכוון את הנוזל מן המזרק לאחת משתי נימים מובילות גם אל ראש MFP או למאגרים הנוזליים (איור 6). (אם לא שסתום מתג זמין ראה סעיף 1.4.4). טהר הוא נימים עם מים מן המזרקים בקצב זרימה של כ 10 - 50 μl / דקה, בהתאם לגודל של המזרק עד כ -10 μl של מים נשאר המזרקים.
   4. טרום להכניס את הנימים מטוהרים לתוך מתאם מחבר microfluidic מתאים / אשר ממשקים עם vias הערוץ בראש (למשל, מחבר M1 - ראה חומרים).
2. הכנת ראש MFP
   1. נקו את הראש MFP ידי sonication משימוש בחומרי ניקוי זכוכית לניקוי רגיל או אקונומיקה 0.5% לניקוי מחמירים, במשך 5 דקות. טהר ערוצים במים על ידי טבילה במים איפקס וליישם ואקום vias.
   2. בדוק ערוצים תחת סטראו עבור חסימות פוטנציאל (סתימה) מחדשכבול בשלב הקודם במידת הצורך.
   3. הר הראש נקי על בעל ראש הבורג המחבר עם צינורות טרום מוכנס מטוהר על ראשו. בורג בעל ראש לבמה-Z, המשמש לשליטה על מרחק הפער בין הראש monolayer התא.
3. כיול בשלבי הסריקה של פלטפורמת MFP
   1. בצע כיול נקודת סיום של ה- X, א- ו- Z-שלבים לפני מחבר את הראש אל הרציף, על פי הפרוטוקול של היצרן עם ממשק תוכנה מתאים. בשלבים מכוילים להבטיח דיוק במיצוב ראש MFP.
   2. השג מרחק פער אפס גולמי (איפוס) על ידי הבאת ראש MFP מעל שקופית קאמרית ללא תאים ויורד לאט 5 מיקרומטר צעדים. במגע בדיקה עם המצע, הטבעות של ניוטון יש לשים לב. זוהי הערכה גסה. עמדה מדויקת שתופק לאחר התאמת coplanarity של הקודקוד החללי אל substratדואר.
   3. כדי להבטיח coplanarity של הקודקוד החללי, לכוונן את הטיית הראש באמצעות goniometer (על הממשק של ראש במת Z). כאשר נוצר להבטיח כי הטבעות של ניוטון הן סימטרי (איור 1). הזז את מיקרומטר MFP ראש 20 מן המצע ולהתאים להטות באמצעות goniometer. יורד חזרה, מתאפס וכוונון להטות עד הטבעות של ניוטון הם סימטריים על קשר. עם הטיה מותאמת, לקבוע את מיקום z המייצר טבעות ניוטון סימטריות כמו אפס.
      הערה: בשלב Z שולט ראש אל מצע המרחק, ואילו בשלב XY שולט הסריקה של המצע (איור 2). ניתן למצוא הסבר מפורט ב קודם לכן עבודתנו ^14.
4. הכנות כימיות להסרה מקומית של שכבות תאים
   זהירות: במקרה הצורך, ציוד בטיחות השימוש (למשל, כפפות ניטריל, משקפי מגן) עבור כימיקלים שמכינים. השתמש hoo קטרד אם הדרושות להכנת פתרונות. הכן את כל כימיקלי המאגרים עם מי ultrapure כמו diluent.
   1. כן 50 פתרון המ"מ NaOH בעוד נוזל העיבוד לערוץ ההזרקה הפנימי (i2 עם _I2 Q הזרימה באיור 1).
   2. הכן את פתרון חיץ החילוץ הנדרש הזרקה החיצונית (i1 עם _I1 Q הזרימה באיור 1), מורכב 1 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 0.5% Tween 20, ו -10 מיקרומטר rhodamine B ב 50 המ"מימ טריס (hydroxymethyl) aminomethane ב pH 8. הקאה, להשתמש מי מזרקי השאיפה.
