JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.

Abstract

الجينات الحذف يلعب دورا هاما في تحليل وظيفة الجين. واحدة من أكثر الوسائل فعالية لتعطيل الجينات بطريقة هادفة هو استبدال الجينات كامل مع علامة اختيار عبر إعادة التركيب مثلي. خلال إعادة التركيب مثلي، وتبادل الحمض النووي يحدث بين متواليات مع تشابه عالية. لذلك، تسلسل الجينوم الخطية المحيطة الجينات المستهدفة يمكن استخدامها لوجه التحديد توجيه علامة اختيار إلى الموقع التكامل المنشود. نهايات حادة للبناء حذف تفعيل نظم إصلاح الحمض النووي للخلية، وبالتالي تعزيز التكامل بين بناء إما عن طريق إعادة التركيب مثلي أو من خلال الانضمام إلى غير المتجانسة نهاية. في الكائنات الحية مع إعادة التركيب مثلي كفاءة، يمكن أن معدل حذف الجينات نجاح تصل إلى أكثر من 50٪ صنع هذه الاستراتيجية قيما نظام تعطيل الجين. فطر التفحم السوادية الذروية هو الكائنات الحية الدقيقة نموذج حقيقية النواة تظهر مثل recombinat مثلي كفاءةأيون. من إزاء 6،900 الجينات، وكثير اتسمت ظيفيا مع مساعدة من المسوخ الحذف، وتكرار فشل محاولات استبدال الجينات نقاط في وظيفة أساسية من الجين. توصيف لاحق من وظيفة الجين عن طريق وضع علامات مع علامات الفلورسنت أو طفرات من المجالات توقع يعتمد أيضا على تبادل الحمض النووي عبر إعادة التركيب مثلي. هنا، نقدم U. الذروية استراتيجية الجيل سلالة بالتفصيل باستخدام أبسط مثال، حذف الجينات.

Introduction

السوادية الذروية هو نموذج الفطريات الممرضة للنبات التي تمت دراستها على نطاق واسع لعقود 1،2. ويوجد في اثنين الأشكال التضاريسية، لذلك، مرحلة تشبه الخميرة غير المسببة للأمراض والخيطية، شكل المعدية 3. وقدمت الاكتشافات اختراق عالمية مثل آليات إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي المتجانسة في مرحلة النمو تشبه الخميرة من هذه الفطريات 4. وعلاوة على ذلك، والتحول المورفولوجي للخيوط والفوعة العوامل المعدية الهامة للعدوى وجيدا تتميز 5،6. المعرفة الجزيئية زيادة عن علم الأحياء والفوعة من هذه الفطريات التفحم تعتمد على استراتيجية استبدال الجينات مباشر 7-9 بدعم من الجينوم الشرح ممتاز 10 وسهولة علم الوراثة العكسية باستخدام، على سبيل المثال، منظمة تنظيما جيدا لجمع البلازميد في معهدنا (HTTP : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). موحدة، فحوصات العدوى السريعة في الذرة الصورةالسماح eedlings دراسات تفصيلية المرضية عوامل 11.

جينوم U. الذروية يحتوي على حوالي 6900 الجينات 10. لدراسة وظيفتها، ويمكن حذف منفردة أو مجتمعة بسبب نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. المناطق المحيطة من حوالي 1 كيلو بايت تحتوي على نهايات مثلي تماما مثالية لمعدلات إعادة التركيب مثلي أكبر من 50٪، ولكن بالفعل 250 نقطة أساس مع نهايات غير المتجانسة تسمح بعض درجة من التكامل الصحيح للبناء 9. حاليا، خمسة أشرطة مقاومة مختلفة، hygR، cbxR، natR، G418R، وphleoR التوسط المقاومة ضد هيغروميسين، carboxin، nourseothricin، G418 وphleomycin، ويعمل لتحديد لtransformants 7،9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير المقاومة هيغروميسين إلى شريط كاسيت القابلة لإعادة التدوير (FRT-hygR) التي يمكن إزالتها عن طريق التعبير عابرة من recombinase FLP مغاير 12. وهذا يسمح إزالة كاسيت المقاومة، وبالتالي في نظرية التعديلات الجينية غير محدودة. Phleomycin غير مطفرة 13، بحيث مع أشرطة جديدة، ولا سيما hygR كاسيت القابلة لإعادة التدوير، واستخدام phleoR آخذ في التناقص. ومن ثم لا يمكن المسوخ رباعية توليد باستخدام أربعة أشرطة أخرى، ولكن لالمسوخ خماسية، ينصح نظام FRT-hygR 14.

