塩化第二鉄誘発性マウス血栓症モデル

要約

私たちは、塩化第二鉄（FeCl ₃を）の洗練された手順は、頸動脈や腸間膜動脈ならびに静脈に血栓症モデルを誘発血栓形成を閉塞性までの時間を監視するために生体顕微鏡を用いて、効率的特徴を報告しています。

要約

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl₃) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl₃-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

概要

動脈血栓症（血の塊）は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肥満、癌および慢性自己免疫リウマチ性疾患などの慢性炎症に関連する多くの全身性疾患の一般的な合併症です。不適切な血小板活性化、凝集及びその後の凝固機構から動脈循環ステムで発生し、血栓は、心臓発作、脳卒中及び四肢の喪失に関与しています。血管壁は、血管壁内の血液細胞、ホルモンおよびサイトカイン、ならびに抗酸化タンパク質の発現を循環する、複数の細胞型を含み、剪断応力を含む外因性の要因の多くに影響される複雑なシステムである。 インビトロ実験は複製できませんこの複雑な環境、従って、動物モデルを用いたin vivo試験では、血栓性疾患に関与するメカニズムのより良い理解を可能にするために重要です。

マウスは、シムを有することが示されています血栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症および糖尿病^1,2の点でヒトへのILARメカニズム。さらに、トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、複雑な生理学的または病理学的環境の特定の遺伝子産物の機能をテストするために作成することができます。このような研究は、ヒト病理を模倣し、新たな経路および治療法の発見に関連する重要な機構的情報を提供するだけでなく、血栓症に対する薬物の効果を特徴づける重要な詳細を提供することができます。

病的な動脈血栓は、内皮下マトリックス^3,4への血流の層損傷または機能不全と露出を内皮に起因起こります。種々の血栓症モデルは、機械的損傷、光反応性化合物ローズベンガルベースの酸化損傷およびレーザー損傷⁵として内皮損傷を誘導するために開発されてきました。このスペクトルでは、塩化第二鉄（FeCl ₃を_）は、血管損傷は血栓症の広く使用されているモデルである誘発しました。この試薬とき容器の外側の側面に適用され、血小板および凝固カスケードの成分を循環から内皮細胞の保護の損失、血管細胞^6-8の酸化的損傷を誘発します。 FeCl ₃モデルは、単純かつ抗凝固剤および抗血小板薬の両方に対して敏感であり、マウス、ラット、モルモット及びウサギ^6-15に頸動脈及び大腿動脈、頸静脈、および腸間膜および精巣挙筋細動脈と細静脈上で実行されています。

このモデルにおける一つの測定可能なパラメーターは、ドップラー流量計または生体顕微鏡の^6,7,9と直接観察下血流停止として測定し、血管閉塞を完了するために損傷からの経過時間です。 5〜30分の間の時間の範囲は、FeCl ₃を濃度が、麻酔、外科技術、マウスの年齢の種類、ゲノム背景、Bを測定する方法を示唆し、C57BL6マウス^7-10,16異なる研究で報告されていますloodフロー、および他の環境変数は、このモデルにおいて有意な効果を有します。この広い可変性は、それが困難な異なる研究グループからの研究を比較することになり、微妙な差異の検出が困難になることができます。

このような変動性を最小化し、 生体内のモデル系で均一に再現性を確立するためのビジョンでは、我々は最小限の変動^6-10,16-19と再現性の高いデータを作成するのFeCl ₃ -誘発性頚動脈モデルに磨きをかけてきました。本稿では説明し、スキルを共有し、このモデルの恩恵を受けることができるいくつかの代表的な実験例を報告しています。

プロトコル

動物のすべての手順や操作は、 動物の愛護管理と使用上のアメリカ公衆衛生局政策 、およびケアのための NIH ガイドに従ってクリーブランドクリニックの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されており、実験動物の使用 。

1.準備：

1. ラベリング血小板のための蛍光色素
   1. 生理食塩水で、ローダミン6G溶液を、0.5 mg / mlとを準備し、0.22μmフィルターで溶液を滅菌します。
2. FeCl ₃溶液
   1. 30％のFeCl ₃の新鮮なストック溶液を作る（無水、1.85 Mに等しい）、純水であり、0.45μmのフィルターでろ過します。により5ミリリットルを所望の濃度の新鮮なのFeCl ₃溶液[ 例えば、2.5％（0.154 M）、5％（0.308 M）、7.5％（0.463 M）、10％（0.617 M）、12.5％（0.771 M）]を準備します水の私と30％のFeCl ₃溶液を希釈6cm組織培養皿NA及び蓋を保つを閉じます。
      注：培養皿を使用しては、簡単にそのような1.5mlの微小管として、狭いコンテナからそれを拾うするよりものFeCl ₃溶液で飽和濾紙をピックアップすることができます。 FeCl 3は非常に危険であり、そのような手袋や白衣などを身に着けているような予防措置、保護具は、常に注意しなければならないこと。
3. フィルターペーパー
   1. 1ミリメートル×2ミリメートルの大きさにろ紙をカットします。同じ皿の中のFeCl ₃溶液中でカットフィルタ紙の十分な部分を浸します。
4. パパベリン塩酸ソリューション
   1. 水にパパベリン塩酸塩溶液（25 mg / mlで）を調製し、0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。
5. アガロースゲル
   1. 、6ウェル組織培養プレートに2％アガロースPBS中のゲルまたは生理食塩水を調製〜1cmの厚さ、およびc2〜3センチ径の半円形にユタ。

2.のFeCl ₃誘発性頚動脈動脈損傷血栓症モデル

1. 血栓症モデルのための外科的処置
   1. 12週齢のC57BL6マウス（または他の系統必要に応じて） - 8を使用してください。腹腔内注射を介して、ケタミン（100ミリグラム/キログラム）/キシラジン（10mg / kg）の混合物を用いてマウスを麻酔。つま先のピンチによって麻酔の深さを確認してください。
      注：ケタミン/キシラジンのこの量は、少なくとも1時間安定した麻酔で動物と痛みなし（ピンチつま先への応答）を保持するのに十分です。
   2. 小動物電気バリカンで首と胸の上部に毛皮を削除してください。脱毛クリームは必要ありません。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に中立石油眼軟膏を適用します。
   3. 15cmの組織培養プレートの蓋の上仰臥位でマウスを固定します。ヒンを確保するために、1つの長いテープ（約10センチ）を使用しますD手足や下半身、そして前足を確保するために小さなテープ（2センチメートル×0.5センチ）の2枚。切歯を包み込む4-0縫合糸を使用し、マウスの首をまっすぐ（ 図2）を維持するために蓋に縫合糸の両端をテープで固定します。
   4. 外科的な光源下でオペレータに向かってマウスヘッドとプレートを置きます。
   5. アルコールパッドで手術部位を滅菌します。 （ - 3ミリメートル2）皮膚を保持し、小さな切開を作るために手術用ハサミを使用するマイクロAdson鉗子を使用してください。
   6. 鉗子で切開部の皮膚を持ち、ジョーが切開部に閉じた状態で手術用はさみを挿入します。胸骨柄やあごに向かって皮下にはさみを押し、皮下層から肌を解放するためにハサミを開きます。
   7. 舌骨のレベル（ 図3Aおよび3B）に胸骨柄から正中切開を作るために手術用ハサミで皮膚をカット。ぶっきらぼうに細い筋膜（点線を、解剖細かい止血剤と顎下腺とグレーフェ鉗子（ 図 3（b）及び（c）の間に図3（b））; 青矢印 ）。
      注：胸骨柄（ 図3C中の黒矢印）と気管（ 図3CにおけるT）は、この工程の後に見られます。
   8. 軟組織とグレーフェの鉗子で胸骨柄の右側に見られる皮膚を持ち、2時位置（ 図3C中の黄色の点線 ）に向けて筋膜下に止血剤を挿入し、解放するために止血鉗子の顎を開きます周辺組織から頸静脈。
   9. 右頸静脈（ 図3D、矢印 ） を露出させる手術用ハサミで2時の位置（ 図3C）に向かって筋膜、軟組織および皮膚をカット。
   10. 22 G針で1ミリリットル注射器を用いて300μlのローダミン6G溶液、およびその後の変化 - 約200を描きますそれに30 G針。
       注：これは、その微細な先端の損傷から30 G針を保護します。直接チップを損傷することはありません30 G針を有するローダミン6Gソリューションを描きます。しかし、誤って容器の壁をタッチすると、注入が困難になる可能性がある、破損の原因となります。
   11. ゆっくりとローダミン6G液を押し出すことにより、30 G針をフラッシュし、空気の泡が注射器や針に残っていないことを確認してください。注射のための100μlのローダミン6Gのソリューションをしてください。
   12. ベンド2 -頸静脈への深すぎる針を挿入防止し、より容易に制御（ 図3D）の注入を行います針ホルダと90°の角度に針の3ミリメートルの先端。
   13. 血小板を標識するために、右頸静脈にローダミン6G液を注入します。 injection.Af中に別の手でグレーフェの鉗子で片手での注射器と針を保持し、注射器を安定させた位置に針を維持するために、ター注入、出血を避けるためにグレーフェの鉗子で注射部位をクランプします。
   14. 止血剤の顎を開き、注射部位の血管壁をクランプするグレーフェ鉗子の下でそれを挿入し、6-0縫合糸で注射部位を連結。
       注：ステップ2.1.15の代替として、出血を停止します2分間指で注射部位に圧力を加えます。しかしながら、この方法は、さらに、原因注射部位における凝血塊が誤って削除された場合、出血の危険性を有しています。
   15. ぶっきらぼうに止血剤とグレーフェの鉗子で左顎下腺の周りの軟部組織および筋膜を分析し、左胸鎖乳突筋（ 図3Eの青い矢印）を露出させるために7時の位置（ 図3E）に向かって腺を引きます。
   16. ぶっきらぼうに左胸鎖乳突筋と肩甲舌骨筋またはsternohy間の筋膜（ 図3E、点線）を解剖止血剤と気管の左サイトにあるoidの筋肉（ 図3E、緑の矢印 ）。
   17. 胸鎖乳突筋（ 図3Eの青い矢印）の中央下に6-0絹縫合糸（約15センチ）で針を渡し、一緒に縫合糸の両端を入れて、10時の位置に向かって横方向に縫合糸を引っ張ります。
       注：この手順は、胸鎖乳突筋の外側に配置されている左頸静脈の損傷を避けるために慎重に行われるべきです。
   18. ぶっきらぼうに胸鎖乳突筋を引き離した後、頸動脈（CA）（ 図3Fの矢印）を露出させるために、薄い胸骨舌骨筋および/ ​​または肩甲舌骨筋を分離します。必要に応じて胸骨舌骨筋および/または肩甲舌骨筋をカット。 CAを触れることなく、CAから軟組織を分離するために止血剤を使用して、
       注：CAは、迷走神経を伴っている、に見られる白い構造図3G（緑色の矢印）、およびほとんどの場合、それは薄い胸骨舌骨筋および/ ​​または（ 図3Fにある黄色の点線間）肩甲舌骨筋の下にあります。
   19. 迷走神経およびCAを回避しながら、CAの周りに横方向の筋膜を拾うために先端の細いピンセットを使用してCAと迷走神経の間の筋膜に穴をパンチするために、別の先端の細いピンセットを使用してください。
   20. 穴からフックをパスし、優しくCAを持ち上げ、その後、CAの下に先端の細い鉗子を置きます外膜軟部組織を除去するためにCAに沿って反対方向にフック鉗子を移動します。周囲の組織からのCA（ 図3H、青い矢印 ）の無料少なくとも〜5ミリメートルの長さ。
   21. フラットに黒いプラスチック製のコーヒースターラーの端を押して、バックグラウンド蛍光をブロックするには、3ミリメートル片にコーヒー攪拌機をクロスカットを入れ、その後、「U」字状のプラスチック（ 図3H、緑の2枚を取得するために倍の縁に沿って縦方向に切断矢印 ）。
   22. 生理食塩水で、この「U」形状のプラスチックの一枚をすすぎ、ピンセットでそれを保持し、静かにフック（ 図3H、緑の矢印 ）でCAを持ち上げながら、CAの下に置きます。すぐにCAを乾燥避けるために、生理食塩水の2-3滴を適用
2. リアルタイム録画ビデオ
   1. 顕微鏡ステージに一緒にマウスとプレート蓋を移し、10×水レンズの下で適切な位置に配置します。 10Xレンズと生理食塩水とCAとの間の空間を満たします。
   2. デジタルビデオ録画ソフトウェアアプリケーションを起動し、新しいファイルを起動し、それに応じて名前を付けます。正常な血管の画像を記録し、録画が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。
      注：記録のために、コンピュータにビデオ録画ソフトウェアを参照します。我々は、デジタルビデオ記録ソフトウェアを使用して、以下の説明は、本出願に基づいています。
      注：機械TRAので、UMAは、内皮を損傷し、血栓形成²⁰をもたらすことができる、前のFeCl ₃損傷に対する血管壁への外科的損傷がないことを確認する必要があります。障壁を形成し、のFeCl ₃誘発性損傷の影響を弱めることができるCAの周りに残存組織が ​​存在しないことを確認することも必要です。それは簡単に後からの経過時間に従ってビデオを分析することになりますレコードのフレーム番号を書き留めます。
   3. 10Xレンズのうち、プレートのふたでマウスを移動します。薄くて微細なチップを作り、慎重にCAの周囲に生理食塩水（CAには手を触れないでください）​​ならびに外科的分野の他の場所でブロットするためにそれを使用するためにペーパータオルの角を折ります。これは、使用のFeCl ₃溶液の希釈を回避することが重要です。
   4. 先端の細いピンセットを使用してのFeCl ₃溶液で飽和フィルター紙をピックアップし、CA上で直接それを置き、1分間のサイトにそれを維持します。
      注：TO血流や収穫正確なデータの援助の可視化は、近くに露出したCA（ 図3I）の先端部にろ紙を置き、後半で血液の流れを観察する（ 図3Iの緑色の矢印 ） が近位のサイトで短いセグメントを残します相（下記参照）。
   5. ろ紙を取り外します（この時点を「損傷後」の開始として定義される）および食塩水（少なくとも2ミリリットル）でCAをすすぎます。
   6. バック10Xレンズへのプレートのふたでマウスを置きます。血管を観察したビデオ画像を記録し始めます。記録の最初の分の終わりにビデオフレーム番号を書き留めます。
      注：血栓形成は、コンピュータ画面上または顕微鏡下でリアルタイムビデオ画像で観察される蛍光性血小板の蓄積によって識別されます。録画ビデオ画像すぐに戻って顕微鏡下でマウスを入れました。 Fを除去した後に最初の分の最後に記録を保管してくださいILTER紙。さらにイメージングのために（通常は損傷領域の中心である）傷害に関する情報を取得するために、遠位から近位のサイトに容器全体を観察し、その後、関心のある領域に焦点を当てます。
   7. 10秒最初の10分の実験の終了まで（ 例えば、3時05分に午前2時55分）した後、10秒ごとに他の分毎分のレコードビデオ画像。各記録が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。
      注：モデルのエンドポイントは、1）血流が> 30秒間停止したとき。または2）閉塞は損傷後30分で見られていない場合。この場合には、統計分析のために30分を使用します。初めに10ミリ秒のようにビデオ記録の露光時間を設定するので、血栓の上の血流を観察することが容易になります。血栓が​​大きくなると蛍光は、カメラのセンサーを飽和させる場合には、血栓上の血流を特定することが困難になります。この問題を解決するために、撮像CEを移動血流がまだ明確に観察することができる近位無傷のサイト（ 図3I、緑の矢印）にNTER。近位の非損傷部位に着目すると血流がより鮮明に観察することができるように、我々はまた、15または20ミリ秒に公開する時間を増やします。血流が停止する場合には、多数のより大きな細胞（白血球）は、血栓の近位の部位で血管壁に転が​​り始めます。大きな細胞の出現後3分 - フローは通常2以内に停止します。それが変更された場合、記録用紙に時間を公開書き留めます。正常な野生型C57BL6マウスを使用した場合には、通常、麻酔から実験の最後に約30分を要します。
      注意注記：正確なデータを与えることはありません、それは露光時間によって影響され、血流停止の印として白集約血小板血栓を使用しないでください。白い血塊は血管内腔を覆っ血流が（代表ビデオ1を参照）を中止したという意味ではありません。
   8. 実験の最後に、息や心拍を確認しなかった後に頸椎脱臼に続いて過剰摂取ケタミン/キシラジン（20分の200ミリグラム/キログラム）を使用して、マウスを安楽死させます。

3.のFeCl ₃誘発性腸間膜動脈/静脈血栓症モデル

1. セクション2.1.1で述べたように12週齢のC57BL6マウス - 8を麻酔。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。
2. 腹腔内に腸の蠕動運動を抑制するためにパパベリン溶液（合計0.4ミリグラム/マウス）を注入します。
3. 動物電気バリカンで首と腹部に毛皮を削除してください。脱毛クリームは必要ありません。
4. 15cmの組織培養プレートの蓋の上仰臥位でマウスを固定します。すべての足を確保するために、小さなテープ（2センチメートル×0.5センチ）の4個を使用してください。切歯を包み込むように4 -0縫合糸を使用し、ネックストレート（ 図2）を維持するために蓋に縫合糸の両端をテープで固定します。
5. 手順2.1.4に従ってください -2.1.15ラベル血小板へローダミン6Gの注入のための頸静脈を露出させます。
6. 剣状突起から手術用はさみ（ 図4A）を使用して、腹部下に皮膚を通して正中切開を行います。 （とも呼ばれる白線は、 図4A、矢印）が明らかであるとない血管を持っていないグレーフェのピンセットでは、約2持ち上げる途中腹膜を拾う- 、切断線下では腸を確認しない、3ミリメートル高いとオープン腹膜をカット縦方向に微細なハサミ（ 図4B）で。
7. 右側臥位にマウスを再固定します。腹部に近い半円形のアガロースゲルを置き、静かに腸を体外に出すとグレーフェ鉗子（ 図4C）でゲルの上に広げました。血栓症の実験（ 図4C、矢印 ）のための第二の枝を使用してください。
   注：腸を体外に出すのを助けるために止血鉗子やマイクロAdson鉗子を使用してください。傷つけないでください腸や血管。
8. 腸や血管の水分を保つために6滴の生理食塩水 - 5を配置します。顕微鏡のステージに一緒にプレートの蓋でマウスを移し、10×ドライレンズの下の適切な位置に配置します。
   注：空回腸膜は生理食塩水を保持することはできませんので、ドライレンズを使用してください。湿ったそれらを保つためにさらされた組織に生理食塩水をドロップすることを確認します。
9. 治療前腸間膜動脈と静脈の周囲に生理食塩水を吸い取ります。
10. 12.5％のFeCl ₃溶液で飽和フィルター紙をピックアップし、1分（ 図4D）のための腸間膜動脈と静脈の上に直接に配置する先端の細いピンセットを使用します。ろ紙を削除し、生理食塩水で負傷した腸間膜動脈と静脈をすすぎ（少なくとも2ミリリットル）（この時点は、「傷害後」の開始として定義されます）。
11. 10X乾燥レンズの下背板のふたでマウスを置きます。血管を観察し、RECを開始ORD映像2.2で述べたように）。
    注：この実験のエンドポイントは、1）血流が> 30秒間停止したとき。または2）閉塞が損傷後30分では見られない場合は、この場合、統計分析のために30分を使用します。
12. 実験の最後に、息と心臓の鼓動が確認されていない後に頸椎脱臼に続いて過剰摂取ケタミン/キシラジン（20分の200ミリグラム/キログラム）を使用して、マウスを安楽死させます。

結果

頸動脈血栓症モデル
C57BL6背景を持つマウスでは、我々は出発点として、1分間血管を治療するために、7.5％のFeCl _3を使用することをお勧めします。 7.5％のFeCl ₃の治療の下で、負傷したエリアと通常の血管壁の境界を容易に内皮層が著しく破損していたことを示唆している、（ オンラインビデオ1を参照して?...

ディスカッション

FeCl ₃ -誘発モデルは、血小板機能および血栓症^{7,8,16,19,31-33}上の遺伝子改変に関する貴重な情報を提供することができるだけでなく、貴重なツールとなりうる最も広く使用されている血栓症モデルの一つであり、アテローム血栓性疾患^11,17,34-37の治療および予防のための治療化合物および戦略を評価するため。ここでは、私たちの修正と、このモデルの改良を示し、抗?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14502-14	cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm	Fine Science Tools	11018-12	cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm	Fine Science Tools	14519-14	to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm	Fine Science Tools	13021-12	to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm	Fine Science Tools	11050-10	to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm	Fine Science Tools	11254-20	Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm	Fine Science Tools	11253-10	Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter	Fine Science Tools	10062-12	Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12061-02	Needle holders
Suture Thread 4-0	Fine Science Tools	18020-40	For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0	Fine Science Tools	18020-60	For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-03
rhodamine 6G	Sigma	83697-1G	To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous)	Sigma	12321	To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride	Sigma	P3510	To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes	Medline	111625	To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm	Fisher	09-720-004	For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm	Fisher	09-719D	To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad	Fisher	06-669-62	To sterilize the surgical site
Agarose	BioExpress	E-3120-500	To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope	Leica		Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached.	npi electronic GmbH		http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software	NorPix		https://www.norpix.com/