   3. לסנן את כל פתרונות באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. דגה כל הפתרונים המסוננים באמצעות ייבוש עד תחנת האוויר המומסת מבעבעת על פני השטח.
   4. באמצעות קו הניקוז מחובר משאבות המזרק, לטהר את המים שריד לשאוב פתרונות degassed לתוך מזרקי ההזרקה ב 40 μl / min עד המזרקים מלאים (250 או 500 μl).הדבר מבטיח מילוי חינם בועות של מזרקים, מחברים, ונימים. שסתום ושתיים נימי מזרק-מתג המערכת מאפשרת מילוי של מזרקים באמצע הניסוי. בהעדר מתג שסתום כגון, ניתק את הנימים מהראש ולמלא נימים ואת המזרק ידי aspirating פתרונות degassed לפני החיבור מחדש להם בראש.
   5. Aspirating עיבוד מגן נוזלים דרך הנימים מאפשר שימוש של כמויות קטנות במהלך המבצע. אם הכימיקלים ניתן להכין בכמויות גדולות, למלא מזרקים עם הפתרונות הנדרשים ישירות. לדוגמא, מזרקי השאיפה המכילים מים ניתן למלא באמצעות גישה זו.
   6. טהר את הנימים לראש MFP עם הנוזלים שהוקצו עבור כל ערוץ כהגדרתו 1.4.1 ו 1.4.2.
      הערה: פתרון חיץ החילוץ מגן על NaOH ב הכליאה הפנימית ואת רכיב rhodamine למאגר מקל על ויזואליזציה של הדואר hHFC במהלך המבצע.
   7. אם התאים יתר ומחוברות, עם אגרגטים תא המופיעים על פני השטח תרבותי, להשלים את מיצוי חיץ עם 10% proteinase ק אלה משלימים את הפעולה של NaOH על אגרגטים אלה על ידי המסת חלבונים מפוגל כמו lysate נכנס ערוצי שאיפה. הדבר מונע סתימת ערוצי במהלך המבצע.
5. הכנת monolayers התא בשקופיות קאמרית
   זהירות: השתמש ברדס תרבית תאים עבור culturing התאים ולטפל ציוד על פי התקנות שנקבעו על ידי קצין הבטיחות הביולוגי של המעבדה. הערת דרישות מיוחדות של שורות תאים ספציפיות להתאים את הפרוטוקול וציוד בהתאם.
   1. השתמש תא חממות תרבות (ב 5% CO ₂ ו ב 37 ºC) לתרבות והרחבת התאים להיות בדוגמת. בצע את ההתרחבות באמצעות פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים ^17,18 צלוחיות T. השתמש בחומרי הדפסת culturing לפי דרישות של cel הספציפיl קו (למשל, סרום אנטיביוטיקה בתוספת DMEM עבור culturing MCF7 ו MDAMB 231).
   2. בהגיעו מפגש תא צלוחיות תרבות, trypsinize ולאסוף תאים וזרעי 2 × 10 ⁵ תאים / ² ס"מ בכל אחת השקופיות 2 קאמרית עבור דפוסים והתרבות מעל 48 שעות. השתמש תאים באחד החדרים כביקורת על גדילת תא כדאי.
   3. בהגיעו מפגש תא בשקופיות הקאמריות, דגירת התאים במשך 45 דקות עם 500 פתרון לצבוע μl תא-גשש (למשל, ירוק - CMFDA או כתום - CMRA) בשעת 10 ריכוז מיקרומטר ערוך סרום ללא בינוני. הדבר נעשה להדמית תא במהלך דפוסים. שוטף את התאים שכותרתו עם PBS על ידי שטיפת כל תא בעדינות בעזרת פיפטה, ולאחר מכן תרבות תאי מדיה-בתוספת סרום עבור ניסויי דפוסים.
