Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

Resumo

Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico _(FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.

Resumo

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl₃) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl₃-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introdução

trombose arterial (coágulo de sangue) é uma complicação comum de muitas doenças sistêmicas associadas à inflamação crônica, incluindo a aterosclerose, diabetes, obesidade, câncer e doenças reumatológicas auto-imunes crônicas. Trombos que ocorrem no tronco circulação arterial a partir inadequado ativação plaquetária, agregação e mecanismos coagulante subsequentes e estão implicados em ataques cardíacos, derrames e perda de extremidade. A parede do vaso é um sistema complexo que inclui vários tipos de células e é influenciada por uma multitude de factores extrínsecos, incluindo tensão de corte, as células sanguíneas, hormonas e citocinas, bem como a expressão de proteínas antioxidantes que circula na parede do vaso. Experiências in vitro não pode replicar neste ambiente complexo e, por conseguinte, em estudos in vivo utilizando modelos animais são críticos para permitir uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em doenças trombóticas.

Os ratos têm mostrado ter SIMmecanismos lhantes aos seres humanos em termos de trombose, aterosclerose, inflamação e diabetes ^1,2. Além disso, camundongos transgênicos e knockout podem ser criados para testar a função de produtos de genes específicos em uma fisiológica complexa ou ambiente patológico. Tais estudos imitar patologia humana e pode fornecer informações mecanicista importante relacionado à descoberta de novos caminhos e terapias, bem como fornecer detalhes importantes na caracterização de efeitos de drogas sobre a trombose.

Trombos arteriais patológicas ocorrer devido à lesão endotelial camada ou disfunção e a exposição do fluxo de sangue para a matriz subendotelial ^3,4. Vários modelos de trombose foram desenvolvidos para induzir esse dano endotelial tais como dano mecânico, dano oxidativo baseado em Bengal composto fotorreativa Rose e ferimentos de laser ^5. Neste espectro, cloreto férrico _(FeCl3) induzida por lesão vascular é um modelo amplamente usado de trombose. Este reagente quandoaplicada ao aspecto exterior dos navios induz danos oxidativos para células vasculares ^6-8, com a perda da protecção de células endoteliais a partir de plaquetas e componentes da cascata de coagulação circulantes. O modelo _FeCl3 é simples e sensível para ambos os anticoagulantes e anti-plaquetas drogas, e foi realizada em artérias carótida e femoral, veias jugulares e mesentérica e arteríolas cremastérico e vênulas em ratinhos, ratos, cobaias e coelhos ^6-15.

Um parâmetro mensurável neste modelo é o tempo decorrido de uma lesão para completar oclusão do vaso, medida como a cessação do fluxo sanguíneo com um medidor de fluxo de Doppler ou sob observação directa com ^6,7,9 microscopia intravital. Uma gama de tempos de entre 5 a 30 min tem sido relatada em diferentes estudos em ratinhos C57BL6 ^7-10,16, sugerindo que as concentrações de FeCl _3, tipos de anestesia, técnicas cirúrgicas, idade rato, fundo genómico, método de medição bfluxo lood, e outras variáveis ​​ambientais têm efeitos significativos neste modelo. Esta ampla variabilidade faz com que seja difícil comparar estudos de diferentes grupos de pesquisa e pode fazer a detecção de diferenças sutis difícil.

Com uma visão para minimizar tais variabilidades e estabelecer um uniforme reprodutível em sistema de modelo vivo, temos refinado o modelo de artéria carótida induzida por _FeCl3 que faz com que os dados altamente reproduzíveis com o mínimo de variação ^6-10,16-19. Neste artigo descrevemos e compartilhar as habilidades e relatar vários exemplos experimentais representativos que podem beneficiar a partir deste modelo.

Protocolo

Todos os procedimentos e manipulações de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Uso Comissões (IACUC) da The Cleveland Clinic, em conformidade com a política dos Estados Unidos Serviço de Saúde Pública sobre o cuidado humano e uso de animais, e o Guia NIH para o Cuidado e uso de Animais de laboratório.

1. Preparações:

1. Corante fluorescente para a rotulagem Plaquetas
   1. Preparar solução de rodamina 6G, 0,5 mg / ml, em solução salina e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um.
2. _FeCl3 Solução
   1. Adicione uma solução de fresca de 30% FeCl ₃ (anidro, é igual a 1,85 m) em água pura, e filtrar com filtro de 0,45 um. Prepare 5 ml fresco _FeCl3 solução na concentração desejada [por exemplo, 2,5% (0,154 m), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) e 12,5% (0,771 M)], através diluindo a solução de 30% _FeCl3 com i águaNA 6 cm de placa de cultura de tecidos e manter a tampa fechada.
      NOTA: O uso da placa de cultura faz com que seja mais fácil de pegar o papel de filtro saturado com solução de FeCl ₃ do que para buscá-lo a partir de um recipiente estreito, como um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. FeCl3 é extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas e bata de laboratório etc., equipamento de protecção, devem ser sempre tomadas.
3. Papéis de filtro
   1. Corte o papel de filtro a 1 mm x 2 mm de tamanho. Soak suficiente peças de papel de filtro de corte na solução de _FeCl3 no mesmo prato.
4. Solução de cloridrato de papaverina
   1. Preparar a solução de cloridrato de papaverina (25 mg / ml) em água e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um.
5. Gel de agarose
   1. Preparar 2% de gel de agarose em PBS ou solução salina em 6 cavidades da placa de cultura de tecidos, ~ 1 cm de espessura, e Cut-lo para semi-círculo com ~ 3 cm de diâmetro.

2. _FeCl3 Induced carótida Injury Thrombosis Modelo

1. Procedimentos cirúrgicos para o modelo de trombose
   1. Use 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade (ou outras estirpes como necessário). Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) via injecção intraperitoneal. Confirmar a profundidade da anestesia por beliscar dedo do pé.
      NOTA: Este quantidade de cetamina / xilazina é suficiente para manter o animal em anestesia estável e sem dor (resposta ao dedo do pé que comprime a) durante pelo menos 1 h.
   2. Retire a pele no pescoço e parte superior do tórax com uma pequena clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário. Aplicar neutra pomada de petróleo sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia.
   3. Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use uma fita longa (~ 10 cm) para garantir hinmembros d e parte inferior do corpo, e dois pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 centímetros) para fixar as pernas dianteiras. Use um fio de sutura 4-0 para envolver os incisivos, fita as duas extremidades da sutura com a tampa para manter o pescoço do rato em linha reta (Figura 2).
   4. Coloque placa com cabeça de rato na direcção do operador sob uma fonte de luz cirúrgica.
   5. Esterilizar o local da cirurgia com a almofada de álcool. Use as Micro-Adson pinça para segurar a pele e usar uma tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão (2-3 mm).
   6. Segurar a pele da incisão com uma pinça e inserir as tesouras cirúrgicas, com as maxilas fechadas dentro da incisão. Empurrar a tesoura por via subcutânea em direção ao manubrium ou o queixo, em seguida, abra a tesoura para libertar a pele da camada subcutânea.
   7. Cortar a pele com as tesouras cirúrgicas para fazer uma incisão na linha média a partir da fúrcula ao nível do osso hióide (Figura 3A e 3B). Sem rodeios dissecar a fáscia fina (linha pontilhada, em Figura 3B) entre as glândulas submandibular com uma pinça hemostática fina e uma pinça Graefe (Figura 3B e 3C; setas azuis).
      NOTA: O fúrcula (seta preta na Figura 3C) e a traqueia (T na figura 3C) será visto após este passo.
   8. Segurar o tecido mole e pele visto na parte direita da manubrium com a pinça Graefe, inserir a pinça hemostática sob a fáscia para a posição 2:00 (linha pontilhada na Figura 3C amarelo), abrir as maxilas da pinça hemostática para o libertar veia jugular do tecido circundante.
   9. Cortar o fáscia, tecidos moles e da pele para a posição 2:00 (Figura 3C) com as tesouras cirúrgicas para expor a veia jugular direita (Figura 3D, seta).
   10. Desenhe sobre 200-300 ul rodamina 6G solução utilizando uma seringa de 1 ml com 22 G agulha, e depois mudança-lo a 30 g de agulhas.
       NOTA: Isso protege a agulha 30 G de dano da sua ponta fina. Diretamente desenho da solução rodamina 6G com a agulha 30 G não vai danificar a ponta; no entanto encostar na parede do recipiente acidentalmente irá causar danos, o que pode fazer a injeção difícil.
   11. Lave a agulha 30 G lentamente empurrando para fora a solução 6G rodamina, certifique-se não há bolhas de ar permanecer na seringa ou a agulha. Mantenha 100 ul rodamina 6G solução para injecção.
   12. Curva 2 - 3 mm da ponta da agulha para um ângulo de 90 ° com o suporte de agulha, o que irá impedir a inserção da agulha é muito profundo para a veia jugular e faz a injecção mais facilmente controlada (Figura 3D).
   13. Injectar a solução rodamina 6G na veia jugular direito de plaquetas de etiqueta. Para estabilizar a seringa e manter a agulha na posição, segure a seringa com uma mão e a agulha com a pinça Graefe com a outra mão durante o injection.Afinjecção ter, fixar o local da injecção com a pinça Graefe para evitar sangramento.
   14. Abrir as maxilas da pinça hemostática e inseri-lo sob a pinça Graefe para fixar a parede do vaso no local da injecção, e depois ligar o local de injecção com um fio de sutura 6-0.
       NOTA: Como uma alternativa de passo 2.1.15, aplicando pressão no local da injecção com um dedo por 2 min vai parar o sangramento; No entanto, este método tem o risco de provocar sangramento adicional se o coágulo no local da injecção é removido acidentalmente.
   15. Sem rodeios dissecar o tecido mole e fáscia em torno da glândula submandibular esquerda com a pinça hemostática e as pinças Graefe e puxe a glândula para a posição 07:00 (Figura 3E) para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo (seta azul na Figura 3E).
   16. Sem rodeios dissecar a fáscia (Figura 3E, linha pontilhada) entre o músculo esternocleidomastóideo esquerdo eo músculo omo-hióideo ou sternohymuscular oid (Figura 3E, seta verde) localizada no sítio esquerda da traqueia com a pinça hemostática.
   17. Passe uma agulha com 6-0 sutura de seda (cerca de 15 cm de comprimento), sob a meio do músculo esternocleidomastóideo (seta azul na Figura 3E), colocar as duas extremidades da sutura juntos e puxar a sutura lateralmente em direção à posição de 10 horas .
       NOTA: Este procedimento deve ser realizado com cuidado para evitar lesões da veia jugular esquerda, que está localizado fora do músculo esternocleidomastóideo.
   18. Sem rodeios separar o músculo esterno fina e / ou músculo omo-hióideo para expor a artéria carótida (CA) (Figura 3F seta) após se afastar do músculo esternocleidomastóideo. Corte o músculo esterno e / ou músculo omo-hióideo, se necessário. Use a pinça hemostática para separar o tecido mole da CA sem tocar no CA.
       NOTA: CA é acompanhada pelo nervo vago, a estrutura em branco considerado Figura 3G (seta verde), e na maior parte dos casos, está sob o músculo esterno fina e / ou músculo omo-hióideo (entre as linhas pontilhadas amarelas na Figura 3F).
   19. Use uma pinça fina ponta para pegar a fáscia lateral, em torno da CA, evitando o nervo vago e CA. Use outro pinça de ponta fina para perfurar um buraco na fáscia entre a CA e nervo vago.
   20. Passe o gancho através do buraco e levante cuidadosamente a CA, e em seguida, coloque a pinça de ponta fina sob a CA. Mova o gancho e uma pinça em sentidos opostos ao longo da CA para retirar tecidos moles adventícia. Livre mm de comprimento, pelo menos, ~ 5 de CA (Figura 3H, seta azul) do tecido circundante.
   21. Para bloquear a fluorescência de fundo, pressione a extremidade de um café agitador de plástico preto para plana, cortam o agitador do café em uma peça a 3 mm, e, em seguida, cortado longitudinalmente ao longo das arestas de dobragem para obter duas peças de "U" de plástico (Figura 3H, verde seta).
   22. Lavar uma peça desse "U" forma plástica com solução salina e segurá-la com uma pinça e colocá-lo sob a CA enquanto suavemente levantar o CA com o gancho (Figura 3H, seta verde). Aplique imediatamente 2-3 gotas de solução salina para evitar a secagem da CA.
2. Em tempo real de gravação de vídeo
   1. Transferir a tampa do mouse, placa juntos para o estágio do microscópio e coloque em uma posição apropriada sob a lente de água 10X. Preencher o espaço entre a lente e a 10X CA com solução salina.
   2. Inicie a aplicação do software de gravação de vídeo digital, e lançar um novo arquivo e nomeá-lo em conformidade. Gravar imagens normais dos vasos e anote o número do quadro quando a gravação de vídeo é interrompida.
      NOTA: Referência do software de gravação de vídeo do computador para a gravação. Nós usamos o software de gravação de vídeo digital e as seguintes descrições são baseadas nesta aplicação.
      NOTA: Uma vez que tra mecânicaUma pode lesionar o endotélio e levar à formação de trombos ^20, que é necessário para confirmar que não há nenhuma lesão cirúrgica da parede do reservatório antes da lesão _FeCl3. É também necessário para confirmar que não há tecido à volta da CA, o qual pode formar uma barreira e atenuar o efeito de lesão induzida por _FeCl3. Anote o número do quadro dos registros fará com que seja fácil de analisar os vídeos de acordo tempos decorridos mais tarde.
   3. Mova o rato com tampa placa de fora da lente de 10X. Dobre um canto de uma toalha de papel para fazer uma ponta fina e fina e usá-lo para apagar cuidadosamente a solução salina em torno do CA (evitar tocar CA), bem como em outros lugares do campo cirúrgico. Isto é importante para evitar a diluição da solução de _FeCl3 utilizado.
   4. Use uma pinça fina ponta e pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de _FeCl3 e colocá-lo diretamente no CA e mantê-lo no local durante 1 min.
      NOTA: TO visualização auxílio dos dados precisos da corrente sanguínea e de colheita, colocar o papel de filtro perto da extremidade distal do exposto CA (Figura 3I) e deixar um segmento curto no local proximal (seta verde na Figura 3I) para observar o fluxo sanguíneo na tarde fase (ver abaixo).
   5. Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de "após a lesão") e enxaguar a AC com solução salina (pelo menos 2 ml).
   6. Coloque o mouse com a placa da tampa de volta para a lente 10X; observar o navio e começar a imagens de vídeo de discos. Anote o número de quadros de vídeo no final do primeiro minuto de gravação.
      NOTA: A formação de trombos é identificado pela acumulação das plaquetas fluorescentes, o que é observado em imagens de vídeo em tempo real no ecrã de computador ou sob microscópio. Gravação de imagens de vídeo imediatamente depois de colocar o mouse de volta sob o microscópio. Manter gravação para o final do primeiro minuto após a remoção do fpapel ILTER. Observar todo o recipiente a partir do distai para os locais proximais para obter dados sobre a lesão, e, em seguida, concentrar-se na área de interesse (normalmente é o centro da área lesionada) para mais de imagem.
   7. Imagens de vídeo gravada durante 10 seg a cada minuto durante os primeiros 10 minutos (por exemplo, 02:55 - 03:05) e, em seguida, 10 segundos cada minuto até ao final da experiência. Anote os números de quadro quando cada gravação é interrompida.
      NOTA: Os pontos finais do modelo são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante> 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão. Neste caso, use 30 min para análise estatística. Definir tempo de exposição da gravação de vídeo, como 10 ms, no início, por isso vai ser fácil de observar o fluxo de sangue através da trombos. Quando os trombos se tornar grande e a fluorescência satura o sensor da câmera, torna-se difícil identificar o fluxo de sangue ao longo de trombos. Para resolver este problema, mova o ce de imagemnter ao proximal local ileso (Figura 3I, seta verde), onde o fluxo de sangue pode ainda ser claramente observado. Nós também aumentar o Exposé Tempo para 15 ou 20 ms quando o foco sobre o local lesionado-un proximal, de modo que o fluxo de sangue pode ser observado mais claramente. Quando o fluxo sanguíneo cessará, numerosas células maiores (leucócitos) começam a rolar sobre a parede do vaso no sítio proximal do trombo. Fluxo geralmente pára dentro de 2-3 minutos após o aparecimento de grandes células. Anote o tempo poderá expor na folha de gravação, se ele for alterado. É geralmente leva cerca de 30 min a partir da anestesia ao final da experiência, se foram usados ​​os ratinhos C57BL6 tipo selvagem normais.
      CUIDADO NOTA: Não use o coágulo de plaquetas agregadas branco como o sinal da cessação do fluxo sanguíneo, o que não vai dar uma de dados precisos e é afetado pelo tempo de exposição. O coágulo branco coberto do lúmen do vaso não significa fluxo sanguíneo cessou (veja o vídeo representante 1).
   8. No final do experimento, a eutanásia os ratos usando overdose de cetamina / xilazina (mg 200/20 / Kg), seguido por deslocamento cervical após a confirmação de nenhuma respiração e os batimentos cardíacos.

3. _FeCl3 Induced artéria mesentérica / Trombose Venosa Modelo

1. Anestesiar 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade, como mencionado no ponto 2.1.1. Aplicar vet pomada sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia.
2. Injectar solução de papaverina (total de 0,4 mg / murganho) por via intraperitoneal para inibir o peristaltismo intestinal.
3. Retire a pele no pescoço e abdómen com um clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário.
4. Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use quatro pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 cm) para garantir todas as pernas. Utilize uma sutura 4 -0 para envolver em torno dos incisivos, fita as duas extremidades do fio de sutura para a tampa para manter o pescoço linear (Figura 2).
5. Siga os procedimentos 2.1.4 -2.1.15 para expor a veia jugular para a injecção de rodamina 6G a plaquetas etiqueta.
6. Realizar uma incisão na linha média através da pele do xifóide ao abdômen inferior usando as tesouras cirúrgicas (Figura 4A). Pegar o peritônio meio (também chamado de linha alba, Figura 4A, seta) com uma pinça Graefe, que é clara e não tem vasos sanguíneos, levante cerca de 2-3 mm de altura, confirme nenhuma intestino sob a linha de corte, e cortar o peritônio aberta longitudinalmente com as tesouras finas (Figura 4B).
7. Re-garantir os ratos para decúbito lateral direito. Colocar o gel de agarose semi-círculo para o abdómen, e suavemente exteriorizar os intestinos e espalhá-la no topo do gel com a pinça Graefe (Figura 4C). Use as segundas ramificações para o experimento trombose (Figura 4C, seta).
   NOTA: Utilize a pinça hemostática ou pinça Micro-Adson para ajudar a exteriorizar os intestinos. Evitar ferir ado intestino e o recipiente.
8. Colocar 5-6 gotas de solução salina para manter a humidade do intestino e vasos. Transferir o mouse com a tampa placa juntos para o estágio do microscópio e coloque na posição apropriada sob a lente seca 10X.
   NOTA: Use uma lente seca, porque a membrana jejunoileal não pode segurar solução salina. Certifique-se a cair solução salina sobre os tecidos expostos a mantê-los úmidos.
9. Seque a solução salina à volta da artéria mesentérica e na veia antes do tratamento.
10. Use uma pinça fina ponta para pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de 12,5% _FeCl3 e colocá-lo diretamente na artéria mesentérica e veia durante 1 min (Figura 4D). Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de "após a lesão") e enxaguamento a artéria mesentérica e na veia feridos com solução salina (pelo menos 2 ml).
11. Coloque o mouse com placa de tampa de volta sob a lente seca 10X; observar os vasos e começar a recimagens de vídeo ord como mencionado no 2.2).
    NOTA: Os pontos finais desta experiência são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante> 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão, e, neste caso, usar 30 minutos para análise estatística.
12. No final do experimento, a eutanásia os ratos usando overdose de cetamina / xilazina (mg 200/20 / Kg), seguido por deslocamento cervical após nenhuma respiração e batimentos cardíacos são confirmadas.

Resultados

Carótida Thrombosis Modelo
Em ratos com C57BL6 fundo, recomendamos a utilização de 7,5% _FeCl3 para tratar o navio durante 1 min como ponto de partida. Sob o tratamento de 7,5% _FeCl3, fronteiras da área lesada e parede normal do vaso são facilmente identificados sob o microscópio (Veja o vídeo on-line 1), sugerindo que a camada endotelial foi significativamente danificada. Os trombos formados imediatamente após _Fe...

Discussão

O _FeCl3 induzida pelo modelo é um dos modelos mais amplamente utilizados de trombose, que não só pode fornecer informações valiosas sobre as modificações genéticas na função das plaquetas e trombose ^{7,8,16,19,31-33,} mas também pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação de compostos terapêuticos e estratégias para o tratamento e prevenção das doenças aterotrombóticas ^11,17,34-37. Aqui temos mostrado nossas modificações e aperfeiçoamentos do presente modelo e mo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14502-14	cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm	Fine Science Tools	11018-12	cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm	Fine Science Tools	14519-14	to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm	Fine Science Tools	13021-12	to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm	Fine Science Tools	11050-10	to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm	Fine Science Tools	11254-20	Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm	Fine Science Tools	11253-10	Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter	Fine Science Tools	10062-12	Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12061-02	Needle holders
Suture Thread 4-0	Fine Science Tools	18020-40	For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0	Fine Science Tools	18020-60	For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-03
rhodamine 6G	Sigma	83697-1G	To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous)	Sigma	12321	To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride	Sigma	P3510	To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes	Medline	111625	To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm	Fisher	09-720-004	For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm	Fisher	09-719D	To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad	Fisher	06-669-62	To sterilize the surgical site
Agarose	BioExpress	E-3120-500	To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope	Leica		Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached.	npi electronic GmbH		http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software	NorPix		https://www.norpix.com/