JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نفيدكم إجراء المكرر من كلوريد الحديديك (FeCl 3) نماذج تخثر -induced على الشريان السباتي والمساريقي الشريان وكذلك السياق، تتميز بكفاءة استخدام intravital المجهري لمراقبة الوقت لالكاتمة للتكوين الجلطة الدموية.

Abstract

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introduction

تجلط الدم الشرياني (تجلط الدم) هو اختلاط شائع في العديد من الأمراض الجهازية المرتبطة التهاب مزمن، بما في ذلك تصلب الشرايين والسكري والسمنة والسرطان واضطرابات المناعة الذاتية الروماتيزم المزمنة. وتورط الجلطات التي تحدث في الجذعية الدموية في الشرايين من نشاط الصفائح الدموية غير مناسب، وتجميع وآليات coagulatory اللاحقة، والنوبات القلبية والسكتات الدماغية وفقدان أقصى. جدار الوعاء الدموي هو نظام معقد يتضمن أنواع خلايا متعددة ويتأثر عدد كبير من العوامل الخارجية بما في ذلك إجهاد القص، خلايا الدم، والهرمونات، والسيتوكينات، وكذلك التعبير عن البروتينات المضادة للأكسدة في جدار الوعاء الدموي. وفي التجارب المختبرية لا يمكن نسخ هذه البيئة المعقدة، وبالتالي الدراسات المجراة باستخدام نماذج حيوانية حاسمة للسماح فهم أفضل الآليات التي تشارك في اضطرابات الجلطات.

وقد أظهرت الفئران أن يكون سيمآليات ILAR للبشر من حيث تجلط الدم وتصلب الشرايين، والتهاب 1،2 السكري. وعلاوة على ذلك، المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران يمكن أن تنشأ لاختبار وظيفة من المنتجات جين معين في فيزيولوجي معقدة أو بيئة مرضية. مثل هذه الدراسات تحاكي أمراض البشر ويمكن أن توفر المعلومات الآلية هامة تتعلق اكتشاف مسارات والعلاجات، جديدة، فضلا عن توفر تفاصيل مهمة في وصف آثار المخدرات على تجلط الدم.

تحدث بسبب البطانية إصابة طبقة أو اختلال وظيفي والتعرض للتيار الدم إلى مصفوفة تحت البطانة 3،4 الجلطة الدموية في الشرايين المرضية. وقد وضعت نماذج مختلفة تخثر للحث على هذا الضرر البطانية مثل الإصابة الميكانيكية، وإصابة الأكسدة مقرها ولاية البنغال-مجمع photoreactive روز وإصابة الليزر 5. في هذا الطيف، كلوريد الحديديك (FeCl 3) -induced إصابة الأوعية الدموية هو النموذج المستخدم على نطاق واسع من تجلط الدم. هذا كاشف عندمايطبق على الجانب الخارجي من السفن يدفع الضرر التأكسدي للخلايا الأوعية الدموية 6-8، مع فقدان الحماية الخلايا البطانية من تعميم الصفائح الدموية ومكونات شلال التخثر. نموذج FeCl 3 بسيط وحساس لكلا تخثر ومعاداة الصفائح الدموية المخدرات، وقد تم تنفيذها على الشريان السباتي والشرايين الفخذية، وعروق الوريد، والمساريقي والشرايين والأوردة العضلة المشمرة في الفئران والجرذان والخنازير الغينية والأرانب 6-15.

واحد المعلمة قابلة للقياس في هذا النموذج هو الوقت المنقضي من الاصابة لاستكمال انسداد الأوعية يقاس وقف تدفق الدم مع تدفق متر دوبلر أو تحت الملاحظة المباشرة مع 6،7،9 intravital المجهري. تم الإبلاغ عن مجموعة من الأوقات ما بين 5 إلى 30 دقيقة في دراسات مختلفة في C57Bl6 الفئران 7-10،16، مما يوحي بأن FeCl 3 تركيزات، وأنواع التخدير، والتقنيات الجراحية والعمر الماوس، خلفية الجينومية، وطريقة قياس بتدفق lood، والمتغيرات البيئية الأخرى يكون لها آثار كبيرة في هذا النموذج. هذا التباين واسع يجعل من الصعب المقارنة بين الدراسات من المجموعات البحثية المختلفة وقد جعل الكشف عن الفروق الدقيقة صعوبة.

مع رؤية للحد من هذه المتغيرات، وإقامة قابلة للتكرار بشكل موحد في نظام نموذج الجسم الحي، ولقد صقل نموذج الشريان السباتي -induced FeCl 3 الذي يجعل بيانات استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من الاختلاف 6-10،16-19. في هذه الورقة وصفنا وتبادل المهارات وتقديم تقارير عدة أمثلة تجريبية التمثيلية التي يمكن أن تستفيد من هذا النموذج.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات والتلاعب من الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC) من كليفلاند كلينيك وفقا لسياسة الولايات المتحدة الأمريكية خدمة الصحة العامة لرعاية الرفق بالحيوان واستخدام الحيوانات، ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية و استخدام الحيوانات المختبرية.

1. التحضير:

  1. صبغة الفلورسنت لوصفها الصفائح الدموية
    1. إعداد رودامين حل 6G، و 0.5 ملغم / لتر، في المياه المالحة وتعقيم الحل مع 0.22 ميكرون فلتر.
  2. FeCl 3 الحل
    1. جعل حل الأسهم الطازج من 30٪ FeCl 3 (اللامائية، يساوي 1.85 م) في الماء النقي، وتصفية مع 0.45 ميكرون فلتر. إعداد 5 مل FeCl الطازج 3 الحل في التركيز المطلوب [على سبيل المثال، 2.5٪ (0،154 م)، 5٪ (0،308 م)، 7.5٪ (0.463 م)، 10٪ (0،617 م) و 12.5٪ (0.771 م)] من قبل تمييع 30٪ FeCl 3 حل مع ط المياهغ 6 سم صحن زراعة الأنسجة والحفاظ على الغطاء مغلقا.
      ملاحظة: استخدام طبق ثقافة يجعل من الاسهل لالتقاط ورقة الترشيح المشبعة مع FeCl 3 الحل من لاستلامه من وعاء ضيق، مثل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. FeCl3 غير خطرة للغاية وأن الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات ومختبر معطف الخ، معدات الحماية الشخصية، وينبغي دائما أن تؤخذ.
  3. أوراق الترشيح
    1. قطع ورقة الترشيح إلى 1 ملم × 2 ملم حجم. نقع قطع ما يكفي من ورقة قطع مرشح في حل FeCl 3 في نفس الطبق.
  4. بابافيرين هيدروكلوريد الحل
    1. إعداد بابافيرين هيدروكلوريد حل (25 ملغ / مل) في المياه وتعقيم الحل مع 0.22 ميكرون فلتر.
  5. الاغاروز جل
    1. تحضير هلام الاغاروز 2٪ في برنامج تلفزيوني أو المالحة في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة، ~ 1 سم سماكة، وجحزب التحرير أن نصف دائرة مع ~ 3 سم القطر.