   4. השג תמונת ייחוס של פני התא מוכתם תאי הגשש לצורך ספירת תאים. הדבר נעשה על מנת להבטיחconfluency של שכבת התאים. בנוסף, הוא משמש ככלי עזר עבור ניסויי כימותים אם התאוששות מדגם וניתוח DNA הם מטרות.
      הערה: במקרה זה כדאיות התא תוערך במהלך דפוסים, התאים יכולים להיות מוכתם ערכת cytotoxicity Live / Dead בהתאם להוראות היצרן.

2. יצירת מאסר זרימת הידרודינמית המבנה ההיררכי (hHFC)

1. הזז את MFP מעל monolayer תא עד למרחק פער של 50 מיקרומטר משקופית הזכוכית. מרחק פער זה תוך הבטחת מגע של hHFC בחשבון גם משטח בשכבה וריאציה עובי.
2. להזריק NaOH ב -6 או 8 μl / min דרך i2. הערכת ספיקות אחרות (כלומר, ש _I1, ש _A1 ו- Q _A2) באמצעות חוקי הזרימה באיור 3.
3. לווסת את גודל HFC הפנימי על ידי שינוי היחס של Q _I2 / Q _I1 באמצעות מזרקי ההזרקה.לדוגמה, השתמש Q _I1 בין 1.3 μl / min ו -4 μl / דקה, עם ש _I2 קבוע ב 8 μl / min, שתוצאתה טביעת רגל NaOH של 150 - 300 תאים (100 - 200 מיקרומטר ² / תא) ( 3D איור).
4. להזריק בינוני מלא מן הפתחים-החיצוניים ביותר על ראש MFP בקצב זרימה של 20 μl / min לתת דין וחשבון על אידוי של התקשורת ושל השאיפה במהלך המבצע של hHFC.

3. monolayers תא דפוסי שימוש hHFC

הערה: תבנית הסריקה קובעת בתחומים בשכבת התא שבו התאים מחולצים (דפוסי תוסף), עוזבים את התאים הנותרים ללמוד שאלות ביולוגיות ספציפיות. דפוס זה יכול להיות קווים ישרים או מערך של כתמים, למשל. תבניות מורכבות דורשות עיצוב של מסלול סריקה מתאים. לדוגמא, מסלול סריקה משובץ מספק רשת של אזורי תא (מוצג למשל איור 4 א ), אשר יאפשר אשר בדק את השפעתו של גירויים שונים על תאי ריבועים שונים בעת היותו בסמיכות. ניתן ליצור דפוסים אלה באמצעות שליטה בשלבי XY של הפלטפורמה, שבו תוכנות השליטה מאפשרת scripting של מסלולי סריקה עבור ראש MFP על monolayer התא.

1. הגדר את תוכנת הבמה כדי לסרוק את ראש הבדיקה על monolayer התא בדפוסים המוגדר על ידי משתמש (על ידי הגדרת X, Y ו- Z קואורדינטות) בכל מהירות סריקה של 10 מיקרומטר / s במרחק פער של 50 מיקרומטר.
2. עם hHFC מקוננות במבצע במגע עם monolayer, לסרוק את MFP עם מסלולו של התבנית הרצויה לבצע הסרת תא בדוגמת.
3. עבור שיתוף תרבות לאחר הסרת תאי הסוג הראשונה, זרע קו תאים שונה כדי למלא את הפערים, תוך שימוש בשיטות המתוארות בסעיף 1.5. לעבור בין מצבים מקוננים וצבטו (על ידי הגדלת מרחק פער, למשל) כדי לשלוט הסרת תאים.
   הערה: מהירות הסריקה יכולה להיות investiמגודר עבור שורות תאים אחרות. מהירויות הסריקה המשמשות להסרת תאים להשלים תופעות הפגנה הזאת מעל האזורים סרקו את שטח שורות תאים בשימוש.

4. עיבוד במורד זרם עבור הגברת הדגימה ו- DNA

1. הכן את תחנת דגימה לניתוח במורד הזרם של lysate. עבור תחנת הדגימה, להשתמש 3D מודפס 8-פס בעל צינור PCR. לחלופין, בחר בעל צינור מתאים לשמש מתאם זה, שהוא מסוגל להיות רכוב בטווח סריקה של הראש מחוץ המצע. נגב את בעל צינור עם 70% אתנול או decontaminants משטח אחר המבוססים על חומרא הרצוי עבור היישום. השתמש קליפ מגנטי על בעל צינור לצרף אותו על בעל המצע.
2. לאחר הכנת תחנת הדגימה, מקמו את מיקרומטר MFP ראש 100 מ בשכבה. בגין הפעלת hHFC עם 50 פתרון המ"מ NaOH בעוד נוזל העיבוד לערוץ ההזרקה הפנימי עם ספיקות של 1, 6, -7 ו -17.5 μl / min ש _{I1, I2} Q, Q _A1 ו- Q _A2 בהתאמה.
   1. לאחר כליאת הזרימה התייצבה (ב כ 10 שניות), יורד ראש החללית למרחק פער של 50 מיקרומטר לבצע תמוגה מקומית המבוססת NaOH של תת-האוכלוסייה הנבחרת של תאים עם hHFC. לאחר תמוגה של האוכלוסייה משנה תושלם (כ -30 שניות לכל טביעת הרגל), לכוון את הראש כלפי הצינורות בתחנת הדגימה. הוצא את lysate שנאסף לתוך צינורות PCR ישירות (איור 6).
3. עבור עיבוד במורד הזרם של lysate, הראשון לנטרל את ה- pH של התמיסה על ידי ערבוב של lysate עם טריס חיץ (1: 1). לאחר נטרול, לחמם את lysate ל -95 ºC למשך 30 דקות. ואז ישירות לטעון את lysate לתוך עבודת qPCR סטנדרטית כפי שנקבע על ידי ספק של המכשיר.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר עבור דפוסי תוסף מהירים של monolayers התא מודגם באמצעות פלטפורמת MFP מרכיב רבה (איורים 1 ו -2). הפרוטוקול מעסיק כליאת הזרימה הידרודינמית ההיררכית (hHFC; איור 3) כדי מקומית לטפל ולהסיר תאי monolayers תא, באמצעות NaOH בעוד נוזל העיבוד. תצורת hHFC כוללת HFC פנימי לבין פיקוד עורף חיצוני. מרותק NaOH ב hHFC הפנימי מציג פעולה כימית גזירה על התאים במגע. בתוך טביעת רגל זה, התאים נחשפים בצורה הומוגנית על הפעולה הכימית של NaOH, בשל העברת מסה מונעת הסעה בתוך עם דיפוזיה זניח לאזור מחוץ הכליאה. גזירה על התאים מצד שני, ניתן לשנות על ידי שינוי קצב הזרימה של NaOH. כדי לפשט פרמטרים תפעוליים, בחרנו לעשות פעולה כימיה המנגנון הדומיננטי של הסרת תאים בהשוואת הגזירה. ללהעריך את כוח הגזירה שמיישם hHFC על פני השטח, מודל סופי, אלמנט נבנה באמצעות Comsol Multiphysics 5.0. סימולציות נוהלו באמצעות מודול CFD לתזרימי למינרית. שני תנאי שפת כניסה אל פתחי הזרקת הגיאומטריה ושני תנאי שפה מוצאים אל פתחי השאיפה (איור 5) יושמו עבור הטווח של ספיקות וממדי צמצם המשמש בהפגנה הנוכחית. במודל שנתקבל, חוקי הזרימה הכתיבו את פרופיל הגזירה, ואילו הספיקות הגדירו את סדר הגודל של הגזירה על פני השטח. למעשה, שילוב של שניהם קובע אם hHFC קשרי פני השטח. שמירה על גורמים אלה בחשבון, יצאנו כדי למצוא מגוון רחב של ספיקות לפעולה על מנת להשיג סרת תא דומיננטית מבחינה כימי. כדי ליצור hHFC, נשתמש כלל זרימת שאיפה הכוללת יחס קצב זרימת הזרקה של 3.5. כללי זרימת אחרים המשמשים הוגדרו למזער סתימה בתוך הערוצים שהאיפה,אשר יכול להיגרם על ידי חלבונים מפוגלים דבק משטחי הערוץ. באמצעות המודל שפותח, מצאנו ספיקות בין 5 ל 10 μl / min תרגום כדי מתח גזירה בין 1 ו -3 N / m ^2. ללא ההשפעה הכימית של NaOH, למשל במקרה של מיצוי חיץ, מאמץ הגזירה לא יהיה גבוה מספיק כדי להסיר את התאים ^19. בטווח שנצפה, נציין כי מבצע ברמות ספיקה גבוהה יותר מעשי בשל הפרעות בנתיב הזרימה ברמות ספיקת שאיפה נמוכה (כלומר, ש _I2 <4 μl / min) בשל פסולת תא באפיקים.