وقد تم نقل هذه الاستراتيجية حذف الجينات العامة بنجاح الفطريات التفحم أخرى مثل Sporisorium reilianum 15، U. hordei 16، أو U. esculenta 17، وبالتالي توفر إمكانية لمزيد من التطبيقات في الكائنات بعد المستعصية وراثيا مع نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة. وعلاوة على ذلك، والكائنات التي تفتقر إلى إعادة التركيب مثلي يمكن تعديلها لتحسين الهندسة الوراثية كما يدل على ذلك حذف الجينات المسؤولة عن غير مثلي أوند-في الانضمام العصيباء المبوغة crassa 18،19.

نحن هنا وصف الاستراتيجية حذف الجينات التي تنشر لU. الذروية 7،9 في التفاصيل التجريبية مع التركيز على التحقق السريع والدقيق للمرشحين. وكمثال على ذلك، ونحن نستخدم chitinases الفطرية وتصوير جيل من المسوخ واحدة وكذلك حذف عدة سلالات 20،21. Chitinases أمثلة مثيرة للاهتمام، لأنها تعمل على كيتين في جدار الخلية جامدة. مطلوب إعادة جدار الخلية لتغيرات شكلية أثناء انقسام الخلية، والتحول إلى النمو الخيطية، وتشكيل بوغ. وبالتالي، في المسوخ الحذف يمكن توقع الظواهر طوال دورة الحياة.

Protocol

1. توليد حذف التركيبات

  1. توليد البلازميد التي تحتوي على بناء الحذف (الشكل 1) يتألف من 1 كيلوبايت الجناح منها المنبع (UF) والمصب الجناح (DF) كل والكاسيت المقاومة المناسب يحيط بها تقييد مواقع قطع حادة.
    ملاحظة: أي استراتيجية الاستنساخ يمكن استخدامها (لاستنساخ أنظر المرجع 22) نوصي جولدن جيت استنساخ لهذه البلازميدات 9.
  2. استئصال الحذف بناء من البلازميد باستخدام قطع حادة للحصول على 1 ميكروغرام الحمض النووي للحذف بناء 9. تنقية بناء الحذف للقضاء على انزيم والعازلة 22 على سبيل المثال باستخدام الكواشف التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: العمود الفقري ناقلات يمكن أن يبقى في الخليط التحول.

2. إعداد جبلة مجردة

ملاحظة: حافظ على ظروف معقمة خلال جميع الأوقات من البريدxperiment. جدار الخلية هو حاجز وقائي قوي يحد من وصول جزيئات إلى غشاء البلازما. للسماح امتصاص الحمض النووي الذي يحتوي على بناء الحذف، يحتاج جدار الخلية لا بد من إزالة جدار الخلية المهينة الانزيمات في رد فعل protoplasting. خطوات حاسمة في إعداد البروتوبلازم هي 1) الاستقرار الاسموزي من المتوسط ​​و 2) تجنب الإجهاد الميكانيكي على جبلة مجردة.

  1. مارك 2 مل أنابيب مع قاع مستديرة لتجميد جبلة مجردة وتبريد عليهم في -20 درجة مئوية. بدء الثقافة قبل في 3 مل YEPS الضوء من لوحة جديدة من سلالة مع الخلفية الوراثية المطلوبة. احتضان على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: سلالة يمكن أن يكون solopathogenic سلالة SG200 10، سلالات wildtype، سلالات اختبار مثل AB33 23، أو أي خلفية متحولة لجيل من المسوخ مزدوجة. تأكد من أن سلالة خال من المقاومة المطلوبة.
  2. تمييع الثقافة في 50 مل YEPS الضوء في إف إل أي إس حيرةك واحتضان على شاكر المداري عند 28 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: مضاعفة الوقت حوالي 2 ساعة لسلالات wildtype. سماح ثلاث الازدواجية الحد الأدنى.
  3. تنمو حتى مرحلة الأسي. تأكد من أن الكثافة الضوئية، ويقاس عند طول موجي 600 نانومتر (OD 600)، حوالي 0.8 (0،6-1،0 غير مقبول). وOD 600 من 1.0 يتوافق مع حوالي 1 إلى 2 × 10 7 U. الذروية خلايا لكل مل.
  4. فحص الخلايا للتلوث تحت المجهر. استخدام التكبير 40X. بيليه خلايا كاملة ثقافة 50 مل لمدة 5 دقائق، 1500 x ج وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 25 مل سيترات الصوديوم، محلول السوربيتول (SCS)، الطرد المركزي 5 دقائق، 1500 x ج، وتجاهل طاف.
    ملاحظة: يمكن تحديد الملوثات البكتيرية مثل خلايا صغيرة، وغالبا ما تتحرك. ويمكن تحديد التلوث الفطرية على أساس شكل الخلية أو حجم مختلف بالمقارنة مع السيجار على شكل خلايا U. الذروية.
  5. خلال CENtrifugation إعداد حل protoplasting (12.5 ملغ / مل الترايكوديرما الناشر الإنزيمات، في SCS، وإعداد 3 مل لكل بيليه الخلية؛ تصفية تعقيم من خلال مرشح 22 ميكرون، الحل يجب أن تكون طازجة للنشاط الأنزيمي الأمثل). SCS هو استقرار الاسموزي لمنع تمزق البروتوبلازم على إزالة جدار الخلية.
  6. Resuspend وبيليه في 2 مل protoplasting حل. احتضان لمدة 5 إلى 20 دقائق على RT والاختيار تحت المجهر حتى 30 إلى 40٪ من الخلايا هي جولة أو ما شابه pinheads (الشكل 2).
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد من الآن فصاعدا، والتعامل مع جبلة مجردة مع الرعاية!
  7. غسل 3X في 10 مل الباردة (4 درجة مئوية) SCS، الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
  8. Resuspend وبيليه في 10 مل السوربيتول البارد، TrisHCl، CaCl 2 الحل (STC)، وتدور في 1000 x ج لمدة 5 دقائق، ونبذ طاف. resuspend الكرية في 1 مل البارد STC، وجعل 100 مكل في أنابيب تبريد. تجميد aliquots في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. التحول من U. الذروية

ملاحظة: التحول من U. جبلة مجردة الذروية تعتمد على البولي ايثيلين جلايكول (PEG) بوساطة طريقة التحول، التي هي بسيطة من الناحية الفنية وبدلا من Electroporation للأو التحول biolistic لا يتطلب معدات متخصصة.

  1. إعداد لوحات اختيار الطبقات اثنين (2 لوحات لكل رد فعل التحول). تحتوي الطبقة السفلى من المضادات الحيوية في تركيز الضعف. الماصة 12 مل من RegLight تحتوي على 400 ميكروغرام / مل هيغروميسين (أو 300 ميكروغرام / مل nourseothricin أو 4 ميكروغرام / carboxin مل أو 1 ملغ / مل G418) في طبق بتري. تجنب الفقاعات.
    ملاحظة: لوحات طبقة القاع قد يتم تخزين بضعة أيام في 4 درجات مئوية، ولكن إعداد الطبقة العليا حديثا خلال التحول (أنظر أدناه).
  2. جبلة مجردة ذوبان الجليد على الجليد (1 أنبوب / التحول). إضافة 1 ميكرولتر الهيبارين (15 ملغ / مل). إضافة 1 ميكروغرام الحمض النووي (خطي بناء) أو 10 ميكرولتر H 2 O (التحكم في المياه). احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  3. خلال هذا الوقت، للطبقة العليا نشر 12 مل المسال RegLight (يغلي وباردة إلى 60 درجة مئوية) على لوحة أسفل RegLight.
    ملاحظة: لا يحتوي هذا طبقة المضادات الحيوية.
  4. إضافة 500 ميكرولتر STC / PEG (البولي ايثيلين جلايكول) إلى أنبوب التحول (3. 2) وتخلط بعناية من قبل قلب الأنبوب. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
  5. توزيع كل رد فعل التحول على اثنين من لوحات RegLight الطبقات اثنين. نشر بعناية وببطء مع الماصة الزجاج. احتضان لوحات تستقيم عند 28 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام حتى تنمو transformants كما المستعمرات. الحصول على حوالي 100-200 المستعمرات في لوحة.
    ملاحظة: قد يكون سبب انخفاض أرقام التي كتبها جبلة مجردة "السيئة" التي تحتوي على أي الكثير من جدار الخلية، وبالتالي لا يمكن أن يستغرق الحمض النووي أو لا يمكن أن تتجدد. الأول يمكن اختبارها من قبل التحول مع البلازميد الذاتي تكرار، وهذا الأخير عن طريق اختبار تجديد على لوحات من دون المضادات الحيوية.
    6. <لى> إعداد YEPS الضوء لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة في 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين (أو 150 ميكروغرام / مل nourseothricin أو 2 ميكروغرام / carboxin مل أو 500 ميكروغرام / مل G418، وهذه التركيزات نصف متساو من تلك المستخدمة لوحات أسفل). إعادة تنقية لا يقل عن 24 المستعمرات المحولة المفترضة على هذه اللوحات. ويجب الحصول على المستعمرات واحد. في نفس خط المهلة سلالة الأصلي على وسائل الاعلام غير انتقائي.
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.

4. التأكيد على حذف الأحداث الصحيحة

ملاحظة: يتم التحقق من الطفرات في إجراء ثلاث خطوات (الشكل 1). أولا، يتم استبعاد المرشحين التي تحتوي على نسخة wildtype من الجينات التي PCR. ثانيا، يتم التحقق من تكامل الكاسيت المقاومة في مكان من قبل PCR. ثالثا، يتم التحقق من تكامل الكاسيت المقاومة فقط في مكان المطلوب عن طريق تحليل الجنوبي لطخة. التحقق سلالة الدقيق هو ESSEntial، بحيث الظواهر متحولة ترتبط حقا مع الحذف.

  1. أولا التشخيص PCR 20
    1. تصميم الاشعال الاقتران في الجين المراد حذفه تلك النتيجة في منتج من 250-600 سنة مضت (الشكل 1). هذه المنتجات الصغيرة من السهل تضخيم في مستعمرة PCR، وطويلة بما فيه الكفاية للكشف في الكهربائي للهلام القياسية.
    2. لكل مرشح وسلالة الأصلي كما تحكم إيجابية، و resuspend قليلا (مبلغ رأس الدبوس) من المواد خلية من مستعمرة واحدة مع المسواك في 20 ميكرولتر 0.02 M هيدروكسيد الصوديوم. في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: استخدم مستعمرات جديدة. إذا لوحات أقدم من 1 أسبوع إعادة متتالية للحصول على مستعمرة جديدة.
    3. استخدام 1 ميكرولتر من تعليق خلية لPCR على الفور. تشغيل تفاعل PCR القياسية وتحليل الشظايا الناتجة عن ذلك.
      ملاحظة: هذه العينات لا يمكن تخزينها.
      ملاحظة: اختبارات هذا PCR لوجود الجين wildtype وبالتالي تتيح التعرف السريع على و cand سلبيidates التي لم يتم استبدال الجينات في المصالح. سيتم تجاهل استنساخ ذات العوائد العصابات في هذا رد فعل PCR. يجب على أي حال أن تقوم واحدة من هذه استنساخ السلبي على طول كعنصر تحكم سلبية إضافية. المرشحين دون منتج PCR يتعين مواصلة تحليلها. لجينات دون آثار ضارة يجب أن يحتوي على ما يقرب من نصف المرشحين الجين wildtype، في حين أن النصف الآخر لا يؤدي إلى الفرقة. هذا من شأنه أن تتوافق مع معدل إعادة التركيب مثلي من 50٪.
  2. التشخيص PCR الثانية
    1. إعداد الحمض النووي الجيني.
      ملاحظة: الجينوم الحمض النووي (gDNA) يمكن إعدادها باستخدام اثنين من بروتوكولات مختلفة. الأول ينطوي الكواشف السامة مثل الفينول والكلوروفورم، وبالتالي، ينبغي التعامل معها إلا من خلال الباحثين من ذوي الخبرة (وصفها في 4.2.1.1 ل4.2.1.5) في حين أن الثاني يمكن أيضا أن يتم التعامل معها من قبل الطلاب ذوي الخبرة أقل (الموصوفة في 4.2.1.6 4.2. 1.11). كلاهما بروتوكولات تعمل بشكل موثوق. خطوة 4.2.1.1 مطابق لكلا protocشريان الحياة.
      1. تطعيم 5 مل YEPS الضوء مع كل مرشح واحتضان على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. إسقاط 2 ميكرولتر من ثقافة على طبق من ذهب سم. الحفاظ على ثقافة عقيمة.
        ملاحظة: فيما يلي بروتوكول قياسي (تنبيه: خطوات السامة).
      2. وضع 1 مغرفة (~ 200 ميكرولتر) من الخرز الزجاجي غسلها حمض الهيدروكلوريك إلى 2 مل أنابيب. إضافة 2 مل من U. ثقافة الذروية. تدور 12000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف (بيليه يمكن تجميدها في هذه المرحلة). إضافة 500 ميكرولتر الفينول / الكلوروفورم / Isoamylalcohol (25: 24: 1) لبيليه. الحذر! الفينول سامة!
      3. إضافة 500 ميكرولتر أوستي-تحلل العازلة 1. هزة لمدة 6 إلى 10 دقائق على vibrax في 1000 دورة في الدقيقة. تحقق من أن بيليه الخلية هو معلق تماما، ولكن تجنب الموسعة تهتز لمنع القص من gDNA. تدور في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل 400 ميكرولتر من المرحلة المائية في أنبوب رد فعل جديد (لا تلمس البيني).
      4. إضافة 1 مل 100٪ (ت / ت) الإيثانول. عكس 3X أنبوب لخلط، ومراقبة جبصوت عال من الحمض النووي التي تظهر قريبا. تدور في 12000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ويغسل مع 200 ميكرولتر 70٪ ETOH. لا resuspend الكرية في هذه المرحلة.
      5. إزالة طاف تماما (لا تدع بيليه يجف تماما). إضافة 50 ميكرولتر TE / ريبونوكلياز. حل gDNA التي تهز في 400 دورة في الدقيقة عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحليل 2 ميكرولتر من gDNA على 0.8٪ هلام الاغاروز 20.
        ملاحظة: تشمل الخطوات التالية بروتوكول بديل غير سامة.
    2. إعداد بديل من الحمض النووي الجيني
      1. وضع 1 مغرفة (~ 200 ميكرولتر) من حمض الهيدروكلوريك غسلها الخرز الزجاجي إلى 2 مل أنابيب. إضافة 2 مل من U. ثقافة الذروية وتدور في 12000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف (الكريات يمكن تجميدها في هذه المرحلة).
      2. إضافة 500 ميكرولتر أوستي تحلل العازلة 2 إلى بيليه. يهز لمدة 5 إلى 15 دقائق على vibrax في 1000 دورة في الدقيقة. تحقق من أن بيليه الخلية هو معلق تماما.
      3. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. باستخدام APPROحاضنات priate مصممة لاستضافة 2 مل أنابيب أمر بالغ الأهمية. ثم، وضعه على الجليد لمدة 5 دقائق.
      4. إضافة 100 ميكرولتر 8 M خلات البوتاسيوم، دوامة أو عكس 8-10 مرات. تدور 12000 x ج لمدة 15 دقيقة في RT.
      5. نقل 500 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 مل الطازجة وإضافة 400 ميكرولتر الأيسوبروبانول. دوامة أو عكس 8-10 مرات. تدور 12000 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف ويغسل مع 500 ميكرولتر 70٪ ETOH. تدور 12000 x ج لمدة 5 دقائق.
      6. نقع قبالة طاف تماما! في نهاية المطاف، إضافة تدور قصيرة (10 ثانية) لإزالة السائل المتبقي. السماح الحمض النووي بيليه الجافة لمدة 3 إلى 5 دقائق. إضافة 50 ميكرولتر TE / RNAase واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 400 دورة في الدقيقة.
