JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем надежную стратегию замены генов генетически манипулировать головне гриба Ustilago maydis. Этот протокол объясняет, как генерировать делеционных мутантов для исследования инфекции фенотипы. Он может быть расширен , чтобы модифицировать гены любым желаемым способом, например, путем добавления последовательность , кодирующую флуоресцентный белок тег.

Аннотация

делеции гена играет важную роль в анализе функции гена. Одним из наиболее эффективных способов сорвать генов в качестве целевой группы является замена всего гена с селективным маркером посредством гомологичной рекомбинации. В процессе гомологичной рекомбинации, обмен ДНК происходит между последовательностями с высоким сходством. Таким образом, линейные геномные последовательности, фланкирующие ген-мишень, может быть использован, чтобы специально направить селективный маркер на нужный сайт интеграции. Тупые концы делеций конструкции активировать систему восстановления ДНК клетки и, таким образом, способствовать интеграции конструкции либо с помощью гомологичной рекомбинации, либо не-гомологичной отслуживших присоединения. В организмах с эффективной гомологичной рекомбинации, скорость успешного удаления гена может достигать более 50% решений эта стратегия является ценным система разрушение гена. Головне гриб Ustilago maydis является эукариотической модель микроорганизм показывает такую эффективную гомологичной рекомбинантногоиона. Из его около 6900 генов, многие из них были функционально характеризуется с помощью мутантов с делецией, и неоднократный отказ замены гена покушений точек на основной функции гена. Последующая характеристика функции генов с помощью мечения с флуоресцентными маркерами или мутации предсказанных доменов также опирается на обмен ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Здесь мы представляем U. maydis стратегия генерации штамма подробно , используя простой пример, удаление гена.

Введение

Ustilago maydis является фитопатогенные модель грибок , который интенсивно изучали в течение многих десятилетий 1,2. Он существует в двух морфологией, дрожжей типа, непатогенных стадии и мицелиальных, инфекционная форма 3. Универсальные прорывные открытия , такие как гомологичные механизмы рекомбинации и репарации ДНК были сделаны в дрожжеподобных стадии роста этого гриба 4. Кроме того, морфологический переход к инфекционным и филаментов факторов вирулентности важных для инфекции хорошо характеризуются 5,6. Растущий молекулярно знания о биологии и вирулентность этого гриба головне опирается на стратегию замещения прямой гена 7-9 поддерживается отличным генома аннотацию 10 и легкости обратной генетики с использованием, например, хорошо организованная коллекция плазмида в нашем институте (HTTP : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Стандартизированные, быстрые анализы инфекции у кукурузы сeedlings позволяют детальные исследования факторов патогенности 11.

Геном U. maydis содержит около 6900 генов 10. Для изучения их функции, они могут быть удалены по отдельности или в комбинации из-за эффективной системы гомологичной рекомбинации. Фланкирующих участков около 1 т.п.н. , содержащий совершенно гомологичные концы идеально подходят для скоростей гомологичной рекомбинации более чем на 50%, но уже в 250 пар оснований с негомологичные концов допускают некоторую степень правильной интеграции конструкции 9. В настоящее время пять различных кассет сопротивления, HYGR, cbxR, натр, G418R и phleoR посредническую сопротивление против гигромицину, карбоксин, nourseothricin, G418 и флеомицина, используются для выбора трансформантов 7,9. Кроме того, устойчивости к гигромицину была разработана в перерабатываемых кассету (FRT-HYGR) , которые могут быть удалены путем временной экспрессии гетерологичного FLP рекомбиназой 12, Это позволяет удалять сопротивления кассеты и, таким образом, в теории неограниченных генетических модификаций. Флеомицин мутагенных 13, так что с новыми кассетами, в частности, для повторного использования HYGR кассета, использование phleoR уменьшается. Четырехместные мутанты могут , таким образом , быть получены с использованием других четырех кассет, но для пятикратных мутантов, система FRT-HYGR рекомендуется 14.

Эта общая стратегия удаления гена была успешно передана другим головни грибов , таких как Sporisorium reilianum 15, У. hordei 16, или U. съедобная 17 и , следовательно , обладает потенциалом для дальнейшего применения в еще генетически неразрешимых организмов с эффективной системы гомологичной рекомбинации. Кроме того, организмы, не имеющие гомологичной рекомбинации может быть модифицирован для улучшения методов генной инженерии на примере делеции генов, участвующих в негомологичный-анd-присоединение в нейроспора густая 18,19.