בהתחשב בפרופיל גזירה למד ושיקולים מעשיים, ספיקות NaOH _(I2 Q) של 6 ו -8 μl / min משמשים הניסויים דפוסים ש _I1, ש _A1 ו- Q _A2 על פי חוקי הזרימה שמוצג באיור 3. יחס תזרימי ההזרקה (ש _I2 / Q _I1) מאפשר us להמשיך לווסת את גודל טביעת הרגל hHFC (איור 3D ואיור 4B), עם העיקרון הבסיסי פירט ידי Autebert et al. ^14. באמצעות היכולת הנוזלית בעיצוב hHFC בשילוב עם יכולת סריקה ברזולוציה גבוהה של פלטפורמת MFP, אנחנו מדגימים הדורים לרשת תא חי בקני מידה מרובות ויותר מזה להראות את היישום של הפרוטוקול הנתון בפיתוח שיתוף תרבויות (איור 4C).

הפלטפורמה גם מאפשר לנו לבצע אחזור lysate מדגם לניתוח במורד הזרם. כדי להציג את האיכות של lysate שהושג, דגמנו מקומית lysed תאים מאחד וחמישה עקבות בשני ניסויים בלתי תלויים, מראה את הווריאציה בכמויות של DNA המתקבל lysate (איור 7). כאן, אנו DNA מוגבר כלולים lysate באמצעות פריימרים β-יקטין (קדימה: GGATGCAGAAGGAGATCACT הפוכה: CGATCCACACGGAGTACTTG ) באמצעות 4 μl של lysate לניטרול כל תגובת PCR.

מודולים באיור 1. של פלטפורמת MFP ואת הראש. (א) מודולים התפעוליים של הפלטפורמה מהווים ממונע מזרקים, בשלבים ממונעים לבין בקר. שההתקן מחובר הבמה-Z ממונע לשלוט מרחוק הפער בין הראש ואת המצע, ואת בעל המצע מצורף ה- X ו- בשלבים מוטורי Y המהווים את מערכת הסריקה. (ב) ראש MFP יש vias fluidic לחבר את תחנת השאיבה, הרכבה חורים לעגן את הראש על הבמה Z, וערוצים יוצא איפקס מלוטש. איפקס מוגדר coplanar למצע תרבית תאים. הטבעות של סימטרי ניוטון ניתן להבחין כאשר הקודקוד ואת המצע הוא coplanar ובמגע. "Target =" p_upload / 54,447 / 54447fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פלטפורמת MFP איור 2.. פלטפורמת הסריקה ברזולוציה הגבוהה מצוידת בעל ראש במכונת התממשקות עם Z-הבמה ממונע דיוק גבוה. בעל המצע מחובר במת XY לסריקה למטרות. עבור התאוששות של lysate לניתוח במורד זרם, תחנת דגימה מודפסת 3D נחתכת מגנטית לצד של בעל המצע (מוצג הבלעה). משאבות מזרק, מיקרוסקופ הפוכה, הבקרים ומציג ממוקמים סביב הפלטפורמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3 "src =" / files / ftp_upload / 54,447 / 54447fig3.jpg "/>
איור 3. כליאת זרימת הידרודינמית מבנה היררכית (hHFC) לשליטה במרחב ובזמן של הסרת תאים. (א) סכמטי של פיקוד עורף יחיד. (ב) מקוננות (C) מצב צבט פעולת hHFC. (ד) תמונה של טביעת הרגל עבור שני יחסי זרימת זריקה / שאיפה שונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. דפוסי monolayers התא באמצעות MFP. (א) דור Cell-הרשת על ידי סריקה מתוכנת של MFP על monolayer תא מד"א- MB-231. תאים הוכתמו לצבוע תאים גשש ירוק. (ב) טביעת הרגל על יחסי הזרקה השונים (n) על monolayer תא MCF7. סכמטית מראה את השוני הצפוי בצורה של פיקוד העורף הפנימי עם שינוי n. (C) Patterned שיתוף התרבות ידי דפוסי תוסף של monolayer MCF7 ואחריו זריעת תאי מד"א- MB-231 באזורים המופחתים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. שאר מתח על פני השטח בעת החלת hHFC. מאמץ הגזירה על עליות השטח באופן ליניארי עם קצב זרימת הזרקה הפנימי. הנקודה הגבוהה ביותר הגזירה נמצאת בין שני הפתחים פנימיים (הבלעה ימנית תחתונה), שבו נוזל העיבוד מוגבל (קווי זרימה אדומה, הבלעה שמאלית עליונה). ממדי הצמצם ששמשו במודל הסופי, האלמנט הם 200, 100, 100 ו -200 מיקרומטר עבור i1, i2, a1ו- A2, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מצבי הפעלת איור 6. של פלטפורמת MFP לבצע תא הסרת דפוסים. (א) סכמטי של נתיב הזרימה עבור דפוסי תוסף ידי תמוגה תא. לשם פשטות, רק אחד מכל נתיבי הזרקה ותזרים שאיפה מוצג. המזרקים מלאים באמצעות שסתום ניקוז המשאבות. i1 ו- i2 משמשים להזרקת חיץ מיצוי NaOH, בהתאמה. (ב) סכמטי של נתיב הזרימה להתאוששות lysate. נתיב הזרימה זו מופעלת לאחר איסוף lysate תא לניתוח באמצעות נתיב הזרימה ב (א). אנא Click כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. ניתוח במורד הזרם של דנ"א lysate התא באמצעות qPCR. (א) מגרשים הגברה של ה- DNA lysate מופק 5 עקבות (5 FP) ו -1 טביעת הרגל (1 FP). בקרות חולצו לאחר איסוף lysate עבור בשני המקרים. (ב) ממיסים עקומות של דנ"א מוגבר מן lysate מראה את האיכות של ה- DNA חילוץ. qPCR בוצע (N = 2, n = 3) כדי להגביר את גן β-יקטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור S1. תמונה מותאמת של עיצוב ערוץ ראש MFP 6 ערוציםערוצים המשמשים בניסויי דפוסים. ביצוע hHFC הם 200, 100, 100, 200 מיקרומטר רחב, ו 100 מיקרומטר עמוקים. שני הערוצים החיצוניים, אשר לחדש נוזל טבילה הם 500 מיקרומטר רחב ו 100 מיקרומטר עמוקים. קובץ GDS עבור אותו העיצוב סופק בתור משלים למאמר זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול צדדי עבור דפוסי התוסף של monolayers תא, המאפשרים לדור מהיר של תבניות תא מוגדרות מרחבית. תמוגה סלקטיבי של monolayers התא מתבצעת באמצעות NaOH בעוד נוזל עיבוד hHFC. NaOH מידה denatures החלבונים הכלולים קרום התא. אנו ממליצים על שימוש של ריכוז 50 מ"מ של NaOH כדי להבטיח עיבוד במורד הזרם של lysate. ריכוז זה יכול להיות מוגבר להסרת תאים מהירים יותר, העיבוד במורד זרם lysate שסופק אינו אובייקטיבי. HHFC מבטיח כי בסביבותיה לא מעובדים של monolayer תא נותרות בעינן וזמינים גם הרחבת דפוס או חיטוט נכסים נוספים של התאים.

שיעור הסרת תאים היא פונקציה של שני בכימיה גזירה שהציג את הזרימה. אנחנו בוחרים טווח הפעלה של ספיקות יש הסרת תאי כימיה דומיננטית. מהירויות סריקה של 10 - 20 & #181; מ '/ שני באמצעות קצב זרימת הזרקת NaOH של 6 - 8 μl / min משמש כדי להקל דפוסי תוסף' מהירים '. הקצב המהיר של הסרת תאים כמה כתובות אתגרים העומדים בפני דפוס משטח דפוסים מבוססי גישות ^20,21. שיטות אלו דורשים מנגנון שמגביל את הצמיחה של תאים באזורים המוגדרים מרחבית, למשל, על ידי בתצהיר סלקטיבית של חלבונים הידבקות התא באמצעות הדפסה מיקרו מגע וזריעה הבאות של תאים כדי להשיג את התבנית. הם מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה ודורשים כמה צעדים רציפים עבור דור דפוס וכן חותמת / סטנסיל חדשה עבור כל תבנית. השיטה המתוארת אינה דורשת צמיחה סלקטיבית של תאים על אזורים מוגדרים, מתגברת מספר מגבלות על ידי ביצוע דפוסי תוסף בניגוד הדפסה, בעוד שאינה דורש כל טיפול נוסף של מצע תרבית תאים.

עם הפרוטוקול המתואר במאמר זה, התפוקה של monolayers תא דפוסיםהוא גדל, תוך קבלת משוב חזותי מיידי של הדפוס שנוצר. זה הופך לפשוט שינוי בזמן אמת של תבניות. שליטה כזו תהיה חיונית תרחישים בהם כדאיות התא על משטח נתון אינה הומוגנית. יתרון נוסף של השיטה הוא אותו הראש והכימיה יכולים לשמש כדי ליצור דפוסים מרובים, ובכך להפחית את מספר הצעדים המעורבים ביצירת monolayer תא בדוגמת.

הממדים של הערוצים בראש גיאומטרית הראש וניתן לשנותם בהתאם לדרישות של היישום, ובכך מאפשרים שליטה על ההחלטה של ​​הדפוסים. כל הניסויים בעבודה הנוכחית בוצעו באמצעות ראש MFP עם ממדי צמצם קבועים, במיוחד עם פתחים פנימיים ב 100 × 100 מיקרומטר ו פתחים חיצוניים ב 200 × 100 מיקרומטר. עיצוב זה עם פתחים חיצוניים גדולים נבחר על מנת להבטיח פעולה רציפה של hHFC מבלי לסתום של הפתחים ידיפסולת תא תועה. בדקנו ראשים עם ממדי צמצם פנימיים 50 × 50 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר רווחים ביניהם, עם תוצאות מוצלחות הסרת תאים. השתמש פתחים קטנים, עד 10 × 10 מיקרומטר עם 10 מיקרומטר מרווחים, ותאפשר דרוגים לגודל טביעת רגל קטן יותר (~ 30 × 30 מיקרומטר), ובכך לאפשר רזולוציה גבוהה דפוסים. צפינו ונושאים תפעוליים עם צמצם בגדלים קטן יותר מ -10 מיקרומטר עקב סתימה מ וחלקיקים. בגלל קשיים תפעוליים כגון, 100 מיקרומטר הוא הגבול הנוכחי של רזולוציה ולכן מגבלה של הטכניקה המתוארת. עם זאת, אנו יכולים לתת מענה זה באמצעות היכולת בעיצוב הנוזלית של hHFC. אנחנו הוכחנו כי ההחלטה של הסרת תאים יכולה להיות מכוונת עבור קבוצת נתונה של ממדי צמצם ידי השליטה ש _I2 / Q _{ט '1} (איור 4 ב) ופער איפקס אל מצע ^10,14. השלבים המשמשים העבודה הנוכחית יש גודל צעד מינימאלי של 100 ננומטר.שילוב של פרמטרים לשליטה אלה יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית של הסרת תאים במונחים של גודל טביעת הרגל ומרחק סריקה.

