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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Zusammenfassung

Gendeletion spielt eine wichtige Rolle bei der Analyse der Genfunktion. Eine der effizientesten Methoden Gene gezielt zu unterbrechen ist der Ersatz des gesamten Gens mit einem selektierbaren Marker durch homologe Rekombination. Während der homologen Rekombination, den Austausch von DNA erfolgt zwischen Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit. Daher linearen genomischen Sequenzen ein Zielgen flankieren können gezielt eingesetzt werden, um einen selektierbaren Marker in die gewünschte Integrationsstelle lenken. Blunt Enden des Deletionskonstrukt aktivieren die DNA-Reparatursysteme der Zelle und damit Integration des Konstrukts zu fördern, entweder durch homologe Rekombination oder durch nicht-homologe-end-joining. In Organismen mit effizienten homologe Rekombination, kann die Rate der erfolgreichen Gen-Deletion erreichen mehr als 50% machen diese Strategie zu einem wertvollen Genin System. Der Brandpilz Ustilago maydis ist ein eukaryotischen Modell Mikroorganismus so effiziente homologe recombinat zeigtIon. Aus seiner etwa 6.900 Gene, wurden viele haben funktionell mit Hilfe von Deletionsmutanten gekennzeichnet, und Versagen des Genaustausches Versuche Punkte an wesentlichen Funktion des Gens wiederholt. Die anschließende Charakterisierung der Genfunktion durch auch auf DNA-Austausch beruht über homologe Rekombination mit Fluoreszenzmarkern oder Mutationen der vorhergesagten Domänen-Tagging. Hier präsentieren wir die U. maydis Stamm Generation Strategie im Detail das einfachste Beispiel verwenden, die Gen - Deletion.

Einleitung

Ustilago maydis ist ein phytopathogener Modell Pilz, der in großem Umfang für Jahrzehnte 1,2 untersucht wurde. Es existiert in zwei Morphologien, eine Hefe-like, nicht pathogen Stufe und einem fädigen, infektiöse Form 3. Universal - Durchbruch Entdeckungen wie homologe Rekombination und DNA - Reparaturmechanismen wurden in der Hefe-ähnliche Wachstumsphase des Pilzes 4 gemacht. Darüber hinaus sind die morphologischen Schalter auf den infektiöse Glühfaden und Virulenzfaktoren wichtig für Infektions 5,6 gut charakterisierten. Die zunehmende molekulare Wissen über Biologie und Virulenz dieser Brandpilz beruht auf einem einfachen Gen - Ersetzungsstrategie 7-9 durch eine hervorragende Genomannotation unterstützt 10 und die Leichtigkeit der reversen Genetik, zB die gut organisierte Plasmid Sammlung an unserem Institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardisierte, schnelle Infektionstests in Mais seedlings ermöglichen detaillierte Studien der Pathogenität 11 Faktoren.

Das Genom von U. maydis enthält etwa 6900 Gene 10. Um ihre Funktion zu studieren, können sie einzeln oder in Kombination gelöscht werden aufgrund einer effizienten homologe Rekombinationssystem. Flankierende Regionen von etwa 1 kb perfekt homologe Enden enthalten , sind ideal für die Preise der homologen Rekombination von mehr als 50%, aber bereits 250 bp mit nicht-homologe Enden ermöglichen einen gewissen Grad an korrekte Integration des Konstrukts 9. Derzeit sind fünf verschiedene Widerstandskassetten, HYGR, cbxR, NATR, G418R und phleoR vermittelnde Widerstand gegen Hygromycin, Car-, Nourseothricin, G418 und Phleomycin, eingesetzt für Trans auszuwählen 7,9. Darüber hinaus hat der Hygromycinresistenz in eine wiederverwertbare Kassette (FRT-HYGR) entwickelt worden, die durch die transiente Expression einer heterologen FLP Rekombinase entfernt werden kann 12. Dies ermöglicht die Entfernung der Resistenzkassette und damit theoretisch unbegrenzt genetische Veränderungen. Phleomycin ist mutagenen 13, so daß mit den neuen Kassetten, insbesondere das recycelbar HYGR Kassette, die Verwendung von phleoR abnimmt. Quadruple - Mutanten können so erzeugt werden , um die anderen vier Kassetten verwenden, aber für verfünffachen Mutanten, die FRT-HYGR System wird 14 empfohlen.

Diese allgemeine Gen - Deletion Strategie wurde auf andere Brandpilze wie Sporisorium reilianum erfolgreich übertragen 15, U. hordei 16 oder U. esculenta 17 und bietet somit das Potenzial für weitere Anwendungen in noch genetisch hartnäckigen Organismen mit einem effizienten homologe Rekombination System. Außerdem Organismen die homologe Rekombination fehlt modifiziert werden können Gentechnik zu verbessern, wie durch die Deletion von Genen beteiligt exemplifiziert in nicht-homologe-end-Beitritt in Neurospora crassa 18,19.

Hier beschreiben wir die veröffentlichten Gen - Deletion Strategie für U. maydis 7,9 in experimentellen Detail mit einem Fokus auf die schnelle und genaue Überprüfung der Kandidaten. Als Beispiel verwenden wir die Pilz Chitinasen und zeigen die Erzeugung von Einzelmutanten sowie mehrere Lösch 20,21 Stämme. Chitinasen sind interessante Beispiele, weil sie in der starren Zellwand auf Chitin wirken. Zellwand Umbau für morphologische Veränderungen während der Zellteilung benötigt wird, wechseln Sie in das filamentöse Wachstum und die Sporenbildung. Daher kann in Deletionsmutanten Phänotypen während der Lebensdauer zu erwarten.

Protokoll

1. Erzeugung von Deletionskonstrukte

  1. Generieren Sie ein Plasmid , das das Löschen Konstrukt (Abbildung 1), die jeweils einen 1 kb stromaufwärts Flanke (UF) und Downstream - Flanken (DF) , die jeweils und die entsprechende Resistenz - Kassette flankiert durch stumpfe Schneidrestriktionsstellen enthält.
    HINWEIS: Jede Strategie Klonen verwendet werden kann (für das Klonen siehe Referenz 22) wir für solche Plasmide 9 Golden Gate Klonen empfehlen.
  2. Excise die Streichung aus dem Plasmid - Konstrukt eine stumpfe Schneider 1 ug DNA des Löschens zu erhalten 9 konstruieren. Reinige das Löschen Konstrukt Enzym eliminieren und 22 zB Puffer von kommerziellen Reagenzien und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Die Vektorgerüst in dem Transformationsgemisch verbleiben kann.

2. Herstellung von Protoplasten

HINWEIS: Halten sterilen Bedingungen in allen Zeiten des experiment. Die Zellwand ist eine starke schützende Barriere, die den Zugang der Moleküle an der Plasmamembran begrenzt. Zur Aufnahme der DNA, enthaltend das Deletionskonstrukt zu ermöglichen, muss die Zellwand durch Zellwand entfernt werden Enzyme in einem Reaktions Protoplastierung zu verschlechtern. Kritischsten Schritte in Protoplastenpräparation sind 1) osmotische Stabilisierung des Mediums und 2) auf den Protoplasten mechanische Beanspruchung zu vermeiden.

  1. Mark 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden der Protoplasten zu frieren und kühlt sie bei -20 ° C nach unten. Starten Sie eine Vorkultur in 3 ml YEPS-Licht aus einer frischen Platte des Stammes mit der gewünschten genetischen Hintergrund. Inkubieren auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C.
    HINWEIS: Der Stamm kann die solopathogenic Stamm SG200 10, Wildtyp- Stämme, Teststämme wie AB33 23, oder jede Mutante Hintergrund für die Erzeugung von Doppelmutanten sein. Stellen Sie sicher, dass der Stamm frei von dem gewünschten Widerstand ist.
  2. Verdünnen Sie die Kultur in 50 ml YEPS-Licht in einem verwirrten flask und Inkubieren auf einem Orbitalschüttler bei 28 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute.
    HINWEIS: Die Verdopplungszeit beträgt etwa 2 h für Wildtyp- Stämme. Lassen Sie drei Vervielfältigungen Minimum.
  3. Wachsen bis exponentiellen Phase. Sicherzustellen , dass die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen (OD 600), liegt bei etwa 0,8 (0,6 bis 1,0 ist akzeptabel). Eine OD 600 von 1,0 entspricht etwa 1 bis 2 x 10 7 U. maydis Zellen pro ml.
  4. Überprüfen Sie die Zellen für die Verunreinigung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie 40-facher Vergrößerung. Pellet die Zellen des gesamten 50-ml-Kultur für 5 min, 1.500 xg und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets in 25 ml Natriumcitrat, Sorbitol-Lösung (SCS), Zentrifuge 5 min, 1.500 x g, und Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Die bakterielle Verunreinigungen können so klein und oft bewegenden Zellen identifiziert werden. Fungal Verunreinigungen können an die Zigarre förmigen Zellen von U. basierend auf einer anderen Zelle Form oder Größe verglichen identifiziert werden maydis.
  5. Während centrifugation vorbereiten Protoplastierung - Lösung (12,5 mg / ml Trichoderma lysierende Enzyme, SCS, vorbereiten 3 ml pro Zellpellet, Filter sterilisieren durch einen 22 & mgr; m - Filter; Lösung hat für eine optimale enzymatische Aktivität frisch zu sein). SCS ist ein osmotischer Stabilisator Ruptur von Protoplasten nach der Entfernung der Zellwand zu verhindern.
  6. Das Pellet in 2 ml Protoplastierung Lösung. Inkubieren für 5 bis 20 min bei RT und prüfen Sie unter dem Mikroskop , bis 30 bis 40% der Zellen sind rund oder wie pinheads (Abbildung 2).
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf dem Eis von nun an und behandeln Protoplasten mit Vorsicht!
  7. Wasch 3x in 10 ml kaltem (4 ° C) SCS, Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min.
  8. Das Pellet in 10 ml kaltem Sorbit, TrisHCl, CaCl 2 -Lösung (STC), Spin bei 1000 × g für 5 min, Überstand verwerfen. Das Pellet in 1 ml kaltem STC, machen 100 ul Aliquots in den gekühlten Rohren. Frieren Sie die Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Transformation von U. maydis

HINWEIS: Die Transformation von U. maydis Protoplasten basiert auf dem Polyethylenglykol (PEG) -vermittelte Transformation Verfahren, das technisch einfach ist und im Gegensatz zur Elektroporation oder Transformation biolistische erfordert keine spezielle Ausrüstung.

  1. Bereiten Sie die zweischichtige Selektionsplatten (2 Platten pro Transformationsreaktion). Die untere Schicht enthält das Antibiotikum in einer doppelten Konzentration. Pipettieren von 12 ml RegLight enthaltend 400 & mgr; g / ml Hygromycin (oder 300 & mgr; g / ml Nourseothricin oder 4 ug / ml Carboxin oder 1 mg / ml G418) in eine Petrischale. Vermeiden Sie Blasen.
    HINWEIS: Die untere Schicht Platten kann ein paar Tage bei 4 ° C gelagert werden, sondern bereiten die oberste Schicht frisch während der Transformation (siehe unten).
  2. Thaw Protoplasten auf Eis (1 Rohr / Transformation). 1 & mgr; l Heparin (15 mg / ml). 1 & mgr; g DNA (linearisierte Konstrukt) oder 10 & mgr; l H 2 O (Wasser-Kontrolle). Inkubieren für 10 min auf Eis.
  3. Während dieser Zeit verbreitet für die obere Schicht 12 ml verflüssigtes RegLight (kochen und kühlen bis 60 ° C) auf die RegLight Bodenplatte.
    HINWEIS: Diese Schicht enthält keine Antibiotika.
  4. In 500 ul STC / PEG (Polyethylenglykol), um die Transformation Rohr (3 2) und mischen Sie vorsichtig durch den Schlauch zu invertieren. Inkubieren 15 min auf Eis.
  5. jeder Transformationsreaktion auf zwei der zweischichtigen RegLight Platten verteilen. Verbreiten Sie vorsichtig und langsam mit einer Glaspipette. Die Platten aufrecht bei 28 ° C für 5 bis 7 Tage bis zum Trans als Kolonien wachsen. Erhalten Sie etwa 100-200 Kolonien pro Platte.
    HINWEIS: Niedrigere Zahlen könnten durch "schlechte" Protoplasten verursacht werden, die entweder zu viel Zellwand enthalten und daher nicht DNA aufnehmen kann oder nicht regenerieren. Ersteres kann mit einem selbst-replizierenden Plasmid durch Transformation getestet werden, letztere durch Regeneration Testen auf Platten ohne Antibiotika.
  6. Bereiten Sie YEPS-Light-Platten das entsprechende Antibiotikum bei 200 ug / ml Hygromycin (oder 150 ug / ml Nourseothricin oder 2 ug / ml Car- oder 500 ug / ml G418, diese Konzentrationen gleich die Hälfte der für die Bodenplatten verwendet man) enthält. Wieder reinigen mindestens 24 putative Transformantenkolonien auf diesen Platten. Einzelne Kolonien sollten erhalten werden. Zur gleichen Zeit Strähne aus dem ursprünglichen Stamm auf nicht-selektiven Medien.
    HINWEIS: Die Platten können für 1-2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden.