Здесь мы опишем опубликованную стратегию удаления гена для U. maydis 7,9 в экспериментальной подробно с акцентом на быстрой и точной проверки кандидатов. В качестве примера, мы используем грибковые хитиназы и изображают поколение одиночных мутантов, а также удаление множества штаммов 20,21. Хитиназы интересные примеры, потому что они действуют на хитин в жесткой клеточной стенки. Клеточная стенка ремоделирования требуется для морфологических изменений во время клеточного деления, переключиться на нитчатых роста и спорообразования. Следовательно, в делеционных мутантов можно ожидать фенотипы на протяжении всего жизненного цикла.

протокол

1. Генерация делеционных конструкций

  1. Сформировать плазмиду , содержащую конструкцию удаления (рисунок 1) , содержащий соответствующий 1 т.п.н. вверх по течению (UF флангом) и вниз по течению флангом (DF) каждый и соответствующую кассету сопротивления по бокам тупыми сайтов рестрикции резки.
    Примечание: Любая стратегия клонирования может быть использована (для клонирования см ссылку 22) мы рекомендуем Golden Gate клонированию для таких плазмид 9.
  2. Акцизный удаление построить из плазмиды с помощью тупого ножа для получения 1 мкг ДНК делеции построить 9. Очищают удаления конструкции для устранения фермента и буфера 22 , например , с использованием коммерческих реагентов и следовать инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор позвоночник может оставаться в трансформационной смеси.

2. Приготовление протопластов

Примечание: Хранить в стерильных условиях во все времена еXperiment. Клеточная стенка является сильным защитным барьером, который ограничивает доступ молекул к плазматической мембране. Для того, чтобы позволить поглощение ДНК, содержащую конструкцию удаления, клеточная стенка должна быть удалена с помощью клеточной стенки разрушающие ферменты в реакции protoplasting. Критические шаги в подготовке протопластов являются 1) осмотическое стабилизации среды и 2) избегать механических воздействий на протопластов.

  1. Mark 2 мл пробирки с круглым дном, чтобы заморозить протопластов и остудить их при температуре -20 ° C. Начало предварительной культуры в 3 мл YEPS-Light из свежей пластины штамма с желаемым генетическим фоном. Инкубируют на вращающемся колесе в течение 24 ч при 28 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение может быть solopathogenic штамм SG200 10, штаммы дикого типа, тестер штаммы , такие как AB33 23, или любой мутантной фон для генерации двойных мутантов. Убедитесь, что штамм свободен от требуемого сопротивления.
  2. Развести культуры в 50 мл YEPS-света в Запутанный FLASK и инкубировать на орбитальном шейкере при 28 ° С при 200 оборотах в минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: время удвоения составляет около 2 ч для штаммов дикого типа. Разрешить три Дупликации минимум.
  3. расти до экспоненциальной фазы. Убедитесь , что оптическая плотность, измеренная при длине волны 600 нм (OD 600), составляет около 0,8 ( от 0,6 до 1,0 приемлемо). OD 600 1.0 соответствует приблизительно от 1 до 2 х 10 7 У. maydis клеток на мл.
  4. Проверьте клетки для загрязнения под микроскопом. Используйте 40x увеличение. Гранул клетки полной культуры 50 мл в течение 5 мин, 1500 XG и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 25 мл цитрат натрия, раствор сорбита (SCS), центрифуга 5 мин, 1500 XG, и отбросить супернатант.
    Примечание: Бактериальные контаминации могут быть идентифицированы как небольшие и часто движущихся клеток. Грибковые контаминации могут быть идентифицированы на основе другой формы или размера клеток по сравнению с Формованный сигарные клеток U. maydis.
  5. Во время ЕКСtrifugation готовят protoplasting раствор (12,5 мг / мл триходерма лизировать ферментов, в ГКС, подготовить 3 мл на осадку клеток, фильтр стерилизуют через фильтр с диаметром 22 мкм, раствор должен быть свежим для оптимальной ферментативной активности). ГКС является осмотический стабилизатор, чтобы предотвратить разрыв протопластов при удалении клеточной стенки.
  6. Ресуспендируют осадок в 2 мл раствора protoplasting. Выдержите в течение от 5 до 20 мин при комнатной температуре и проверить под микроскопом , пока от 30 до 40% клеток не являются круглыми или как pinheads (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги на льду с этого момента и обрабатывать протопластов с осторожностью!
  7. Промыть 3 раза в 10 мл холодного (4 ° С), ГКС, центрифуге при 1000 х г в течение 5 мин.
  8. Ресуспендируют осадок в 10 мл холодного сорбита, раствор Трис HCl, CaCl 2 (STC), спина при 1000 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл холодного STC, составляют 100 мкл аликвоты в охлаждаемых трубок. Замораживание аликвот при -80 ° С до дальнейшего использования.

3. Трансформация U. maydis

Примечание: Преобразование U. maydis протопласты опирается на полиэтиленгликоль (ПЭГ) , опосредованной метод трансформации, который является технически простым и в отличие от электропорация или баллистической трансформации не требует специального оборудования.

  1. Подготовьте двухслойных пластин выбора (2 пластин в реакции превращения). Нижний слой содержит антибиотик в удвоенном концентрации. Внесите 12 мл RegLight, содержащих 400 мкг / мл гигромицина (или 300 мкг / мл nourseothricin или 4 мкг / мл карбоксин или 1 мг / мл G418) в чашку Петри. Избегайте пузырьков.
    Примечание: нижний слой пластины могут храниться несколько дней при температуре 4 ° С, но приготовить верхний слой свеже в процессе трансформации (см ниже).
  2. Оттепель протопласты на льду (1 туба / преобразование). Добавить 1 мкл гепарин (15 мг / мл). Добавьте 1 мкг ДНК (линеаризуется конструкт) или 10 мкл H 2 O (контроль воды). Инкубировать в течение 10 мин на льду.
  3. В это время для верхнего слоя распространяется 12 мл сжиженные RegLight (кипение и охлаждают до 60 ° С) на RegLight нижней пластине.
    Примечание: Этот слой не содержит антибиотики.
  4. Добавить 500 мкл STC / ПЭГ (полиэтиленгликоль) к трубке преобразования (3. 2) и тщательно перемешать переворачивая пробирку. Инкубировать 15 мин на льду.
  5. Раздайте каждой реакции трансформации на двух двухслойных RegLight пластин. Осторожно и медленно Spread со стеклянной пипеткой. Инкубируйте пластины в вертикальном положении при температуре 28 ° С в течение от 5 до 7 дней до тех пор , пока трансформанты растут как колонии. Получают около 100-200 колоний на чашку.
    Примечание: Более низкие значения могут быть вызваны "плохими" протопластов, которые либо содержат слишком много клеточной стенки и, следовательно, не могут занимать ДНК или не могут регенерировать. Первый может быть проверена путем трансформации самореплицирующегося плазмиды, последняя путем тестирования регенерации на пластинах без антибиотиков.
  6. Подготовьте YEPS-легкие пластины, содержащие соответствующий антибиотик при 200 мкг / мл гигромицину (или 150 мкг / мл nourseothricin или 2 мкг / мл карбоксин или 500 мкг / мл G418, эти концентрации равные половины от той, которая используется для нижних пластин). Повторно очистить по крайней мере 24 предполагаемых трансформантов колонии на этих пластинах. Одиночные колонии должны быть получены. В то же время полоса из исходного штамма на неселективной средах.
    Примечание: Пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1-2 недель.

4. Проверка правильного ДЕЛЕЦИЯ События

ПРИМЕЧАНИЕ: мутации проверяются в процедуре трехступенчатого (рисунок 1). Во-первых, кандидаты, которые содержат дикого типа копии гена исключены с помощью ПЦР. Во-вторых, интеграция сопротивления кассеты в локусе проверяли с помощью ПЦР. В-третьих, интеграция сопротивления кассеты только в желаемый локус проверяется с помощью Саузерн-блот-анализом. Тщательный проверка штамм еззеntial, так что мутантные фенотипы действительно коррелирует с удалением.

  1. Первый диагностический ПЦР 20
    1. Дизайн праймеров спаривания в гене , чтобы исключить этот результат в виде произведения 250-600 п.н. (рисунок 1). Такие небольшие продукты легко амплификации в ПЦР колоний, и достаточно долго для обнаружения в стандартной гель-электрофореза.
    2. Для каждого кандидата и исходного штамма в качестве положительного контроля, ресуспендируют мало-битную (количество булавочной головки) из клеточного материала одной колонии с зубочисткой в ​​20 мкл 0,02 М NaOH. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
      Примечание: Используйте свежие колонии. Если пластины старше 1 недели повторной полосы, чтобы получить свежую колонию.
    3. Используйте 1 мкл клеточной суспензии для ПЦР немедленно. Запуск стандартной реакции ПЦР и анализ полученных фрагментов.
      Примечание: Эти образцы не могут быть сохранены.
      Примечание: Этот ПЦР-тесты на присутствие гена дикого типа, и тем самым позволяет быстро идентифицировать отрицательного Дисidates, в котором ген, представляющий интерес не был заменен. Клоны приносящие полосы в этой реакции ПЦР будет отброшен. Один из таких негативный клон должен в любом случае быть увлекаются в качестве дополнительного отрицательного контроля. Кандидаты без продукта ПЦР должны быть дополнительно проанализированы. Для генов без вредного воздействия примерно половина кандидатов должно содержать ген дикого типа, в то время как другая половина не должна приводить к группе. Это соответствовало бы гомологичной скорость рекомбинации 50%.
  2. Во-вторых диагностический ПЦР
    1. Приготовление геномной ДНК.
      Примечание: геномную ДНК (гДНК) могут быть получены с использованием двух различных протоколов. Первый включает в себя токсичных реагентов, таких как фенол и хлороформ, и, следовательно, должны быть обработаны только опытными исследователями (описанных в 4.2.1.1 до 4.2.1.5), а второй также могут быть обработаны менее опытными студентами (описанных в 4.2.1.6 до 4,2. 1.11). Оба протокола надежно работают. Шаг 4.2.1.1 одинакова для обоих protocолы.
      1. Привить 5 мл YEPS-Light с каждым кандидатом и инкубировать на вращающемся колесе в течение 24 ч при 28 ° С. Отбросьте 2 мкл культуры на СМ пластине. Держите культуру стерильно.
        Примечание: Ниже приведен стандартный протокол (ВНИМАНИЕ: токсичные шаги).
      2. Положите 1 мерную ложку (~ 200 мкл) HCl-вымытых стеклянных шариков 2 мл пробирки. Добавить 2 мл U. maydis культура. Спин 12000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант (осадок может быть заморожен на этой стадии). Добавить 500 мкл смеси фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (25: 24: 1) к осадку. ВНИМАНИЕ! Фенол TOXIC!
      3. Добавить 500 мкл Усти-лизиса буфер 1. встряхивают в течение от 6 до 10 мин на Vibrax при 1000 оборотах в минуту. Убедитесь, что клеточный осадок ресуспендировали полностью, но избежать дополнительных встряхивая, чтобы предотвратить приложение сдвигового усилия к гДНК. Спин при 12000 мкг в течение 15 мин. Передача 400 мкл водной фазы в новую реакционную трубку (не прикасайтесь к интерфазу).
      4. Добавить 1 мл 100% (об / об) этанола. Обратить 3x трубки перемешать, соблюдать гргромко ДНК, которая в скором времени появится. Спин при 12000 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и промывали 200 мкл 70% этанола. Не ресуспендируют осадок на этой стадии.
      5. Удалить супернатант полностью (не позволяйте осадок полностью высохнуть). Добавить 50 мкл ТЕ / РНКазы. Растворите GDNA при встряхивании со скоростью 400 оборотов в минуту при 50 ° С в течение 10 мин. Анализ 2 мкл гДНК на агарозном геле 20 0,8%.
        Примечание: Приведенные ниже шаги включают альтернативный нетоксичного протокол.
    2. Альтернативный способ получени геномной ДНК
      1. Положите 1 мерную ложку (~ 200 мкл) HCl промывают стеклянные шарики 2 мл пробирки. Добавить 2 мл U. maydis культура и спина при 12000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант (гранулы могут быть заморожены на этой стадии).
      2. Добавить 500 мкл буфера для лизиса Усти 2 к осадку. Встряхивают в течение 5 до 15 минут на Vibrax при 1000 оборотах в минуту. Убедитесь, что клеточный осадок ресуспендировали полностью.
      3. Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение от 15 до 20 мин. Использование APPROтаже инкубаторы предназначены для размещения 2 мл трубки имеет решающее значение. Затем поместите его на льду в течение 5 мин.
      4. Добавить 100 мкл 8 М ацетата калия, вихревым или инвертировать 8 до 10 раз. Спин 12000 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре.
      5. Передача 500 мкл супернатанта в свежую 1,5 мл пробирку и добавляют 400 мкл изопропанола. Vortex или инвертный от 8 до 10 раз. Спин 12000 мкг в течение 15 мин. Удалить супернатант и промывают 500 мкл 70% этанола. Спин 12000 мкг в течение 5 мин.
      6. Замочить от супернатанта полностью! В конце концов, добавить короткий спин (10 сек), чтобы удалить остатки жидкости. Пусть ДНК гранулы высохнуть в течение от 3 до 5 мин. Добавить 50 мкл ТЕ / РНКазы и инкубировать при 50 ° С в течение от 10 до 15 мин при 400 оборотах в минуту.
    3. ПЦР
      1. Дизайн двух пар праймеров с одним из них связывания вне флангах и соответствующий один связывающий в пределах сопротивления кассете (UF-F, RC-R, RC-F, DF-г, рис 1) 9.
      2. Используйте 1 мкл 1:10 разведения гДНК каждого Candidate в качестве матрицы в 2 -х реакций ПЦР проверки правильности вставки вверх и вниз по 9.
      3. Используйте стандартные реакции ПЦР для каждого кандидата и анализа полученных фрагментов 22.
        Примечание: Эти ДЗП испытания для вставки сопротивления кассеты в правильной геномного локуса. Если продукты получены для обеих сторон, то кандидат, скорее всего, правильное введение. Тем не менее, также кандидаты, где могут быть подтверждены только одна сторона (выше или ниже) следует проводить с собой для дальнейшего анализа в случае реакции ПЦР просто не на один фланг.
  3. Проверка Correct геномных вставки по Южной блот - анализ 22
    1. Дайджест 15 мкл гДНК (4.2.1) мутантных кандидатов и соответствующий штамм дикого типа / клеток-предшественников с помощью соответствующего фермента, который разрезает вне локуса / построить и кроме того, отсекает либо в гене или в сопротивлении кассетой, ведущей к четко расстояниеinguishable модели (рисунок 1) 8.
      Примечание: Ни один из ожидаемых диапазонов не должно быть больше, чем 10 т.п.н., так что они хорошо различимы от непереваренной ДНК.
    2. Используйте вверх по течению и вниз по течению фланг в качестве зондов. Для того, чтобы обозначить их, например, с помощью маркировки Kit PCR DIG или любой подобный стандартный метод. Смешайте меченых зондов в 1: молекулярном соотношении 1 и осуществляют Саузерн-блоттинга. Должно быть не менее двух независимых трансформантов правильные.
      Примечание: Шаблон дикого типа должно быть ясно обнаруживается в исходного штамма и правильные клоны должны содержать только ожидаемые полосы. Дополнительные полосы только присутствующие в кандидаты указывают на другие инсерции конструкции в неправильном локуса. Такие клоны должны быть отброшены. Отрицательный кандидат определены в первой диагностической ПЦР должен содержать дикого типа полос и полос (непредсказуемые в размер) ошибочно интегрированной удаления конструкции.
  4. Глицерин запасам
    Примечание: запасы Глицерин служат для поддержания клонов в течение многих лет в коллекции штаммов. По крайней мере, два независимых трансформантов должны быть сохранены для каждого мутанта. Это позволяет сравнивать фенотипы, которые должны быть одинаковыми.
    1. Расти 5 мл культуры подтвержденных мутантных штаммов в YEPS-Light на вращающемся колесе в течение 24 ч при 28 ° C Смешайте 500 мкл каждой культуры с 500 мкл NSY-глицерол-среде. Обратить трубки до культуры и среда не хорошо перемешивается. Глицерин в среде предотвращает образование кристаллов льда.
    2. Замораживание при -80 ° С. Повторная полоса часть замороженной культуры, чтобы проверить, является ли запас функциональной.