אם שיתוף תרבויות בדוגמת הם רצויים כדי לחקור אינטראקציות תאי תאים ספציפיות בין סוגי תאים שונים, זריעת רציפי דפוסים יכולים להתבצע באמצעות הפרוטוקול המתואר. לבסוף, DNA amplifiable באיכות גבוהה ניתן להשיג מן lysate, כפי שבאו לידי ביטוי על ידי השיא היחיד ב- DNA להמס עקומה (ראה איור 7). הערכנו כמות ה- DNA של כ -1.6 ng מן טביעת רגל אחת (כ -300 תאים) באמצעות qPCR, מקורב הציפייה תיאורטית (6-8 pg / תא). דבר זה מצביע על כמות ה- DNA החילוץ המתאים מספר תהליכים במורד תוך שלילת שימוש בכל שיטות בידוד DNA. זה פותח אפיקי DNA-ניתוח מקומי מבוסס חיטוט של תאים בתרבית. היכולת של hHFC לעצב נוזלים יכול לשמש גם להפקיד תאים וחלבונים חיו על acמשטחי tivated, אשר בשילוב עם דפוסי התוסף ושיתוף culturing הרציף שהוצגו בפרוטוקול זה מאפשר יצירת דפוסי תא ותא-מטריצה ​​מורכבים על מצעי תרבות. הרבגוניות ואת השליטה המתאפשרת על ידי דפוסי תוסף מבוססים hHFC של monolayers תא ואת האפשרות של ביצוע ניתוח דנ"א על ​​תאי חילוץ, מספק כלי חדש ורב עצמה מוגדרת ביולוגים לבצע מחקרים שכללו אינטראקציות תא נפתרו מרחבית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Microfluidic Probe (MFP)			Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers	ThermoFisher scientific, USA	154461	2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume
Chemicals and cell lines
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B	SigmaAldrich chemicals, USA	S5881, 252859,  E9884, R6626	Chemicals used for processing and shielding liquids
Proteinase K	Qiagen, Germany	19131	protease to digest denatuired proteins
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Switzerland		Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.
DNA away	ThermoFisher scientific, USA	7010	Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement	ThermoFisher scientific, USA	10566-016	Culturing medium for epithelial cells.
CellTracker Green CMFDA dye	ThermoFisher scientific, USA	C7025	Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.
CellTracker Orange CMRA dye	ThermoFisher scientific, USA	C34551
β-actin genomic primers for qPCR	Integrated DNA technologies, USA		Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.
MCF7 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-22	Cell lines used to produce co-cultures.
MDA-MB-231 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-26
Equipment and fluidic connections
Motorized high precision stages	Custom machined components.  Linear axis motors from LANG GmBH, Germany	Customized linear axis stages from LT series	3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.
Syringes	Hamilton, Switzerland	1700 TLLX series	Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range.
Nemesys low pressure syringe pumps	cetoni GmbH, Germany		Component of pumping station.
Circular M1-connector	Dolomite microfluidics, United Kingdom	3000051	Interface between vias in MFP head and tubing
Tilt/rotation stage Goniometer	OptoSigma, USA	KKD-25C	Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex
DS Fi2 HD color camera (CCD)	Nikon, Switzerland		Controlled using DS-U3 controller unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Germany		Stage control software.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Germany		Pump control software.
NIS Elements	Nikon, Switzerland		Basic research module for image acquisition and analysis.