4. Überprüfung der korrekten Deletionsereignisse

HINWEIS: Die Mutationen in einem Drei-Schritt - Verfahren überprüft werden (Abbildung 1). Zunächst Kandidaten, die die Wildtyp-Kopie des Gens enthalten, werden durch PCR ausgeschlossen. Zweitens wird die Integration des Resistenzkassette in den Locus durch PCR verifiziert. Drittens nur in den gewünschten Ort der Integration der Resistenzkassette wird durch Southern-Blot-Analyse verifiziert. Eine sorgfältige Überprüfung Stamm ist Essential, so dass Mutantenphänotypen wirklich mit der Streichung korrelieren.

  1. Erste Diagnostische PCR 20
    1. Design Primer Paarung in dem Gen zu diesem Ergebnis ein Produkt von 250-600 bp (Abbildung 1) gelöscht werden. Solche kleinen Produkte sind einfach in einer Kolonie-PCR, und lang genug für den Nachweis in Standard-Gel-Elektrophorese zu verstärken.
    2. Für jeden Kandidaten und dem ursprünglichen Stamm als eine positive Kontrolle, resuspendieren ein wenig (Menge eines Stecknadelkopfes) von Zellmaterial aus einer einzelnen Kolonie mit einem Zahnstocher in 20 ul 0,02 M NaOH. 30 min bei RT inkubiert.
      HINWEIS: Verwenden Sie frische Kolonien. Wenn die Platten sind älter als 1 Woche wieder Streifen eine frische Kolonie zu erhalten.
    3. Verwenden 1 & mgr; l der Zellsuspension für die unmittelbar PCR. Führen Sie einen Standard-PCR-Reaktion und Analyse resultierenden Fragmente.
      ANMERKUNG: Diese Proben können nicht gespeichert werden.
      HINWEIS: Diese PCR-Tests auf das Vorhandensein des Wildtyp-Gen und ermöglicht dadurch eine schnelle Identifizierung von negativen candidates in denen das Gen von Interesse ersetzt worden ist. Klone Bänder in dieser PCR-Reaktion ergibt, werden verworfen. Ein solcher negativer Klon sollte auf jeden Fall durchgeführt werden zusammen als zusätzliche negative Kontrolle. Kandidaten ohne PCR-Produkt müssen weiter analysiert werden. Für Gene ohne schädliche Auswirkungen etwa die Hälfte der Kandidaten sollte das Wildtyp- Gen enthalten, während die andere Hälfte nicht in einer Band zur Folge haben sollte. Dies entspräche einer homologen Rekombination Rate von 50%.
  2. Zweite Diagnostische PCR
    1. Herstellung von genomischer DNA.
      HINWEIS: Genomische DNA (gDNA) kann unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen hergestellt werden. Die erste umfasst toxische Reagenzien wie Phenol und Chloroform, und daher sollten nur von erfahrenen Forscher (in 4.2.1.1 bis 4.2.1.5 beschrieben) behandelt werden, während der zweite auch von weniger erfahrenen Studenten behandelt werden können (in 4.2.1.6 bis 4.2 beschrieben. 1.11). Beide Protokolle arbeiten zuverlässig. Schritt 4.2.1.1 ist identisch für beide Protocols.
      1. Impfen 5 ml YEPS-Light mit jedem Kandidaten und Inkubation bei 28 ° C für 24 Stunden auf einem rotierenden Rad. Drop 2 ul der Kultur auf einer CM-Platte. Danach wird die Kultur steril.
        HINWEIS: Im Anschluss ist ein Standardprotokoll (ACHTUNG: toxische Stufen).
      2. Setzen Sie 1 Kugel (~ 200 ul) HCl-washed Glasperlen 2-ml-Röhrchen. 2 ml des U. maydis - Kultur. Spin 12.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen (Pellet kann in diesem Stadium eingefroren werden). Hinzufügen, 500 & mgr; l Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zu dem Pellet. VORSICHT! Phenol ist giftig!
      3. In 500 ul Usti-Lyse-Puffer 1. Schütteln für 6 bis 10 min auf einem Vibrax bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet vollständig suspendiert ist, aber vermeiden Sie verlängerten Schütteln Scheren des gDNA zu verhindern. Spin bei 12.000 × g für 15 min. Übertragen Sie 400 ul der wässrigen Phase in die neue Reaktionsrohr (berühren Sie nicht die Interphase).
      4. 1 ml 100% (v / v) Ethanol. Drehen Sie die Röhre 3x zu mischen, beobachten die claut der DNA, die in Kürze erscheint. Spin bei 12.000 xg für 5 min. Überstand entfernen und waschen mit 200 ul 70% EtOH. Nicht das Pellet in dieser Phase suspendieren.
      5. Überstand entfernen vollständig (Sie das Pellet vollständig trocknen, nicht zulassen). In 50 ul TE / RNase. Auflösen gDNA wurde 10 min bei 400 rpm bei 50 ° C schüttelnd. Analysieren 2 ul der gDNA auf einem 0,8% Agarose - Gel 20.
        HINWEIS: Die folgenden Schritte umfassen eine alternative nichttoxische Protokoll.
    2. Alternative Herstellung von genomischer DNA
      1. Setzen Sie 1 Kugel (~ 200 ul) von HCl Glasperlen 2-ml-Röhrchen gewaschen. 2 ml des U. maydis - Kultur und Schleudern bei 12.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen (Pellets kann in diesem Stadium eingefroren werden).
      2. In 500 ul Usti Lysepuffer 2 zu dem Pellet. Schütteln für 5 bis 15 min auf einer Vibrax bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet vollständig suspendiert ist.
      3. Inkubieren der Röhrchen bei 65 ° C für 15 bis 20 min. Mit approfalls Inkubatoren Rohre Host ausgelegt 2 ml ist kritisch. Dann legen Sie es auf Eis für 5 min.
      4. Füge 100 & mgr; l 8 M Kaliumacetat, Wirbel oder Invertzucker 8 bis 10 mal. Spin 12.000 xg für 15 min bei RT.
      5. Transfer 500 ul des Überstands in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und fügen 400 ul Isopropanol. Wirbel- oder Invertzucker 8 bis 10 mal. Spin 12.000 xg für 15 min. Überstand entfernen und waschen mit 500 ul 70% EtOH. Spin 12.000 xg für 5 min.
      6. Tränken weg vom Überstand vollständig! Schließlich fügen Sie einen kurzen Schleuder (10 sec) Restflüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die DNA-Pellet trocken für 3 bis 5 min. Werden 50 & mgr; l TE / RNAase und inkubieren bei 50 ° C für 10 bis 15 min bei 400 Upm.
    3. PCR
      1. Design zwei Primerpaare mit einem von ihnen außerhalb der Flanken Bindung und die entsprechende eine Bindung innerhalb der Resistenzkassette (UF-f, RC-R; RC-f, DF-r, 1) 9.
      2. Verwenden Sie 1 ul einer 1:10 Verdünnung der gDNA jedes candidate als Matrize in zwei PCR - Reaktionen Überprüfung der korrekten Einsetzen Upstream- und Downstream - 9.
      3. Verwenden Sie Standard - PCR - Reaktionen für jeden Kandidaten und analysieren 22 Fragmente ergeben.
        ANMERKUNG: Diese PCRs Test für die Insertion der Resistenzkassette in der korrekten genomischen Locus. Wenn Produkte für beide Seiten gewonnen werden, ist der Kandidat wahrscheinlich eine korrekte Einsetzen. Jedoch auch Kandidaten, wo nur eine Seite (upstream oder downstream) bestätigt werden sollten zusammen für eine weitere Analyse im Falle, dass PCR-Reaktionen einfach ausgefallen für eine Flanke durchgeführt werden.
  3. Überprüfung der korrekten Genomische Insertion durch Southern - Blot - Analyse 22
    1. Digest 15 ul gDNA (4.2.1) der mutanten Kandidaten und das entsprechende Wildtyp- / Progenitor-Stamm mit einem geeigneten Enzym, das außerhalb des locus schneidet / konstruieren und zusätzlich schneidet entweder in dem Gen oder in der Resistenzkassette führt eindeutig zu distinguishable Muster (Figur 1) 8.
      HINWEIS: Keine der erwarteten Banden sollte größer als 10 kb sein, so dass sie deutlich von unverdauten DNA sind.
    2. Verwenden Sie den Upstream und Downstream Flanke als Sonden. Zur Kennzeichnung der sie zum Beispiel die PCR DIG Labeling Kit oder ähnliche Standardmethode verwenden. Mischen Sie die markierten Sonden in einem 1: 1-Molekülverhältnis und Durchführung des Southern-Blot. Halten Sie mindestens zwei unabhängige korrekte Trans.
      HINWEIS: Die Wildtyp-Muster in dem Ausgangsstamm und die richtigen Klone enthalten sollten nur die erwarteten Banden eindeutig nachweisbar sein sollte. Weitere Bands nur in den Kandidaten zeigen andere Einfügungen des Konstrukts in einem falschen Ort. Solche Klone sollten verworfen werden. Der negative Kandidaten in der ersten diagnostische PCR identifiziert sollten die Wildtyp-Banden und die Bänder (unvorhersehbar in Größe) des falsch integriert Deletionskonstrukt enthalten.
  4. Glycerol Stocks
    HINWEIS: Glycerol Bestände dienen, die Klone für Jahre in Stammsammlungen zu halten. Mindestens zwei unabhängige Transformanten sollte für jede Mutante gehalten werden. Dies ermöglicht den Vergleich Phänotypen, die identisch sein sollten.
    1. Wachsen 5 ml-Kulturen der bestätigten mutanten Stämmen in YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C Mix 500 & mgr; l jeder Kultur mit 500 & mgr; l NSY-Glycerol-Medium. Invert Rohr bis Kultur und Medium gut vermischt sind. Glycerol in dem Medium verhindert die Bildung von Eiskristallen.
    2. Einfrieren bei -80 ° C. Re-Streifen ein Teil der gefrorenen Kultur zu testen, ob das Lager funktionsfähig ist.

5. Mikroskopische Phänotypen

  1. Wachsen 5 ml Kulturen von Wildtyp- und Mutantenstämmen in YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 12 Stunden bei 28 ° C.
  2. Am nächsten Tag, verdünnte die Kultur auf eine OD 600 von etwa 0,1 wachsen und es werden bis eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,7. Eine OD 600 von 1,0 entsprSekunden auf etwa 1 bis 2 x 10 7 U. maydis Zellen pro ml.
  3. Überprüfen Sie die Zellmorphologie mikroskopisch.
    HINWEIS: Gesunde Zellen erscheinen in Zigarrenform (Abbildung 4, WT). Ausgesprochen Vakuolen oder Fadenbildung zeigen, dass die Zellen werden betont.
    HINWEIS: In Abhängigkeit von dem mutierten Phänotyp zu erwarten, kann die Analyse angepaßt werden, beispielsweise wenn Reporter - Stämme die geeignete Assay verwendet werden , können in dieser Phase durchgeführt werden. Wenn die Zellmorphologie verändert wird die statistische Analyse durchgeführt werden sollte, beispielsweise die mittlere Zellenlänge zu bestimmen.

6. Infection Assay

HINWEIS: Der Test Sämling Infektion wurde 11 zuvor in dieser Zeitschrift visualisiert. Es kann entweder 10 eine haploide, solopathogenic Stamm Hintergrund mit wie SG200 durchgeführt oder von kompatiblen Paarungspartnern Mischen , die sowohl die Mutation tragen.

  1. Wachsen mindestens 40 Maiskeimlinge proStamm für 7 Tage bei einem Lichtzyklus von 16 Stunden, 200 & mgr; E, 28 ° C / 22 ° C (Tag / Nacht). Sie sollte am Tag der Infektion im 3-Blatt-Stadium und 10-15 cm hoch sein.
  2. Zwei Tage vor der Infektion, beginnen eine Vorkultur der Stämme in 5 ml YEPS-Licht auf einem rotierenden Rad 24 Stunden bei 28 ° C. Wachsen Sie eine Hauptkultur in 50 ml YEPS-Light bis 600 bis OD = 1,0 (Zellteilungsrate = 2 h, erlauben drei Divisionen Minimum, kann O / N erfolgen).
  3. Spin down die Zellen von 50 ml Kultur bei 1500 × g für 5 min und den Überstand verwerfen. Wasch 3x mit sterilem H 2 O. Resuspendieren der Zellen in sterilem H 2 O bis zu einer OD 600 von 3,0. Falls erforderlich, mischen Sie die Paarungspartner.
  4. Injizieren 250-500 & mgr; l der Zellsuspensionen in den Stamm von 7 Tage alten Maiskeimlinge eine kleine Spritze verwendet wird. Verwenden sterilem H 2 O als Kontrolle. Halten infizierten Sämlinge für weitere 7-14 Tage im selben Licht und Temperaturbedingungen. Ergebnis des Phänotyps jeder Pflanze einN ach gesund, Chlorose, Anthocyan Bildung, kleine Tumoren, großen Tumoren, abgestorbenen Pflanzen 10.
    HINWEIS: Scoring so früh wie 7 Tagen erfolgt und werden nach 14 Tagen wiederholt Infektion im Laufe der Zeit zu folgen.

Ergebnisse

Die Deletionskonstrukte für alle vier chitinolytischen Gene im U. codierten maydis Genom von Golden Gate Klonen erzeugt wurden unter Verwendung der HYGR Kassette zum Löschen von CTS1, die NATR zum Löschen von CTS2, die G418R Kassette zum Löschen von cts3 und der cbxR zum Löschen von cts4 20. Eine allgemeine Übersicht über Gen - Ersetzungsstrategie wird durch die Deletion von ct...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt , wie Deletionsmutanten für Reverse genetische Studien in U. zu erzeugen maydis. Der Ausgangspunkt ist ein Deletionskonstrukt , die flankierenden Sequenzen des Gens von Interesse enthält Sequenzen von etwa 1 kb stromaufwärts des Starts und stromabwärts des Stop-Codons sowie eine geeignete Resistenz - Kassette enthält , wie es zuvor 7,9 optimiert . Die Konstrukte sind individuell werden für jedes Gen erzeugt und sorgfältig für Folgefehler vor dem Löschen d...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Besonderer Dank geht an Dr. Benedikt Steuten für das kritische Lesen des Manuskripts. Die ursprüngliche Arbeit an den Chitinasen wurde von Dr. Thorsten Langner durchgeführt. Das Labor von VG wird durch die Exzellenzcluster in Pflanzenwissenschaften (CEPLAS, DFG EXC 1028) und BioSC unterstützt wird das Labor von KS von BioSC unterstützt. KB wird von BioSC unterstützt. Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center (BioSC) wurden vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr 313 / 323-400-00213) finanziell unterstützt. LF wird durch ein Promotionsstipendium der DFG Graduiertenkolleg 1525 iGRADplant unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

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