    3. PCR
      1. تصميم اثنين من أزواج التمهيدي مع واحد منهم ملزم خارج الأجنحة والمناظرة واحد ملزم ضمن كاسيت المقاومة (UF-و، RC-R، RC-F، DF-R، الشكل 1) 9.
      2. استخدام 1 ميكرولتر من 1:10 التخفيف من gDNA من كل جandidate كنموذج في 2 ردود الفعل PCR التحقق من التركيب الصحيح المنبع والمصب 9.
      3. تستخدم تفاعلات PCR القياسية لكل مرشح وتحليل شظايا 22 الناتجة عن ذلك.
        ملاحظة: هذه تقارير إنجاز المشروعات اختبار لإدخال الكاسيت المقاومة في موضع الجيني الصحيح. إذا تم الحصول على المنتجات لكلا الجانبين، من المرجح أن يكون المرشح على الإدراج الصحيح. ومع ذلك، ينبغي أن يتم أيضا المرشحين حيث جانب واحد فقط (المنبع أو المصب) يتسن التأكد على طول لمزيد من التحليل في حالة أن ردود الفعل PCR فشلت ببساطة عن الجناح واحدة.
  3. التحقق من الإدراج الجينوم الصحيح من جنوب تحليل وصمة عار 22
    1. هضم 15 ميكرولتر من gDNA (4.2.1) من المرشحين متحولة والمقابلة سلالة wildtype / السلف مع انزيم المناسب الذي يمر خارج مكان / بناء وبالإضافة إلى ذلك، يقطع إما في الجينات أو في الكاسيت المقاومة مما يؤدي إلى حي بوضوحأنماط inguishable (الشكل 1) 8.
      ملاحظة: أي من العصابات المتوقعة ينبغي أن تكون أكبر من 10 كيلو بايت، بحيث يمكن تمييزها بوضوح من الحمض النووي عسر الهضم.
    2. استخدام المنبع والمصب الجهة كما تحقيقات. لتسمية لهم على سبيل المثال استخدام PCR DIG وضع العلامات كيت أو أي طريقة قياسية مماثلة. مزيج تحقيقات وصفت في نسبة 1: 1 الجزيئية وتنفيذ اللطخة الجنوبية. حفاظ على اثنين على الأقل transformants الصحيحة مستقلة.
      ملاحظة: يجب أن يكون نمط wildtype كشفها بوضوح في سلالة الأصلي ويجب أن تحتوي على استنساخ الصحيحة فقط العصابات المتوقع. العصابات إضافية موجودة فقط في المرشحين تشير الإدراج أخرى للبناء في موضع الخطأ. يجب التخلص من هذه الحيوانات المستنسخة. يجب أن تحتوي على مرشح السلبي المحددة في أول التشخيص PCR العصابات wildtype وعصابات (غير متوقعة في حجم) من بناء حذف متكاملة خطأ.
  4. الأسهم الجلسرين
    ملاحظة: الأسهم الجلسرين تعمل على الحفاظ على الحيوانات المستنسخة لسنوات في مجموعات الضغط. يجب أن تبقى اثنين على الأقل transformants مستقلة لكل متحولة. وهذا يسمح بمقارنة الظواهر التي يجب أن تكون متطابقة.
    1. تنمو 5 مل ثقافات سلالات متحولة أكد في YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية مزيج 500 ميكرولتر من كل ثقافة مع 500 ميكرولتر NSY-الجلسرين متوسطة. عكس أنبوب حتى الثقافة ومتوسطة مختلطة جيدا. الجلسرين في المتوسط ​​يمنع تكوين بلورات الثلج.
    2. تجميد في -80 درجة مئوية. إعادة خط جزء من ثقافة المجمدة لاختبار إذا كانت الأوراق المالية وظيفية.

5. مجهرية الظواهر

  1. تنمو 5 مل ثقافات wildtype وسلالات متحولة في YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 12 ساعة على 28 درجة مئوية.
  2. وفي اليوم التالي، يخفف من ثقافة إلى OD 600 من حوالي 0.1 وتنمو فيه حتى على OD 600 بين 0.5 و 0.7. وOD 600 من 1.0 الموافقonds إلى حوالي 1-2 × 10 7 U. الذروية خلايا لكل مل.
  3. تفقد شكل الخلية مجهريا.
    تظهر صحي خلايا السيجار على شكل (الشكل 4، WT): ملاحظة. فجوات منطوقة أو تشكيل خيوط تشير إلى أن وشدد على الخلايا.
    ملاحظة: اعتمادا على النمط الظاهري متحولة المتوقع، يمكن تكييف هذا التحليل، على سبيل المثال، إذا تم استخدام سلالات مراسل ويمكن إجراء الفحص المناسب للخروج في هذه المرحلة. إذا كان يجب إجراء التحليل الإحصائي تغير شكل الخلية، على سبيل المثال، لتحديد متوسط طول الخلية.

6. العدوى الفحص

ملاحظة: تم تصور الفحص إصابة الشتلات سابقا في هذه المجلة 11. ما في وسعها إما أن تنفذ باستخدام فرداني، الخلفية سلالة solopathogenic مثل SG200 10 أو عن طريق خلط شركاء التزاوج متوافق كلاهما تحمل التحور.

  1. تنمو لا يقل عن 40 شتلات الذرة فيسلالة لمدة 7 أيام في دورة الخفيفة من 16 ساعة، 200 μE، 28 ° C / 22 ° C (يوم / ليلة). يجب أن يكونوا في المرحلة 3 أوراق و10-15 سم في اليوم من الإصابة.
  2. قبل يومين من الإصابة، وبدء ثقافة ما قبل السلالات في 5 مل YEPS الضوء على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. تنمو ثقافة الرئيسية في 50 مل YEPS الضوء تصل إلى OD 600 = 1.0 (معدل انقسام الخلايا = 2 ساعة، والسماح الشعب 3 كحد أدنى، ويمكن أن يتم O / N).
  3. تدور باستمرار خلايا ثقافة 50 مل في 1500 x ج لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. غسل 3X مع H 2 O. معقم resuspend الخلايا في H 2 O معقمة إلى OD 600 من 3.0. إذا لزم الأمر، مزيج من شركاء التزاوج.
  4. حقن 250-500 ميكرولتر من تعليق خلية في الجذعية من 7 أيام شتلات الذرة القديمة باستخدام حقنة صغيرة. استخدام H 2 O معقمة كمجموعة تحكم. الحفاظ الشتلات المصابة لمدة 7-14 أيام إضافية في نفس ظروف الإضاءة ودرجة الحرارة. تسجيل النمط الظاهري لكل مصنعccording لصحي، الاخضرار، تشكيل الأنثوسيان، الأورام الصغيرة، وأورام كبيرة، النباتات الميتة 10.
    ملاحظة: يمكن أن يتم تسجيل النقاط في وقت مبكر من 7 أيام، وكرر في 14 يوما لمتابعة العدوى مع مرور الوقت.

النتائج

بنيات الحذف لجميع الجينات chitinolytic أربعة المشفرة في U. تم إنشاؤها الذروية الجينوم عن طريق الاستنساخ جولدن جيت باستخدام كاسيت hygR للحذف من cts1، وnatR للحذف من cts2، الكاسيت G418R للحذف من cts3 وcbxR للحذف من cts4 20.

Discussion

يصف هذا البروتوكول وكيفية توليد المسوخ الحذف للدراسات الوراثية العكسية في U. الذروية. نقطة البداية هي بنية الحذف الذي يحتوي تسلسل المرافقة لهذا الجين في المصالح التي تحتوي على تسلسل حوالي 1 كيلو بايت المنبع من بداية والمصب لوقف كودون وكذلك كاسيت المقاومة المناس?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

شكر خاص للدكتور بينيديكت Steuten لقراءة نقدية للمخطوطة. تم تنفيذ العمل الأصلي على chitinases بها الدكتور تورستن انغنر. يتم اعتماد مختبر VG التي كتبها عنقود التميز في علوم النبات (CEPLAS، DFG EXC 1028) وBioSC، يتم اعتماد مختبر KS التي كتبها BioSC. ويدعم KB من BioSC. الأنشطة العلمية لمركز العلوم الاقتصاد الحيوي (BioSC) ودعما ماليا من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في إطار من NRW Strategieprojekt BioSC (رقم 313 / 323-400-00213). ويدعم LF من قبل زمالة الدكتوراه من DFG المجموعة الدولية والبحوث والتدريب 1525 iGRADplant.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

References

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved