Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

Resumen

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Resumen

La sonda de microfluidos (MFP) facilita la realización de la química local, sobre sustratos biológicos mediante el confinamiento de los volúmenes de nanolitros de líquidos. El uso de una implementación particular de la MFP, la jerárquica confinamiento flujo hidrodinámico (hHFC), múltiples líquidos son presentadas simultáneamente en contacto con un sustrato. acción química local y la conformación de líquido utilizando el hHFC, es explotada para crear patrones de células por lisis y la eliminación de las células a nivel local. Mediante la utilización de la capacidad de barrido de la MFP, se crean patrones definidos por el usuario de las monocapas de células. Este protocolo permite una rápida, en tiempo real y los patrones de células espacialmente controlada, lo que puede permitir selectiva célula-célula y célula-matriz estudios de interacción.

Introducción

En su ambiente nativo, las células en los tejidos biológicos perciben una gama de señales bioquímicas y físicas que dirigen su crecimiento, la organización, y el desarrollo. La comprensión de estas señales requiere una investigación selectiva de las interacciones célula-célula y célula-matriz. Para ello es necesario el desarrollo de métodos para monocapas de células patrón. Métodos para diferentes tipos de células en cultivo geométricamente separadas (patrón) permitan amplios estudios de las señales físicas y químicas de la biología celular. La mayoría de los enfoques actuales para capas de células patrón ^1-4 dependen de depósito de proteínas de adhesión celular en las superficies o el uso de plantillas microfabricados para el crecimiento selectivo en sustratos. Por el contrario, aquí se presenta un método para rápidamente monocapas de células patrón in situ, es decir, las células en cultivo, mediante la eliminación de las células en las regiones seleccionadas de la monocapa. Métodos que realizan tales sustractiva patrón ^{5 - 9} usuaLLY requieren sustratos especializados, tratamiento de superficies, operación compleja, contacto físico o ablación mediante un láser, lo que afecta de forma inadvertida las células vivas. Aquí se utiliza una sonda de microfluidos (MFP) ^10,11, una tecnología microfluídica de exploración sin contacto que confina hidrodinámicamente un líquido sobre un substrato. Un componente importante de la impresora multifunción es la cabeza microfabricado que contiene microcanales (Figura 1). La plataforma asociado consiste en bombas de jeringa para el control de líquido, las etapas para la digitalización de control y un microscopio invertido para la visualización y la retroalimentación (Figura 2). En su configuración básica, la cabeza impresora multifunción comprende dos microcanales con aberturas en el ápice, uno para la inyección de un líquido de procesamiento y el otro para aspirar el líquido de procesamiento se inyecta junto con algo de líquido de inmersión (Figura 3A). Durante el funcionamiento MFP, el vértice se encuentra a una distancia fija del sustrato. Cuando la tasa de flujo de aspiración (Qa) es sufficiently más alta que la tasa de flujo de inyección (Q _i), es decir, _una Q: Q _i ≥ 2,5, el líquido de procesamiento se limita en el sustrato. Esto resulta en un confinamiento flujo hidrodinámico (HFC). La región en la que el líquido de procesamiento se encuentra en contacto directo con el sustrato se denomina la huella. Para condiciones típicas de operación, el flujo del líquido de procesamiento dentro de la HFC se caracteriza por un bajo número de Reynolds (Re ≈ 10 ^-2) y un alto número de Péclet (Pe ≈ 10 ^2). Esto implica el líquido fluye en régimen laminar con convección siendo el principal modo de transferencia de masa de las especies químicas. Los modelos numéricos y analíticos para el confinamiento de flujo se describen en otro ^{12 - 14.}

En este trabajo, utilizamos el método de confinamiento simultáneamente varios líquidos de procesamiento, que se llama HFC jerárquica (hHFC) ^14. Para implementar hHFC con la impresora multifunción, dos additionaSe necesitan l aberturas para proporcionar una fuente secundaria de inyección y aspiración. Esto nos permite confinar un líquido en un segundo líquido. Los beneficios internos (procesamiento) de líquido de protección que impide que los desechos parásita en el sustrato por el líquido (blindaje) externa. Además, hHFC permite el funcionamiento en dos modos: (i) el modo de anidado, en el que el líquido de procesamiento en el HFC contactos internos con la superficie (Figura 3B), y (ii) el modo de pinzamiento, en la que el líquido interior pierde el contacto y sólo el líquido exterior está en contacto con el sustrato (Figura 3C). El cambio entre los dos modos permite a los usuarios efectuar o detener el procesamiento del sustrato y se consigue controlando la distancia de la cabeza a la superficie o cambiando la relación entre los flujos de inyección (Q _I2 / _I1 Q). Para una geometría de canal dado, la huella del líquido de procesamiento en el sustrato puede ser controlada mediante la modulación de las condiciones de flujo (Figura 3D). hidr de sodioóxido (NaOH) se utiliza como el líquido de procesamiento interno para lisar las células, y el lisado se aspira continuamente a partir de la superficie. Debido a los efectos químicos de el líquido de procesamiento se localizan en la huella de HFC interior, las células adyacentes se mantienen imperturbables, que permite estudios espacio-temporales de las interacciones célula-célula. La funcionalidad de exploración de la MFP permite la creación de geometrías definidas por el usuario de los patrones de células (Figura 4). Además, la elección de NaOH como líquido de procesamiento con capacidad de análisis de ADN aguas abajo (Figura 7).

Protocolo

1. Cabeza MFP y la Plataforma de limpieza y preparación

NOTA: Este protocolo utiliza híbrido de silicio de cristal orientada verticalmente MFP dirige ^15,16. El componente de silicio de la cabeza contiene los microcanales, que son grabado a una profundidad de 100 m. El silicio grabado está unido al vidrio usando unión anódica. El diseño de canal comprende un patrón que consta de seis canales, dos de cada uno para la inyección y aspiración, y dos para inyectar el líquido de inmersión (Figura 1). Los canales utilizados para la inyección de líquido de inmersión reponer los medios de comunicación que rodea a la muestra biológica, evitando así las pérdidas debido a la aspiración y la evaporación. Los canales interiores y exteriores canales utilizados en el presente trabajo son 100 × 100 micras y 200 x 100 micras, respectivamente. Se obtienen fabricación y el procesamiento posterior, la cabeza de la impresora multifunción con canales claros y pulidos vértices.

1. Preparación de la estación de bombeo y manipulación de fluidosaparato
   1. Utilice capilares con un 1/16 '' (1,59 mm) de diámetro exterior y 0,02 '' (0,51 mm) de diámetro interior para todos los tubos conectados a las jeringas. Variar el tamaño capilar basado en la aplicación y obtener los conectores y adaptadores correspondientes para interconectar la cabeza impresora multifunción con las jeringas. Use agua ultrapura donde diluciones son necesarios.
   2. jeringas limpias (250 - 500 l de volumen) y jeringas émbolos por sonicación en solución de cloro al 0,5% en agua ultrapura To- antes y posteriores experimentos en células vivas. Enjuague bien con agua. Rellenar con agua mediante la inmersión de las puntas por completo en un baño de agua y aspiración mediante el émbolo. Purgar el líquido mientras en el baño de agua con el eje de la jeringuilla en contacto con el sello en la salida de la jeringa. Repita aspirar y purga hasta que no queden burbujas de aire se observan en las columnas de jeringa.
   3. Conectar jeringas llenas de las bombas de jeringa utilizando conectores Luer-lock. Utilice una válvula de interruptor montado en elbombas para dirigir el líquido de la jeringa a una de dos capilares que conducen bien a la cabeza MFP o para los depósitos de líquido (Figura 6). (Si no hay válvula de conmutación está disponible véase la sección 1.4.4). Purgar dos capilares con agua desde las jeringas a una velocidad de flujo de aproximadamente 10 - 50 l / min, dependiendo del tamaño de la jeringa hasta aproximadamente 10 l de agua se deja en las jeringas.
   4. Pre-insertar los capilares purgados en un conector de microfluidos / adaptador apropiado que interconecta con las vías de canal en la cabeza (por ejemplo, conector M1 - ver materiales).
2. Preparación de la cabeza impresora multifunción
   1. Limpiar el cabezal de MFP por sonicación usando un detergente para la limpieza de vidrio estándar o 0,5% de lejía para la limpieza rigurosa, por 5 min. Purgar canales con agua mediante la inmersión de la punta en agua y aplicando vacío a las vías.
   2. Inspeccionar los canales bajo un microscopio estereoscópico para las obstrucciones potenciales (obstrucción) y rerepita el paso anterior si es necesario.
   3. Montar la cabeza limpia en el soporte de cabeza y atornillar el conector con el tubo de pre-insertado y purgado en la cabeza. Enroscar el soporte de la cabeza a la Z-etapa, que se utiliza para el control de distancia de separación entre la cabeza y la monocapa de células.
3. Calibración de las etapas de exploración de la plataforma MFP
   1. Realizar la calibración de punto final de la X, Y y Z etapas antes de conectar la cabeza a la plataforma, de acuerdo con el protocolo del fabricante, con una interfaz de software apropiado. etapas calibrados asegurar la precisión en el posicionamiento de la cabeza impresora multifunción.
   2. Obtener una distancia crudo cero brecha (puesta a cero) llevando la cabeza impresora multifunción sobre un portaobjetos de cámara sin células y descender lentamente dentro de 5 micras pasos. Tras el contacto de la sonda con el sustrato, se deben observar los anillos de Newton. Esta es una estimación aproximada. Una posición precisa se ha de obtener después de ajustar coplanaridad del ápice de la sonda al substratmi.
   3. Para garantizar la coplanaridad del ápice de la sonda, ajustar la inclinación de la cabeza utilizando un goniómetro (en la interfaz de la cabeza y la etapa Z). Cuando se forman asegurar que los anillos de Newton son simétricas (Figura 1). Mueva el MFP micras cabeza 20 lejos del sustrato y ajustar la inclinación utilizando el goniómetro. Repita el descenso, puesta a cero y ajuste de inclinación hasta los anillos de Newton son simétricas en contacto. Con la inclinación ajustada, ajustar la posición z que produce anillos de Newton simétricas como cero.
      NOTA: El Z-etapa controla la distancia de la cabeza a sustrato, mientras que la fase XY controla el escaneo del sustrato (Figura 2). Una explicación detallada se puede encontrar en nuestro trabajo anterior ^14.
4. Productos químicos para la extirpación local de las capas de células
   Precaución: Cuando, equipo de seguridad el uso apropiado (por ejemplo, guantes de nitrilo, gafas de seguridad) para los productos químicos que se prepara. Use un hoo humosd si es necesario para la preparación de soluciones. Preparar todos los productos químicos y tampones con agua ultrapura como diluyente.
   1. Preparar una solución de NaOH 50 mM como el líquido de procesamiento para el canal de inyección interior (i2 con _I2 flujo Q en la figura 1).
   2. Preparar la solución tampón de extracción requerida para la inyección exterior (i1 con _I1 flujo Q en la figura 1), compuesto de 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5% de Tween 20, y 10 mM de rodamina B en Tris 50 mM (hidroximetil) aminometano en pH 8. Para la purga, el uso del agua en las jeringas de aspiración.
   3. Filtrar todas las soluciones utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micras. Degas todas las soluciones filtradas utilizando un desecador hasta la parada de aire disuelto burbujeando a la superficie.
   4. El uso de la línea de drenaje conectado a las bombas de jeringa, purgar el agua remanente y aspirar las soluciones desgasificados en las jeringas de inyección a 40 l / min hasta que las jeringas están llenos (250 o 500 l).Esto asegura el llenado sin burbujas de las jeringas, los conectores y los capilares. El sistema de válvula de dos-capilar jeringa-interruptor permite el llenado de las jeringas mediados de experimento. En ausencia de una válvula de conmutación tal, desconectar los capilares de la cabeza y llenar los capilares y la jeringa mediante la aspiración de las soluciones desgasificados antes de volver a conectar a la cabeza.
   5. Aspirar el procesamiento y el blindaje líquidos a través de los capilares permite el uso de pequeños volúmenes durante la operación. Si los productos químicos se pueden preparar en grandes volúmenes, llenar jeringas con las soluciones requeridas directamente. Por ejemplo, las jeringas de aspiración que contienen agua pueden ser llenados utilizando este enfoque.
   6. Purgar los capilares de la cabeza impresora multifunción con los líquidos asignados para cada canal como se define en 1.4.1 y 1.4.2.
      NOTA: La solución tampón de extracción protege el NaOH en el confinamiento interno y el componente de rodamina en el tampón facilita la visualización de THe hHFC durante el funcionamiento.
   7. Si las células están sobre-confluentes, con agregados de células que aparecen en la superficie cultivada, complementar el tampón de extracción con 10% de proteinasa K. Esto complementa la acción de NaOH en estos agregados mediante la disolución de proteínas desnaturalizadas como el lisado entra en los canales de aspiración. Esto evita la obstrucción de los canales durante el funcionamiento.
5. Preparación de monocapas de células en portaobjetos de cámara
   Precaución: Utilice una campana de cultivo de células para cultivar las células y manejar el equipo conforme a las regulaciones establecidas por el funcionario de bioseguridad del laboratorio. Tenga en cuenta los requisitos especiales de las líneas celulares específicas y adaptar el protocolo y el equipo en consecuencia.
   1. Incubadoras de cultivo celular (uso de 5% de _CO2 y 37 ºC a) para el cultivo y la expansión de las células para tomar como modelo. Realizar la expansión a través de protocolos estándar de cultivo celular en frascos T ^17,18. Utilizar medios cultivar según los requisitos específicos del cell línea (por ejemplo, suero y antibiótico DMEM suplementado para el cultivo de MCF7 y MDAMB 231).
   2. Al llegar a la confluencia celular en los frascos de cultivo, trypsinize y recoger las células y semillas de 2 × 10 ⁵ células / cm ² en cada una de las diapositivas 2-cámara para el patrón y la cultura durante 48 hr. Usar las células en una de las cámaras como un control para el crecimiento celular y la viabilidad.
   3. Al llegar a la confluencia celular sobre los portaobjetos de cámara, incubar las células durante 45 min con 500 solución de tinte de células-tracker l (por ejemplo, verde - CMFDA o naranja - CMRA) a una concentración de 10 mM preparado en medio libre de suero. Esto se hace para la visualización celular durante patrones. Se lavan las células marcadas con PBS mediante el lavado con cuidado cada cámara usando una pipeta, y, posteriormente, cultivar las células en medios suplementados con suero para los experimentos de modelado.
   4. Obtener una imagen de referencia de la superficie celular de células-tracker manchados con el propósito de recuento de células. Esto se hace para asegurarconfluencia de la capa de células. Además, sirve como una ayuda para los experimentos de cuantificación si la recuperación de la muestra y el análisis de ADN son objetivos.
      NOTA: En caso de que la viabilidad celular se ha de evaluar durante el modelado, las células se pueden teñir con un kit de citotoxicidad Live / Dead de conformidad con las instrucciones del fabricante.

2. Creación de la hidrodinámica de flujo Confinamiento jerárquica (hHFC)

1. Mueva el MFP sobre la monocapa de células a una distancia de separación de 50 micras desde el portaobjetos de vidrio. Esta distancia de separación al tiempo que garantiza el contacto de la hHFC también da cuenta de la superficie monocapa y la variación de espesor.
2. Inyectar NaOH a 6 u 8 l / min a través de i2. Evaluar otras velocidades de flujo (es decir, Q _I1, Q y Q _{A1 A2)} utilizando las reglas de flujo en la Figura 3.
3. Modular el tamaño de la HFC interior cambiando la relación de Q _I2 / _I1 Q usando las jeringas de inyección.Por ejemplo, usar un Q _I1 entre 1,3 l / min y 4 l / min, con la Q _I2 fija en 8 l / min, lo que resulta en una huella de NaOH de 150 - 300 células (100 - 200 micras ² / célula) ( Figura 3D).
4. Inyectar medio completo a partir de los más exterior aberturas en la cabeza MFP a un caudal de 20 l / min para dar cuenta de la evaporación de los medios de comunicación y aspiración durante el funcionamiento de la hHFC.

3. Uso de las monocapas de células Patterning hHFC

Nota: El patrón de exploración determina las áreas de la monocapa de células, donde se extraen las células (patrón de sustracción), dejando las células restantes para estudiar cuestiones biológicas específicas. Este patrón puede ser líneas rectas o una matriz de puntos, por ejemplo. patrones complejos requieren el diseño de una trayectoria de exploración adecuada. Por ejemplo, una trayectoria de exploración a cuadros proporciona una cuadrícula de áreas de células (se muestra por ejemplo en la figura 4A ), lo que permitiría estudiar el efecto de diferentes estímulos en las células en diferentes plazas mientras se está en estrecha proximidad. Estos patrones se pueden crear utilizando el control de las etapas XY de la plataforma, donde el software de control permite scripting de las trayectorias de exploración para la cabeza MFP sobre la monocapa de células.

1. Ajuste el software etapa de escanear la cabeza de la sonda a través de la monocapa de células en los patrones definidos por el usuario (mediante el establecimiento de X, Y y Z) a una velocidad de exploración de 10 micras / s en una distancia de separación de 50 micras.
2. Con el anidado hHFC en funcionamiento y en contacto con la monocapa, escanear el MFP con una trayectoria de el patrón deseado para efectuar la eliminación de células con patrón.
3. Para un co-cultivo después de la primera retirada tipo de células, la semilla de una línea de células diferentes para llenar los vacíos, utilizando los métodos descritos en la sección 1.5. Cambiar entre los modos anidados y pinzados (al aumentar la distancia de separación, por ejemplo) para controlar la eliminación de células.
   NOTA: La velocidad de exploración puede tener que ser investicerrada para otras líneas celulares. La velocidad de exploración se utiliza en esta efectos de demostración de eliminación de células total sobre las regiones exploradas para las líneas celulares utilizadas.

4. la elaboración secundaria de Muestreo y de amplificación de ADN

1. Preparar la estación de muestreo para el análisis de aguas abajo del lisado. Para la estación de muestreo, utilice un 3D impreso 8-tira de soporte del tubo de PCR. Alternativamente, elegir un soporte de tubo apropiado para servir como este adaptador, que es capaz de ser montado dentro del rango de barrido de la cabeza fuera del sustrato. Limpiar el soporte del tubo con 70% de etanol o de otros descontaminantes de superficie en función de la severidad deseada para la aplicación. Use un clip magnético del soporte de tubo para fijarlo en el soporte de sustrato.
2. Después de preparar la estación de muestreo, la posición de la cabeza impresora multifunción 100 micras de la monocapa. Comenzar a utilizar el hHFC con solución de NaOH 50 mM como el líquido de procesamiento para el canal de inyección interior con velocidades de flujo de 1, 6, -7 Y -17.5 l / min para Q _{I1, I2} Q, Q _A1 y _​​A2 Q, respectivamente.
   1. Una vez que el régimen de flujo se ha estabilizado (en aproximadamente 10 segundos), descender por la cabeza de la sonda a una distancia de separación de 50 micras para llevar a cabo la lisis local basada NaOH de la subpoblación de células elegido con el hHFC. Una vez que la lisis de la subpoblación es completa (aproximadamente 30 segundos por huella), dirigir la cabeza hacia los tubos en la estación de muestreo. Expulsar el lisado recogido en los tubos de PCR directa (Figura 6).
3. Para el procesamiento aguas abajo del lisado, neutralizar primero el pH de la solución mezclando el lisado con tampón Tris (1: 1). Después de la neutralización, calentar el lisado a 95 ºC durante 30 min. A continuación, cargue directamente el lisado en un flujo de trabajo estándar establecido por qPCR como proveedor del instrumento.

Resultados

El protocolo descrito para la rápida patrón de sustracción de monocapas de células se demuestra el uso de una plataforma de múltiples componente MFP (Figuras 1 y 2). El protocolo emplea el confinamiento jerárquica flujo hidrodinámico (hHFC; Figura 3) para tratar localmente y eliminar las células de monocapas de células, utilizando NaOH como el líquido de procesamiento. La configuración hHFC comprende un HFC interior y una exterior HFC. El NaOH confinado en el interior hHFC introduce la acción química y cortante en las células en contacto. Dentro de esta huella, las células se homogéneamente expuestos a la acción química de NaOH, debido a la convección impulsada transferencia de masa dentro y con difusión despreciable a la región fuera del confinamiento. La cizalla sobre las células, por otra parte, se puede alterar variando la velocidad de flujo de NaOH. Para simplificar los parámetros de funcionamiento, se optó por realizar la acción química del mecanismo dominante de la eliminación de células en comparación con el esfuerzo cortante. Aestimar la fuerza de corte aplicada por el hHFC en la superficie, un modelo de elementos finitos se construyó utilizando COMSOL 5.0. Las simulaciones se realizaron utilizando el módulo CFD para flujos laminares. Dos condiciones de frontera de entrada a las aberturas de inyección de la geometría y las dos condiciones de contorno de salida a las aberturas de aspiración (Figura 5) se aplicaron para la gama de caudales y dimensiones del hueco utilizados en la manifestación actual. En el modelo obtenido, las reglas de flujo de dictadas el perfil de cizalladura, mientras que las velocidades de flujo definen la magnitud de la fuerza cortante en la superficie. En la práctica, una combinación de ambos determina si el hHFC contacto con la superficie. Mantener estos factores en mente, nos dispusimos a encontrar una amplia gama de caudales de funcionamiento con el fin de obtener la eliminación de células químicamente dominante. Para crear un hHFC, usamos la regla de flujo de una aspiración total a la relación de caudal de inyección de 3,5. Se definieron las otras reglas de flujo utilizados para minimizar la obstrucción dentro de los canales de aspiración,que puede ser causada por las proteínas desnaturalizadas que se pegan a las superficies de los canales. Usando el modelo desarrollado, encontramos tasas de flujo desde 5 hasta 10 l / min de traslación a un esfuerzo cortante entre 1 y 3 N / m ^2. Sin el efecto químico de NaOH, por ejemplo en el caso del tampón de extracción, el esfuerzo cortante no sería lo suficientemente alta para eliminar las células ^19. Dentro del rango observado, observamos que la operación a velocidades de flujo más altas es más práctico debido a las perturbaciones en la trayectoria de flujo a velocidades de flujo de aspiración bajo (es decir, Q _I2 <4 l / min) debido a los residuos celulares en los canales.

Teniendo en cuenta el perfil de cizalladura estudiado y consideraciones prácticas, los caudales de NaOH (Q _I2) de 6 y 8 l / min se utilizan para los experimentos de modelado y Q _I1, Q _A1 y ​​Q _A2 de acuerdo con las reglas de flujo mostrados en la Figura 3. La proporción de los flujos de inyección (Q _I2 / _I1 Q) permite us para modular aún más el tamaño de la huella hHFC (Figura 3D y Figura 4B), con el principio subyacente elaborado por Autebert et al. ^14. El uso de la capacidad líquida de conformación de la hHFC junto con la capacidad de escaneado de alta resolución de la plataforma MFP, se demuestra la generación de rejilla de células vivas en múltiples escalas y mostrar, además, la aplicación del protocolo dado en el desarrollo de cultivos conjuntos (Figura 4C).

La plataforma también nos permite realizar la recuperación de lisado de muestras para análisis de aguas abajo. Para mostrar la calidad del lisado obtenido, probamos células lisadas localmente a partir de uno y cinco huellas en dos experimentos independientes, mostrando la variación en la cantidad de ADN obtenido a partir del lisado (Figura 7). Aquí, hemos amplificado de ADN contenidas en el lisado utilizando cebadores ß-actina (adelante: GGATGCAGAAGGAGATCACT e inversa: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Usando 4 l de lisado neutralizado en cada reacción PCR.

Figura 1. Los módulos de la plataforma MFP y la cabeza. (A) Los módulos operativos de la plataforma comprenden jeringas, platinas motorizadas y un controlador motorizados. El MFP está conectado a una Z-etapa motorizado para controlar la distancia de separación entre la cabeza y el sustrato, y el soporte de sustrato se une a la X e etapas motorizadas-Y que constituyen el sistema de exploración. (B) La cabeza impresora multifunción tiene vías de fluidos para conectar la estación de bombeo, los agujeros de montaje para montar la cabeza sobre el Z-etapa, y canales que sale del vértice pulido. El vértice se establece coplanar al sustrato de cultivo de células. los anillos de Newton simétrica se pueden observar cuando el vértice y el sustrato son coplanares y en contacto. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Plataforma de MFP. La plataforma de barrido de alta resolución está equipado con un soporte del cabezal de mecanizado de interfaz con el Z-etapa de alta precisión motorizados. El soporte de sustrato está conectado a la etapa de XY para fines de exploración. Para la recuperación del lisado para el análisis de aguas abajo, una estación de muestreo 3D impreso se sujeta magnéticamente hacia un lado del soporte de sustrato (que se muestra en el recuadro). Las bombas de jeringa, un microscopio invertido, controladores y pantallas están situadas alrededor de la plataforma. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. confinamiento jerárquica flujo hidrodinámico (hHFC) para el control espacial y temporal de la eliminación de células. (A) Representación esquemática de un único HFC. (B) Anidado y (C) el modo de operación pellizcado hHFC. (D) La imagen de la huella de dos relaciones de flujo de inyección / aspiración diferentes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Patrones de monocapas de células usando la impresora multifunción. (A) la generación de la célula de la red en los escaneos programados de la impresora multifunción en una monocapa de células MDA-MB-231. Las células se tiñeron con el tinte de células-tracker verde. (B) La huella de las diferentes relaciones de inyección (n) En una monocapa de células MCF7. El esquema muestra la variación esperada en la forma de la HFC interior con un cambio en n. (C) con dibujos de co-cultivo de los patrones de sustracción de MCF7 monocapa seguido de la siembra de células MDA-MB-231 en las regiones restados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. El esfuerzo cortante en la superficie cuando se aplica hHFC. El esfuerzo de cizallamiento en la superficie aumenta linealmente con la tasa de flujo de inyección interior. El punto más alto cizallamiento se encuentra entre las dos aberturas interiores (parte inferior derecha de la inserción), donde está confinado el líquido de procesamiento (líneas de flujo rojo, recuadro superior izquierdo). Las dimensiones de abertura utilizados en el modelo de elementos finitos son 200, 100, 100 y 200 micras para i1, i2, a1y A2, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Modos de funcionamiento de la plataforma MFP para llevar a cabo la eliminación de células y los patrones. (A) Representación esquemática de la trayectoria de flujo para el patrón de sustracción por la lisis celular. Por simplicidad, sólo uno de cada uno de los caminos de inyección y de flujo de aspiración se muestran. Las jeringas se llenan usando la válvula de drenaje en las bombas. i1 e i2 se utilizan para la inyección de tampón de extracción y NaOH, respectivamente. (B) Esquema de la trayectoria de flujo para la recuperación de lisado. Esta trayectoria de flujo se activa después de la recogida de lisado de células para el análisis utilizando la vía de flujo en (A). Por favor CLICk aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Análisis de Aguas abajo de ADN a partir de lisado celular utilizando qPCR. Parcelas (A) de amplificación de ADN en el lisado extraído de 5 huellas (5 FP) y 1 huella (1 fp). Los controles se extrajeron después de la recogida lisado para ambos casos. (B) Derretir curvas de ADN amplificados a partir del lisado que muestra la calidad del ADN extraído. Se realizó qPCR (N = 2, n = 3) para amplificar el gen de la β-actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura S1. Una imagen a escala de diseño de canal para el cabezal de la impresora multifunción de 6 canalesutilizados para experimentos de modelado. Canales que realizan el hHFC son 200, 100, 100, 200 micras de ancho, y 100 micras de profundidad. Los dos canales más exteriores, que reponer líquido de inmersión son 500 micras de ancho y 100 m de profundidad. Un archivo de GDS para el mismo diseño se ha proporcionado como un complemento de este artículo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Se presenta un protocolo versátil para el patrón de sustracción de monocapas celulares que permite la rápida generación de patrones de células espacialmente definidos. lisis selectiva de monocapas de células se lleva a cabo utilizando NaOH como el líquido de procesamiento en el hHFC. El NaOH desnaturaliza instantáneamente las proteínas contenidas en la membrana celular. Se recomienda el uso de la concentración de 50 mM de NaOH para asegurar un procesamiento aguas abajo del lisado. Esta concentración se puede aumentar para la eliminación más rápida de las células, el procesamiento aguas abajo proporcionado lisado no es un objetivo. El hHFC asegura que las áreas circundantes sin procesar de la monocapa de células no se ven afectadas y están disponibles ya sea para ampliar el patrón o de sondeo otras propiedades de las células.

La velocidad de eliminación de células es una función tanto de la química y de cizallamiento presentado por el flujo. Nos elegir un rango de operación de caudales tener la eliminación de células dominante química. velocidades de escaneo 10 - 20 & #181; m / seg usando una tasa de flujo de inyección de NaOH de 6-8 l / min se utilizan para facilitar 'rápido' patrón sustractivo. El rápido ritmo de la eliminación de células aborda algunos de los desafíos que enfrenta la superficie de impresión de patrones enfoques basados ​​en los ^20,21. Estos métodos requieren un mecanismo para limitar el crecimiento de las células en áreas espacialmente definidos, por ejemplo, por deposición selectiva de proteínas de adhesión celular a través de la impresión de micro-contacto y la posterior siembra de las células para obtener el patrón. Están limitados por el bajo rendimiento y requieren varios pasos secuenciales para la generación del patrón, así como una nueva plantilla / sello para cada patrón. El método descrito no requiere el crecimiento selectivo de las células en áreas definidas, y supera varias limitaciones mediante la realización de los patrones de sustracción en contraste con la impresión, mientras que no requiere ningún tratamiento adicional del sustrato de cultivo celular.

Con el protocolo descrito en el presente documento, el rendimiento de monocapas de células patrónse incrementa, mientras que la obtención de retroalimentación visual inmediata del patrón generado. Esto facilita la modificación en tiempo real de los patrones. Tal control podría ser crucial en escenarios en los que la viabilidad celular en una superficie dada no es homogénea. Otra ventaja del método es que el mismo cabezal y la química pueden utilizarse para generar múltiples patrones, reduciendo así el número de pasos implicados en la generación de una monocapa de células patrón.

Las dimensiones de los canales de la cabeza y de la geometría de la cabeza pueden ser escalados de acuerdo con los requisitos de la aplicación, lo que permite el control sobre la resolución de los patrones. Todos los experimentos en el presente trabajo se realizaron con una cabeza impresora multifunción con unas dimensiones de abertura fija, específicamente con las aberturas interiores a 100 × 100 micras y aberturas exteriores a 200 × 100 micras. Este diseño con aberturas exteriores más grandes se eligió para asegurar la operación continua de la hHFC sin obstrucción de las aberturas porrestos celulares perdida. Hemos probado con cabezas dimensiones del hueco interior 50 x 50 micras y 50 micras espaciamiento entre ellos, con resultados exitosos en la eliminación de células. El uso de aberturas más pequeñas, hasta 10 x 10 m con 10 micras separación, permitiría a un tamaño de escala huella más pequeña (~ 30 × 30 m), lo que permite una mayor resolución en la morfogénesis. Hemos observado problemas operativos con una apertura de tamaños menores de 10 micras, debido a la obstrucción de las partículas. Debido a tales dificultades operativas, 100 micras es el límite actual de la resolución y por lo tanto una limitación de la técnica descrita. Sin embargo, podemos hacer frente a esto usando la capacidad de dar forma líquida de la hHFC. Hemos demostrado que la resolución de la eliminación de células puede ser sintonizado para un conjunto dado de dimensiones de abertura mediante el control de Q _I2 / _I1 Q (Figura 4b) y la brecha-ápice a sustrato ^10,14. Las etapas utilizadas en el presente trabajo, tiene un diámetro de paso mínimo de 100 nm.Una combinación de estos parámetros controlables puede mejorar la resolución espacial de la eliminación de células en términos de la tamaño de la huella y de la distancia de exploración.

Si se desean co-cultivos modeladas para estudiar las interacciones célula-célula específicas entre diferentes tipos de células, la siembra secuencial y los patrones se pueden realizar usando el protocolo descrito. Por último, el ADN amplificable de alta calidad se puede obtener a partir del lisado, como es evidente por el pico singular en el ADN se derriten curva (véase la Figura 7). Se evaluó la cantidad de ADN de alrededor de 1,6 ng de una sola huella (alrededor de 300 células) usando qPCR, que está cerca de expectativa teórica (6-8 pg / célula). Esto indica una cantidad de ADN extraído adecuado para varios procesos de acabado mientras obviando el uso de cualquier método de aislamiento de ADN. Esto abre vías para el análisis de ADN basa local de sondeo de las células cultivadas. La capacidad de hHFC para dar forma a los líquidos también puede ser utilizado para depositar las células vivas y las proteínas en activated superficies, que en combinación con el patrón de sustracción y secuencial co-cultivo se presenta en este protocolo permite la creación de patrones de célula y célula-matriz complejos sobre sustratos de cultivo. La versatilidad y el control proporcionado por el patrón de sustracción basado en hHFC de monocapas de células y la posibilidad de realizar el análisis de ADN en las células extraídas, proporciona una nueva y potente herramienta para los biólogos configurar para realizar estudios de resolución espacial que implican interacciones celulares.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Microfluidic Probe (MFP)			Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers	ThermoFisher scientific, USA	154461	2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume
Chemicals and cell lines
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B	SigmaAldrich chemicals, USA	S5881, 252859,  E9884, R6626	Chemicals used for processing and shielding liquids
Proteinase K	Qiagen, Germany	19131	protease to digest denatuired proteins
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Switzerland		Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning.
DNA away	ThermoFisher scientific, USA	7010	Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases.
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement	ThermoFisher scientific, USA	10566-016	Culturing medium for epithelial cells.
CellTracker Green CMFDA dye	ThermoFisher scientific, USA	C7025	Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours.
CellTracker Orange CMRA dye	ThermoFisher scientific, USA	C34551
β-actin genomic primers for qPCR	Integrated DNA technologies, USA		Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR.
MCF7 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-22	Cell lines used to produce co-cultures.
MDA-MB-231 breast carcinoma cells	ATCC, USA	ATCC HTB-26
Equipment and fluidic connections
Motorized high precision stages	Custom machined components.  Linear axis motors from LANG GmBH, Germany	Customized linear axis stages from LT series	3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port.
Syringes	Hamilton, Switzerland	1700 TLLX series	Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range.
Nemesys low pressure syringe pumps	cetoni GmbH, Germany		Component of pumping station.
Circular M1-connector	Dolomite microfluidics, United Kingdom	3000051	Interface between vias in MFP head and tubing
Tilt/rotation stage Goniometer	OptoSigma, USA	KKD-25C	Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex
DS Fi2 HD color camera (CCD)	Nikon, Switzerland		Controlled using DS-U3 controller unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Germany		Stage control software.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Germany		Pump control software.
NIS Elements	Nikon, Switzerland		Basic research module for image acquisition and analysis.