2. FeCl 3 المستحثة السباتي الشرياني إصابة التخثر نموذج

  1. العمليات الجراحية للتخثر نموذج
    1. استخدام 8 - الفئران C57Bl6 12 أسابيع من العمر (أو غيرها من سلالات عند الضرورة). تخدير الفئران مع خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) / زيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكيد عمق التخدير بواسطة معسر أخمص قدميه.
      ملاحظة: هذا المبلغ من الكيتامين / زيلازين كافية للحفاظ على الحيوانات في التخدير مستقر وبدون ألم (استجابة إلى أخمص القدمين معسر) لمدة 1 ساعة على الأقل.
    2. إزالة الفراء على الرقبة وأعلى الصدر مع المقص الكهربائي الحيوانات الصغيرة. كريم مزيل الشعر ليست ضرورية. تطبيق محايد مرهم العين البترول على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
    3. تأمين الماوس في موقف ضعيف على غطاء 15 سم لوحة زراعة الأنسجة. استخدام شريط طويل واحد (~ 10 سم) لتأمين هينأطرافه د والجزء السفلي من الجسم، وقطعتين من الشريط صغيرة (2 سم × 0.5 سم) لتأمين اليدين. استخدام خياطة 4-0 للالتفاف حول القواطع، الشريط طرفي الخيط إلى غطاء للحفاظ على الرقبة الماوس مباشرة (الشكل 2).
    4. وضع لوحة مع رئيس الماوس نحو المشغل تحت مصدر ضوء الجراحية.
    5. تعقيم موقع الجراحة مع لوحة الكحول. استخدام الصغرى أدسون الملقط لعقد الجلد واستخدام مقص جراحي لإجراء شق صغير (2-3 ملم).
    6. عقد الجلد من شق مع ملقط ومقص جراحي إدراج مع اغلاق فكه في شق. دفع مقص تحت الجلد نحو المقبض أو الذقن، ثم فتح المقص لتحرير الجلد من طبقة تحت الجلد.
    7. قطع الجلد مع مقص جراحي لإجراء شق خط الوسط من المقبض إلى مستوى العظم اللامي (الشكل 3A و 3B). بصراحة تشريح اللفافة رقيقة (الخط المنقط، في الشكل 3B) بين الغدد تحت الفك مع مرقئ بخير وملقط غريف (الشكل 3B و 3C، الأسهم الزرقاء).
      ملاحظة: المقبض (السهم الأسود في الشكل 3C) والقصبة الهوائية (تي في الشكل 3C) سيتبين بعد هذه الخطوة.
    8. عقد الأنسجة الرخوة والجلد ينظر في حق المقبض مع ملقط غريف، إدراج مرقئ تحت اللفافة تجاه موقف 2:00 (الخط المنقط الأصفر في الشكل 3C)، فتح فكي مرقئ لتحرير حبل الوريد من الأنسجة المحيطة.
    9. قطع اللفافة والأنسجة الرخوة والجلد تجاه موقف 2:00 (الشكل 3C) مع مقص جراحي لفضح الصحيح الوريد الوداجي (الشكل 3D، السهم).
    10. رسم حول 200-300 ميكرولتر رودامين حل 6G باستخدام حقنة 1 مل مع 22 G إبرة، ثم تغييرل30 G إبرة.
      ملاحظة: هذا يحمي إبرة 30 G من الضرر من طرفها على ما يرام. رسم مباشرة على حل رودامين 6G مع إبرة 30 G لن تضر طرف. ومع ذلك لمس الجدار الحاويات عن طريق الخطأ سوف يسبب الضرر، الأمر الذي قد يجعل من الصعب الحقن.
    11. مسح إبرة 30 G عن طريق دفع ببطء خارجا 6G حل رودامين، تأكد من تبقى جود فقاعات الهواء في حقنة أو إبرة. تبقي 100 ميكرولتر رودامين 6G حل للحقن.
    12. ينحني 2-3 ملم غيض من الإبرة إلى زاوية 90 درجة مع حامل الإبرة، والتي سوف يمنع إدخال الإبرة عميقة جدا من حبل الوريد، ويجعل حقن أكثر سهولة للرقابة (الشكل 3D).
    13. حقن محلول رودامين 6G في الوريد الوداجي الحق في الصفائح الدموية التسمية. لتحقيق الاستقرار في حقنة والحفاظ على إبرة في الموقف، عقد المحاقن مع يد واحدة والإبرة مع ملقط غريف مع جهة أخرى خلال injection.Afحقن ثالثا، المشبك موقع الحقن مع ملقط غريف لتجنب النزيف.
    14. فتح فكي مرقئ وأدخلها تحت ملقط غريف لكبح جدار الوعاء الدموي من موقع الحقن، ثم ligate موقع الحقن مع خياطة 6-0.
      ملاحظة: كبديل للخطوة 2.1.15، تطبيق الضغط على موقع الحقن مع إصبع لمدة 2 دقيقة ووقف النزيف. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له على خطر التسبب في المزيد من النزيف إذا تمت إزالة جلطة في موقع الحقن عن طريق الخطأ.
    15. بصراحة تشريح الأنسجة اللينة ورباط حول الغدة تحت الفك الأيسر مع مرقئ وملقط غريف وسحب الغدة تجاه موقف 7:00 (الشكل 3E) لفضح العضلات القصية الترقوية الخشائية الأيسر (السهم الأزرق في الشكل 3E).
    16. بصراحة تشريح اللفافة (الشكل 3E، الخط المنقط) بين العضلة القصية الترقوية الخشائية اليسار والعضلة اللامية الكتفية أو sternohyالعضلات OID (الشكل 3E، السهم الأخضر) الواقعة إلى الموقع الأيسر من القصبة الهوائية مع مرقئ.
    17. تمرير إبرة مع 6-0 خياطة الحرير (حوالي 15 سم) تحت منتصف العضلة القصية الترقوية الخشائية (السهم الأزرق في الشكل 3E)، ووضع طرفي الخيط معا وسحب الخيط أفقيا نحو موقف 10:00 .
      ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بعناية لتجنب إصابة الوريد الوداجي الأيسر، والذي يقع خارج عضلة القصية الترقوية الخشائية.
    18. بصراحة فصل العضلات القصية اللامية رقيقة و / أو عضلة الكتفية اللامية لفضح الشريان السباتي (كاليفورنيا) (الشكل 3F السهم) بعد سحب بعيدا عضلة القصية الترقوية الخشائية. قطع عضلة القصية اللامية و / أو عضلة الكتفية اللامية عند الضرورة. استخدام مرقئ لفصل الأنسجة اللينة من CA دون لمس كاليفورنيا.
      ملاحظة: ويرافق CA بواسطة العصب المبهم، وهيكل الأبيض ينظر في الشكل الجيل الثالث 3G (السهم الأخضر)، وفي معظم الحالات يكون تحت العضلات القصية اللامية رقيقة و / أو عضلة الكتفية اللامية (بين الخطوط المنقطة الصفراء في الشكل 3F).
    19. استخدام ملقط غيض غرامة لالتقاط لفافة الجانبية حول CA مع تجنب العصب المبهم وكاليفورنيا. استخدام ملقط غيض غرامة أخرى لكمة ثقب في لفافة بين كاليفورنيا والعصب المبهم.
    20. تمرير هوك من خلال ثقب ورفع بلطف CA، ومن ثم وضع ملقط غيض غرامة تحت كاليفورنيا. نقل هوك وملقط في اتجاهين متعاكسين على طول CA لتجريد الأنسجة اللينة الغلالة البرانية. مجانا على الأقل ~ 5 ملم طول من CA (الشكل 3H، السهم الأزرق) من الأنسجة المحيطة.
    21. لمنع مضان الخلفية، اضغط على نهاية البلاستيك النمام القهوة السوداء إلى شقة، إقطع النمام القهوة في قطعة 3 مم، ثم قطع طولي على طول حواف أضعاف للحصول على قطعتين من "يو" شكل البلاستيك (الشكل 3H، الأخضر السهم).
    22. شطف قطعة واحدة من هذه "U" البلاستيك شكل مع المياه المالحة وأنه عقد مع ملقط ووضعه تحت CA في حين رفع بلطف CA مع هوك (الشكل 3H، السهم الأخضر). على الفور تطبيق 2-3 قطرات من المياه المالحة لتجنب تجفيف كاليفورنيا.
  2. في الوقت الحقيقي تسجيل الفيديو
    1. نقل الماوس ولوحة غطاء معا إلى المرحلة المجهر ومكان في الموقف المناسب تحت عدسة المياه 10X. ملء الفراغ بين عدسة 10X وCA مع المياه المالحة.
    2. بدء تسجيل الفيديو الرقمي تطبيق البرمجيات، وإطلاق ملف جديد وتسميته وفقا لذلك. تسجيل صور السفينة العادية وكتابة رقم الإطار عند إيقاف تسجيل الفيديو.
      ملاحظة: مرجع برنامج تسجيل الفيديو في الكمبيوتر للتسجيل. نحن نستخدم الرقمية برامج تسجيل الفيديو، وتستند أوصاف التالية على هذا الطلب.
      ملاحظة: بما هيئة تنظيم الاتصالات الميكانيكيةاتحاد المغرب العربي يمكن أن تجرح البطانة ويؤدي إلى تشكيل خثرة 20، فمن الضروري أن نؤكد أنه لا يوجد أي ضرر جراحية لجدار الوعاء الدموي قبل وقوع الضرر FeCl 3. ومن الضروري أيضا لتأكيد أنه لا يوجد الأنسجة المتبقية في جميع أنحاء كاليفورنيا، والتي قد تشكل حاجزا وتخفيف تأثير FeCl 3 إصابات -induced. كتابة رقم الإطار السجلات سوف تجعل من السهل تحليل الفيديو حسب الأوقات انقضى وقت لاحق.
    3. تحريك الماوس مع لوحة غطاء من عدسة 10X. أضعاف زاوية منشفة ورقية لجعل طرف رقيق وناعم واستخدامها لطخة بعناية المالحة في جميع أنحاء CA (تجنب لمس CA)، وكذلك في أماكن أخرى في مجال العمليات الجراحية. وهذا أمر مهم لتفادي التخفيف من الحل FeCl 3 المستخدمة.
    4. استخدام ملقط غيض الجميلة والتقاط قطعة من ورق الترشيح المشبعة مع FeCl 3 الحل ووضعه مباشرة على CA وابقائه في الموقع لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: Tس التصور المعونة من مجرى الدم وحصاد بيانات دقيقة، ووضع ورقة الترشيح على مقربة من نهاية البعيدة للتتعرض CA (الشكل 3I) وترك قطعة صغيرة في موقع الداني (السهم الأخضر في الشكل 3I) لمراقبة تدفق الدم في وقت متأخر المرحلة (أنظر أدناه).
    5. إزالة ورقة الترشيح (وتعرف هذه النقطة الوقت بداية "بعد إصابة") وشطف CA بمحلول ملحي (2 مل على الأقل).
    6. ضع الماوس مع لوحة غطاء الخلفي للعدسة 10X. مراقبة السفن والبدء في تسجيل صور الفيديو. كتابة رقم إطار الفيديو في نهاية الدقيقة الأولى من التسجيل.
      يتم تحديد تشكيل خثرة عن تراكم الصفائح الدموية الفلورسنت، والذي لوحظ في صور الفيديو في الوقت الحقيقي على شاشة الكمبيوتر أو تحت المجهر: ملاحظة. تسجيل صور فيديو مباشرة بعد وضع الماوس مرة أخرى تحت المجهر. حافظ على تسجيل للنهاية الدقيقة الأولى بعد إزالة وورقة إلتر. مراقبة السفينة بالكامل من القاصي إلى المواقع القريبة للحصول على معلومات حول وقوع الضرر، ومن ثم التركيز على مجال الاهتمام (عادة هي مركز المنطقة المصابة) لمزيد من التصوير.
    7. سجل صور الفيديو لمدة 10 ثانية في كل دقيقة ل10 دقيقة الأولى (على سبيل المثال، 2:55 حتي 03:05) ثم 10 ثانية في كل دقيقة أخرى حتى نهاية التجربة. كتابة أرقام الإطار عندما يتم إيقاف كل تسجيل.
      ملاحظة: نقطة نهاية النموذج هي: 1) عندما توقف تدفق الدم ل> 30 ثانية؛ أو 2) إذا لم ينظر إلى انسداد في 30 دقيقة بعد الإصابة. في هذه الحالة، استخدم 30 دقيقة للتحليل الإحصائي. تعيين وقت التعرض لتسجيل الفيديو تصل إلى 10 ميللي ثانية في البداية، لذلك سيكون من السهل لمراقبة تدفق الدم خلال الجلطة الدموية. عندما تصبح الجلطة الدموية الكبيرة ومضان يشبع استشعار الكاميرا، يصبح من الصعب التعرف على تدفق الدم على التجلط. لحل هذه المشكلة، قم بتحريك م التصويرnter إلى الموقع لم يصب بأذى القريبة (الشكل 3I، السهم الأخضر) حيث تدفق الدم لا يزال من الممكن لاحظت بوضوح. نحن أيضا زيادة فضح الوقت إلى 15 أو 20 مللي ثانية عند التركيز على الداني الموقع، أصيب الامم المتحدة، وبالتالي فإن تدفق الدم يمكن ملاحظتها بشكل أكثر وضوحا. عندما تدفق الدم سوف تتوقف، العديد من الخلايا الكبيرة (الكريات البيضاء) تبدأ في لفة على جدار الوعاء الدموي في الموقع القريب من الجلطة. عادة ما يتوقف تدفق غضون 2 - 3 دقائق بعد ظهور خلايا كبيرة. كتابة فضح الوقت على ورقة تسجيل إذا تم تغييره. وعادة ما يستغرق حوالي 30 دقيقة من التخدير إلى نهاية التجربة، إذا تم استخدام نوع الفئران البرية C57Bl6 العادية.
      تنبيه ملاحظة: لا تستخدم البيضاء المجمعة تجلط الصفائح الدموية كما توقع لوقف تدفق الدم، والتي لن تعطي بيانات دقيقة ويتأثر بها وقت التعرض. غطت تجلط البيضاء التجويف سفينة لا يعني توقف تدفق الدم (انظر الفيديو التمثيلي 1).
    8. وفي نهاية التجربة، الموت ببطء الفئران باستخدام جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (200/20 ملغ / كغ)، تليها خلع عنق الرحم بعد التأكد من عدم التنفس وضربات القلب.

3. FeCl 3 المستحثة مساريقي الشريان / جلطة نموذج

  1. تخدير 8 - الفئران C57Bl6 12 اسبوع على النحو المذكور في القسم 2.1.1. تطبيق التعليم والتدريب المهني مرهم على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
  2. حقن محلول بابافيرين (إجمالي 0.4 ملغ / الماوس) البريتونى لمنع الأمعاء التمعج.
  3. إزالة الفراء على الرقبة والبطن مع المقص الكهربائي الحيوان. كريم مزيل الشعر ليست ضرورية.
  4. تأمين الماوس في موقف ضعيف على غطاء 15 سم لوحة زراعة الأنسجة. استخدام أربع قطع من شريط صغير (2 سم × 0.5 سم) لتأمين كل الساقين. استخدام 4 -0 خياطة للالتفاف حول القواطع، الشريط طرفي الخيط إلى غطاء للحفاظ على التوالي الرقبة (الشكل 2).
  5. اتبع الإجراءات 2.1.4 -2.1.15 لفضح حبل الوريد لحقن رودامين 6G إلى الصفائح الدموية التسمية.
  6. إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد من الخنجري إلى أسفل البطن باستخدام مقص جراحي الشكل (4A). التقاط الصفاق الأوسط (وتسمى أيضا ألبا الخط، الشكل 4A، السهم) مع ملقط غريف، الذي هو واضح وليس لديها الأوعية الدموية، ورفع حوالي 2-3 ملم عالية، تأكيد لا توجد الأمعاء تحت خط القطع، وقطع الصفاق مفتوحة طوليا مع مقص غرامة (الشكل 4B).
  7. إعادة تأمين الفئران إلى الوضع الأفقي الصحيح. وضع الجل الاغاروز نصف دائرة من مسافة قريبة في البطن، والداخل للظاهر بلطف الأمعاء ونشرها على الجزء العلوي من هلام مع ملقط غريف (الشكل 4C). استخدام فروع الثانية للتجربة تجلط الدم (الشكل 4C، السهم).
    ملاحظة: استخدام مرقئ أو ملقط الصغرى أدسون للمساعدة في الداخل للظاهر الأمعاء. تجنب إيذاءالأمعاء والأوعية.
  8. وضع 5-6 قطرات المياه المالحة للحفاظ على رطوبة الأمعاء والأوعية. نقل الماوس مع غطاء لوحة معا إلى المرحلة المجهر ووضع في المكان المناسب تحت عدسة الجافة 10X.
    ملاحظة: استخدام عدسة الجافة لأن غشاء الصائمي اللفائفي لا يمكن ان تحمل محلول ملحي. تأكد لإسقاط محلول ملحي على الأنسجة المعرضة للحفاظ على رطوبة.
  9. وصمة عار المالحة حول الشريان المساريقي والوريد قبل العلاج.
  10. استخدام ملقط غيض غرامة لالتقاط قطعة من ورق الترشيح المشبعة مع 12.5٪ FeCl 3 الحل ووضعه مباشرة على الشريان المساريقي والوريد لمدة 1 دقيقة (الشكل 4D). إزالة ورقة الترشيح (وتعرف هذه النقطة الوقت بداية "بعد إصابة") وشطف الشريان المساريقي الجرحى والوريد بمحلول ملحي (2 مل على الأقل).
  11. ضع الماوس مع لوحة الغطاء مرة أخرى تحت عدسة الجافة 10X. مراقبة السفن والبدء في تفصيلصور الفيديو أورد على النحو المذكور في 2.2).
    ملاحظة: نقطة نهاية هذه التجربة هي: 1) عندما توقف تدفق الدم ل> 30 ثانية؛ أو 2) إذا لم يتم النظر إلى انسداد في 30 دقيقة بعد الإصابة، وفي هذه الحالة استخدام 30 دقيقة للتحليل الإحصائي.
  12. في نهاية التجربة، الموت ببطء الفئران باستخدام جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (200/20 ملغ / كغ)، تليها خلع عنق الرحم بعد أن يتم تأكيد أي التنفس والقلب النابض.

النتائج

الشريان السباتي التخثر نموذج
في الفئران مع C57BL6 الخلفية، نوصي باستخدام 7.5٪ FeCl 3 لعلاج السفينة لمدة 1 دقيقة كنقطة انطلاق. تحت العلاج من 7.5٪ FeCl 3، يتم تحديد حدود المنطقة الجرحى وجدار الوعاء الدموي العادي بسهولة تحت المجهر (انظر

Discussion

3 -induced نموذج FeCl هو واحد من نماذج تجلط الدم الأكثر استخداما، والتي يمكن أن توفر معلومات قيمة حول التعديلات الجينية على وظيفة الصفائح الدموية وتخثر 7،8،16،19،31-33 فحسب، بل يمكن أيضا أن تكون أداة قيمة لتقييم المركبات والاستراتيجيات العلاجية للعلاج والوقاية من ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Scissors - Tungsten CarbideFine Science Tools 14502-14cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cmFine Science Tools 11018-12cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cmFine Science Tools 14519-14  to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cmFine Science Tools 13021-12to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cmFine Science Tools 11050-10to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cmFine Science Tools 11254-20 Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cmFine Science Tools 11253-10Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip DiameterFine Science Tools 10062-12Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle HoldersFine Science Tools 12061-02Needle holders
Suture Thread 4-0Fine Science Tools 18020-40For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0Fine Science Tools 18020-60For all surgery and ligation
Kalt Suture NeedlesFine Science Tools 12050-03
rhodamine 6G Sigma83697-1GTo lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous)Sigma12321To induce vessel injury
Papaverine hydrochlorideSigmaP3510To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave TapesMedline111625To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µmFisher09-720-004For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µmFisher09-719DTo filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep PadFisher06-669-62To sterilize the surgical site
Agarose BioExpressE-3120-500To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscopeLeicaIntravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 softwareNorPixhttps://www.norpix.com/

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J., et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K., Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved