Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

Resumen

Se presenta un procedimiento de refinado del cloruro férrico _(FeCl3) modelos de trombosis inducidas en la carótida y la arteria mesentérica, así como la vena, que se caracteriza de manera eficiente mediante microscopía intravital para monitorear el tiempo de oclusiva formación de trombos.

Resumen

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl₃) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl₃-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introducción

La trombosis arterial (coágulos de sangre) es una complicación común de muchas enfermedades sistémicas asociadas con la inflamación crónica, incluyendo la aterosclerosis, la diabetes, la obesidad, el cáncer y los trastornos autoinmunes reumatológicas crónicas. Los trombos que se presentan en el tronco circulación arterial de la activación plaquetaria inadecuada, agregación y mecanismos procoagulantes posteriores, y están implicados en los ataques cardíacos, accidentes cerebrovasculares y la pérdida de la extremidad. La pared del vaso es un sistema complejo que incluye múltiples tipos de células y está influenciada por una multitud de factores extrínsecos como el estrés de cizallamiento, las células de la sangre, hormonas y citoquinas, así como la expresión de proteínas antioxidantes que circula en la pared del vaso. Experimentos in vitro no pueden replicar este entorno complejo y por lo tanto en estudios in vivo utilizando modelos animales son críticos para permitir una mejor comprensión de los mecanismos implicados en los trastornos trombóticos.

Los ratones han demostrado tener simmecanismos ILAR a los seres humanos en términos de la trombosis, aterosclerosis, inflamación y diabetes ^1,2. Además, los ratones transgénicos y knockout pueden ser creados para probar la función de los productos génicos específicos en un complejo fisiológico o patológico ambiente. Tales estudios imitan la patología humana y pueden proporcionar información sobre el mecanismo importante relacionada con el descubrimiento de nuevas vías y terapias, así como proporcionar detalles importantes en la caracterización de los efectos de la droga sobre la trombosis.

Trombos arteriales patológicas se producen debido a la lesión endotelial capa o disfunción y la exposición de la corriente de la sangre a la matriz subendotelial ^3,4. Varios modelos de trombosis se han desarrollado para inducir este daño endotelial tales como la lesión mecánica, lesión oxidativa a base de Bengala compuesto fotorreactivo Rose y lesiones láser ^5. En este espectro, cloruro férrico _(FeCl3) inducida por la lesión vascular es un modelo ampliamente utilizado de trombosis. Este reactivo cuandose aplica a la cara externa de los vasos induce daño oxidativo a las células vasculares ^6-8, con pérdida de la protección de las células endoteliales a partir de plaquetas y componentes de la cascada de coagulación circulantes. El modelo de FeCl ₃ es simple y sensible tanto a anticoagulante y anti-plaquetas medicamentos, y se ha realizado en arterias carótida y femoral, vena yugular, y mesentérica y arteriolas y vénulas cremastéricos en ratones, ratas, cobayas y conejos ^6-15.

Un parámetro medible en este modelo es el tiempo transcurrido desde la lesión hasta completar la oclusión del vaso, medida como cese el flujo de sangre con un medidor de flujo Doppler o bajo la observación directa con ^6,7,9 microscopía intravital. Una gama de tiempos entre 5 a 30 min se ha informado en diferentes estudios en ratones C57Bl6 ^7-10,16, lo que sugiere que FeCl ₃ concentraciones, tipos de anestesia, las técnicas quirúrgicas, la edad del ratón, fondo genómico, método de medición de bLood flujo, y otras variables ambientales tienen efectos significativos en este modelo. Esta amplia variabilidad hace que sea difícil comparar los estudios de diferentes grupos de investigación y puede hacer la detección de diferencias sutiles difícil.

Con una visión para minimizar tales variabilidades y establecer un reproducible uniformemente en el sistema de modelo in vivo, hemos refinado el modelo de arteria carótida inducida por _FeCl3 que hace que los datos altamente reproducibles con una variación mínima ^6-10,16-19. En este trabajo se describen y compartir las habilidades y presenta varios ejemplos experimentales representativos que pueden beneficiarse de este modelo.

Protocolo

Todos los procedimientos y manipulaciones de los animales han sido aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC) de la Clínica de Cleveland, en conformidad con la política de Estados Unidos Servicio de Salud Pública en el cuidado humano y Uso de Animales, y la Guía de los NIH para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio.

1. Preparación:

1. Tinte fluorescente para el etiquetado de plaquetas
   1. Preparar la solución 6G rodamina, 0,5 mg / ml, en solución salina y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro.
2. _FeCl3 Solución
   1. Hacer una solución madre fresca de 30% FeCl ₃ (anhidro, es igual a 1,85 M) en agua pura, y el filtro con 0,45 micras filtro. Preparar 5 ml fresco _FeCl3 solución a la concentración deseada [por ejemplo, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) y 12,5% (0,771 M)] por diluir la solución al 30% _{de FeCl3} con i aguana 6 cm placa de cultivo de tejidos y mantener la tapa cerrada.
      NOTA: El uso de la placa de cultivo hace que sea más fácil para recoger el papel de filtro saturado con una solución de _FeCl3 que a recogerlo en un recipiente estrecho, tal como un tubo de 1.5 ml. FeCl3 es extremadamente peligroso y que las precauciones, tales como el uso de guantes y bata de laboratorio, etc., equipo de protección personal, siempre se debe tomar.
3. Papeles de filtro
   1. Cortar el papel de filtro de 1 mm x 2 mm de tamaño. Remojar suficientes piezas de papel de filtro de corte en la solución de _FeCl3 en el mismo plato.
4. Solución de clorhidrato de papaverina
   1. Preparar la solución de hidrocloruro de papaverina (25 mg / ml) en agua y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro.
5. en gel de agarosa
   1. Preparar 2% en gel de agarosa en PBS o solución salina en la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, ~ 1 cm de espesor, y cut a semicírculo con ~ 3 cm de diámetro.

2. FeCl ₃ inducida por lesión arterial carotídea Modelo de trombosis

1. Procedimientos quirúrgicos para el modelo de trombosis
   1. Utilice 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad (u otras cepas como sea necesario). Anestesiar los ratones con la mezcla de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. Confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie.
      NOTA: Esta cantidad de ketamina / xilazina es suficiente para mantener al animal en la anestesia estable y sin dolor (respuesta a los pies de apriete) durante al menos 1 hr.
   2. Retire la piel en el cuello y parte superior del pecho con una pequeña maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario. Aplicar el ungüento oftálmico de petróleo neutro en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
   3. Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice una cinta larga (~ 10 cm) para asegurar hinextremidades d e inferior del cuerpo, y dos piezas de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar las patas delanteras. Utilice una sutura 4-0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto del ratón (Figura 2).
   4. Coloque la placa con la cabeza del ratón sobre el usuario bajo una fuente de luz quirúrgica.
   5. Esterilizar la zona quirúrgica con algodón empapado en alcohol. Usa los micro-Adson fórceps para mantener la piel y utilizar unas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión (2 - 3 mm).
   6. Manteniendo la piel de la incisión con el fórceps y tijeras quirúrgicas insertar con las mordazas cerradas en la incisión. Empuje las tijeras por vía subcutánea hacia el manubrio o la barbilla, y luego abrir las tijeras para liberar la piel de la capa subcutánea.
   7. Cortar la piel con las tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la línea media del manubrio al nivel del hueso hioides (Figura 3A y 3B). Sin rodeos diseccionar la fascia delgada (línea punteada, en Figura 3B) entre la glándula submaxilar con una multa pinza hemostática y una pinza Graefe (Figura 3B y 3C; flechas azules).
      NOTA: El manubrio (flecha negro en la figura 3C) y la tráquea (T en la figura 3C) se verán después de este paso.
   8. Mantener el tejido blando y la piel que se observa a la derecha del manubrio con las pinzas Graefe, inserte la pinza debajo de la faja hacia la posición de 2 horas (amarillo línea de puntos en la figura 3C), abrir las mordazas de la pinza hemostática para liberar el vena yugular del tejido circundante.
   9. Cortar la fascia, el tejido blando y la piel hacia la posición dos (Figura 3C) con las tijeras quirúrgicas para exponer la vena yugular derecha (Figura 3D, flecha).
   10. Dibuje alrededor de 200 - 300 l solución 6G rodamina usando una jeringa de 1 ml con aguja de 22 G y entonces el cambioa 30 de la aguja G.
       NOTA: Esto protege la aguja 30 G del daño de su punta fina. Directamente arrastrar la solución de rodamina 6G con la aguja 30 G no dañará la punta; Sin embargo tocando la pared del recipiente accidental puede causar daños, lo que puede hacer la inyección difícil.
   11. Enjuague la aguja de 30 G por lentamente empujando a la solución 6G rodamina, asegurarse de que no queden burbujas de aire en la jeringa o la aguja. Mantenga 100 l rodamina 6G solución inyectable.
   12. Curva 2 - 3 mm punta de la aguja a un ángulo de 90 ° con el soporte de la aguja, lo que impedirá la inserción de la aguja es demasiado profunda para la vena yugular y hace que la inyección sea más fácil de controlar (Figura 3D).
   13. Se inyecta la solución de rodamina 6G en la vena yugular derecha a las plaquetas de la etiqueta. Para estabilizar la jeringa y mantener la aguja en posición, mantener la jeringa con una mano y la aguja con el fórceps Graefe con la otra mano durante el injection.After inyección, sujetar el sitio de la inyección con las pinzas Graefe para evitar el sangrado.
   14. Abrir las mordazas de la pinza hemostática e insertarse con las pinzas para sujetar Graefe la pared del vaso de la zona de la inyección, y luego ligar el sitio de la inyección con una sutura 6-0.
       NOTA: Como una alternativa de paso 2.1.15, aplicando presión a la zona de inyección con un dedo durante 2 minutos se detendrá el sangrado; Sin embargo, este método tiene un riesgo de causar sangrado si el coágulo en el sitio de inyección se retira accidentalmente más.
   15. Sin rodeos diseccionar el tejido blando y la fascia alrededor de la glándula submaxilar izquierda con la pinza y la pinza Graefe y tire de la glándula hacia la posición 7 horas (Figura 3E) para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo (flecha azul en la Figura 3E).
   16. Sin rodeos diseccionar la fascia (Figura 3E, línea punteada) entre el músculo esternocleidomastoideo izquierdo y el músculo omohioideo o la sternohyOID muscular (Figura 3E, flecha verde) situado a la izquierda del sitio de la tráquea con la pinza hemostática.
   17. Pasar una aguja con sutura de seda 6-0 (alrededor de 15 cm de longitud) en el medio del músculo esternocleidomastoideo (flecha azul en la Figura 3E), poner los dos extremos de la sutura en conjunto y tire de la sutura lateralmente hacia la posición de diez .
       NOTA: Este procedimiento debe realizarse con cuidado para evitar lesiones de la vena yugular izquierda, que se encuentra fuera del músculo esternocleidomastoideo.
   18. Sin rodeos separar el músculo esternohioideo delgada y / o músculo omohioideo para exponer la arteria carótida (CA) (Figura 3F flecha) después de alejarse del músculo esternocleidomastoideo. Cortar el músculo esternohioideo y / o músculo omohioideo según sea necesario. Utilice la pinza hemostática para separar el tejido blando de CA sin tocar la CA.
       NOTA: CA está acompañado por el nervio vago, la estructura se ve en blanco Figura 3G (flecha verde), y en la mayoría de los casos es por debajo del músculo esternohioideo delgada y / o músculo omohioideo (entre las líneas de puntos amarillos en la Figura 3F).
   19. Use unas pinzas de punta para recoger la fascia lateral alrededor de la CA, evitando el nervio vago y CA. Use otros fórceps de punta fina para perforar un agujero en la fascia entre el CA y el nervio vago.
   20. Pasar el gancho a través del agujero y levante suavemente la CA, y luego colocar las pinzas de punta fina bajo la CA. Mover el gancho y fórceps en direcciones opuestas a lo largo del CA para despojar a los tejidos blandos de la adventicia. Libre de al menos 5 ~ mm de longitud de CA (Figura 3H, flecha azul) del tejido circundante.
   21. Para bloquear la fluorescencia de fondo, presione el extremo de un plástico negro agitador de café al piso, CrossCut el agitador de café en una pieza de 3 mm, y luego se corta longitudinalmente a lo largo de los bordes de plegado para obtener dos piezas de "T" de plástico de forma (Figura 3H, verde flecha).
   22. Enjuague una pieza de esta "U" forma plástica con solución salina y sostenerlo con unas pinzas y colocarlo bajo la CA mientras levanta suavemente la CA con el gancho (Figura 3H, flecha verde). Inmediatamente aplique 2-3 gotas de solución salina para evitar el secado de la CA.
2. En tiempo real de grabación de vídeo
   1. Transferir la tapa del ratón y la placa junto a la platina del microscopio y colocar en una posición apropiada bajo la lente de 10X agua. Llenar el espacio entre la lente de 10X y la CA con solución salina.
   2. Iniciar la aplicación de software de grabación de vídeo digital, y poner en marcha un nuevo archivo y el nombre que en consecuencia. Grabar imágenes de los vasos normales y anote el número de cuadro cuando se detiene la grabación de vídeo.
      NOTA: Consulte el software de grabación de vídeo en el equipo para la grabación. Utilizamos software de grabación de vídeo digital y las siguientes descripciones se basan en esta aplicación.
      NOTA: Desde tra mecánicauma puede dañar el endotelio y dar lugar a la formación de trombos ^20, es necesario para confirmar que no hay una lesión quirúrgica en la pared del vaso antes de la lesión FeCl _3. También es necesario para confirmar que no hay tejido restante alrededor de la CA, que puede formar una barrera y atenuar el efecto de FeCl ₃ lesión inducida. Anote el número de cuadro de los registros hará que sea fácil de analizar los vídeos según los tiempos transcurridos después.
   3. Mover el ratón con la tapa de la placa de la lente de 10X. Doblar una esquina de una toalla de papel para hacer una punta delgada y fina y utilizarlo para borrar cuidadosamente la solución salina alrededor del CA (evite tocar CA), así como en otros lugares en el campo quirúrgico. Esto es importante para evitar la dilución de la solución de FeCl ₃ utilizado.
   4. Use unas pinzas de punta y recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de _FeCl3 y colocarlo directamente en la CA y mantenerlo en el sitio durante 1 min.
      NOTA: To visualización de la ayuda de la información exacta del torrente sanguíneo y cosecha, coloque el papel de filtro cerca del extremo distal del expuestos CA (Figura 3I) y dejar un pequeño segmento en el sitio proximal (flecha verde en la figura 3I) para observar el flujo sanguíneo en la última hora fase (ver abajo).
   5. Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de "después de la lesión") y enjuague la CA con solución salina (al menos 2 ml).
   6. Ponga el ratón con la tapa de la placa posterior de la lente de 10X; observar el barco y empezar a grabar imágenes de vídeo. Anote el número de fotogramas de vídeo al final del primer minuto de grabación.
      NOTA: La formación de trombos se identifica por la acumulación de las plaquetas fluorescentes, que se observa en las imágenes de vídeo en tiempo real en la pantalla del ordenador o bajo microscopio. Grabar imágenes de vídeo inmediatamente después de poner el ratón de nuevo bajo el microscopio. Mantenga la grabación hasta el final de la primera minutos después de retirar la filtrar papel. Observar todo el barco desde el extremo distal de los sitios proximales para obtener información acerca de la lesión, y luego se centran en el área de interés (por lo general es el centro de la zona lesionada) para obtener más imágenes.
   7. Imágenes de vídeo de registro para 10 seg cada minuto para la primera 10 min (por ejemplo, 02:55-03:05) y después 10 seg cada dos minutos hasta el final del experimento. Escribir los números del bastidor cuando se detiene cada grabación.
      NOTA: Los puntos finales del modelo son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de> 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión. En este caso, el uso de 30 minutos para el análisis estadístico. Establecer el tiempo de exposición de la grabación de vídeo de hasta 10 ms al inicio, por lo que será fácil de observar el flujo sanguíneo a través de los trombos. Cuando los trombos se hacen grandes y la fluorescencia satura sensor de la cámara, se hace difícil para identificar el flujo de sangre a través de los trombos. Para resolver este problema, mueva la imagen center al sitio ileso proximal (Figura 3I, flecha verde) donde el flujo de sangre que aún se puede observar con claridad. También aumentan el tiempo de exposicion a 15 o 20 ms cuando se enfoca en el sitio de la ONU con lesión proximal, por lo que el flujo de sangre se puede observar con mayor claridad. Cuando el flujo sanguíneo cesará, numerosas células más grandes (leucocitos) empiezan a rodar por la pared del vaso en el sitio proximal del trombo. Flujo general se detiene en 2 - 3 min después de la aparición de las células grandes. Anote la hora Expose en la hoja de registro si se cambia. Por lo general toma alrededor de 30 minutos de la anestesia hasta el final del experimento, si se utilizaran los de tipo salvaje ratones normales C57BL6.
      PRECAUCIÓN NOTA: No utilice el coágulo de plaquetas agregadas blanco como el signo de la cesación del flujo sanguíneo, lo que no dará una información precisa y se ve afectada por el tiempo de exposición. El coágulo blanco cubrió la luz del vaso no significa que el flujo de sangre dejado (ver el video representativa 1).
   8. Al final del experimento, la eutanasia a los ratones utilizando una sobredosis de ketamina / xilazina (200/20 mg / Kg), seguido por dislocación cervical después de confirmar sin respiración y latidos del corazón.

3. _FeCl3 inducida por la arteria mesentérica / Trombosis Venosa Modelo

1. Anestesiar 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad como se mencionó en la sección 2.1.1. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
2. Inyectar la solución papaverina (en total 0,4 mg / ratón) por vía intraperitoneal para inhibir el peristaltismo intestinal.
3. Retire la piel en el cuello y el abdomen con una maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario.
4. Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice cuatro trozos de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar todas las piernas. Utilice una sutura de 4 -0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto (Figura 2).
5. Siga los procedimientos 2.1.4 -2.1.15 para exponer la vena yugular para la inyección de rodamina 6G a las plaquetas de la etiqueta.
6. Realizar una incisión en la línea media a través de la piel de la xifoides hasta el abdomen inferior con las tijeras quirúrgicas (Figura 4A). Recoger el peritoneo medio (también llamada línea alba, la figura 4A, flecha) con una pinza Graefe, que es clara y no tiene vasos sanguíneos, levantar unos 2 - 3 mm de altura, confirmar ninguna de intestino bajo la línea de corte, y cortar el peritoneo abierto longitudinalmente con las tijeras finas (Figura 4B).
7. Vuelva a asegurar los ratones a la posición lateral derecha. Colocar el gel de agarosa de medio círculo cerca del abdomen, y exteriorizar suavemente los intestinos y se extendió en la parte superior del gel con las pinzas Graefe (Figura 4C). Usa los segundos ramales para el experimento trombosis (Figura 4C, flecha).
   NOTA: Utilice la pinza o pinzas de micro-Adson para ayudar a exteriorizar los intestinos. Evitar herir laintestino y el recipiente.
8. Coloque 5-6 gotas de solución salina para mantener la humedad del intestino y de los vasos. Transferir el ratón con la tapa de placa junto a la platina del microscopio y colocar en la posición adecuada debajo de la lente seca 10X.
   NOTA: Utilice un objetivo seco porque la membrana yeyunoileales no puede contener solución salina. Asegúrese de dejar caer una solución salina en los tejidos expuestos a mantenerlos húmedos.
9. Secar la solución salina alrededor de la arteria mesentérica y vena antes del tratamiento.
10. Use unas pinzas de punta para recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de 12,5% _{de FeCl3} y colocarlo directamente en la arteria mesentérica y vena durante 1 min (Figura 4D). Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de "después de la lesión") y enjuagar la arteria mesentérica heridos y la vena con solución salina (al menos 2 ml).
11. Ponga el ratón con la tapa de la placa de nuevo bajo la lente seca 10X; observar los vasos y empezar a RECord imágenes de vídeo que se han mencionado en el punto 2.2).
    NOTA: Los puntos finales de este experimento son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de> 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión, y en este caso utilizar 30 min para el análisis estadístico.
12. Al final del experimento, la eutanasia a los ratones utilizando una sobredosis de ketamina / xilazina (200/20 mg / Kg), seguido por dislocación cervical después sin respiración y los latidos del corazón se confirman.

Resultados

La trombosis de la arteria carótida Modelo
En ratones C57BL6 con el fondo, se recomienda utilizar 7,5% _FeCl3 para el tratamiento de la embarcación durante 1 min como punto de partida. Bajo tratamiento de 7,5% _FeCl3, las fronteras de la zona lesionada y la pared vascular normal se identifican fácilmente bajo el microscopio (Ver video en línea 1), lo que sugiere que la capa endotelial fue dañado de manera significativa. El...

Discusión

El _FeCl3 inducida modelo es uno de los modelos de trombosis más ampliamente usados, que no sólo pueden proporcionar información valiosa acerca de las modificaciones genéticas sobre la función plaquetaria y trombosis ^{7,8,16,19,31-33,} pero también puede ser una herramienta valiosa para la evaluación de compuestos terapéuticos y estrategias para el tratamiento y prevención de enfermedades aterotrombóticos ^11,17,34-37. Aquí hemos demostrado que nuestros modificaciones y refinamien...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14502-14	cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm	Fine Science Tools	11018-12	cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm	Fine Science Tools	14519-14	to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm	Fine Science Tools	13021-12	to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm	Fine Science Tools	11050-10	to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm	Fine Science Tools	11254-20	Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm	Fine Science Tools	11253-10	Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter	Fine Science Tools	10062-12	Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12061-02	Needle holders
Suture Thread 4-0	Fine Science Tools	18020-40	For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0	Fine Science Tools	18020-60	For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-03
rhodamine 6G	Sigma	83697-1G	To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous)	Sigma	12321	To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride	Sigma	P3510	To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes	Medline	111625	To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm	Fisher	09-720-004	For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm	Fisher	09-719D	To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad	Fisher	06-669-62	To sterilize the surgical site
Agarose	BioExpress	E-3120-500	To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope	Leica		Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached.	npi electronic GmbH		http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software	NorPix		https://www.norpix.com/