5. Микроскопические фенотипы

  1. Grow 5 мл культур дикого типа и мутантных штаммов в YEPS-Light на вращающемся колесе в течение 12 ч при 28 ° С.
  2. На следующий день, развести культуру до OD 600 около 0,1 и вырастить его до 600 с наружным диаметром от 0,5 до 0,7. OD 600 1,0 - корреспондентдах примерно от 1 до 2 х 10 7 U. maydis клеток на мл.
  3. Проверьте морфологии клеток микроскопически.
    Примечание: здоровые клетки появляются в форме сигары (рисунок 4, WT). Выраженные вакуоли или образование нити указывают, что клетки подчеркнуты.
    Примечание: В зависимости от ожидаемого мутантного фенотипа, анализ может быть адаптирован, например, если штаммы репортер используют соответствующий анализ может быть осуществлен на данном этапе. Если ячейка морфология изменяется статистический анализ должен быть проведен, например, для определения длины средней ячейки.

6. Заражение Анализ

Примечание: Анализ рассада инфекция была визуализированы ранее в этом журнале 11. Он может либо осуществляться с использованием гаплоидный, solopathogenic фона штамм , такой как SG200 10 или путем смешивания совместимых брачных партнеров , которые оба несут мутации.

  1. Растут по меньшей мере, 40 кукурузы саженцев наШтамм в течение 7 дней при световом цикле 16 ч, 200 мкЕ, 28 ° C / 22 ° C (день / ночь). Они должны быть на стадии 3-го листа и 10-15 см в высоту в день инфицирования.
  2. За два дня до заражения, начинают предварительной культуры штаммов в 5 мл YEPS-света на вращающемся колесе в течение 24 ч при 28 ° С. Вырастить основную культуру в 50 мл YEPS-Light до OD 600 = 1,0 (клеточного деления скорости = 2 ч, позволяют 3 делений минимум, можно сделать O / N).
  3. Спин вниз клетки 50 мл культуры при 1500 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант. Вымойте 3x стерильной H 2 O. Ресуспендируют клеток в стерильной H 2 O до OD 600 3,0. При необходимости смешивать брачных партнеров.
  4. Вводят 250 - 500 мкл суспензии клеток в стволе 7-дневных проростков кукурузы с помощью небольшой шприц. С помощью стерильного H 2 O в качестве контроля. Хранить инфицированные рассаду в течение дополнительных 7-14 дней в тех же условиях освещения и температуры. Оценка фенотип каждого Посадиогласно здорового, хлороза, антоцианов образование, небольших опухолей, крупных опухолей, мертвых растений 10.
    Примечание: Подсчет очков может быть сделано еще в 7 дней и повторяется через 14 дней, чтобы следовать за инфекции в течение долгого времени.

Результаты

Делеционные конструкции для всех четырех хитинолитических генов , закодированных в U. maydis генома были получены путем клонирования Golden Gate с использованием кассеты HYGR для удаления CTS1, то NaTr для удаления Cts2, то G418R кассета для удаления cts3 ...

Обсуждение

Этот протокол описывает , как генерировать делеционных мутантов для обратного генетических исследований в U. maydis. Отправной точкой является делеция конструкция , которая содержит фланкирующие последовательности гена представляющей интерес , содержащий последовательности около ...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Особая благодарность д-ром Бенедиктом Steuten за критическое прочтение рукописи. Оригинальный работа над хитиназы была проведена доктором Торстен Ланглер. Лаборатория VG поддерживается кластером передового опыта в области растений наук (CEPLAS, DFG EXC 1028) и BioSC, лаборатория KS поддерживается BioSC. KB поддерживается BioSC. Научная деятельность биоэкономике научного центра (BioSC) при финансовой поддержке Министерства инноваций, науки и исследований в рамках NRW Strategieprojekt BioSC (№ 313 / 323-400-00213). LF поддерживается докторская общение 1525 iGRADplant DFG International Training Group Research.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

Ссылки

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

115Ustilago maydis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены