JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。

要約

遺伝子欠失は、遺伝子機能の解析に重要な役割を果たしています。目的の方法で遺伝子を破壊するための最も効率的な方法の一つは、相同組換えを介して選択可能なマーカーで遺伝子全体の交換です。相同組換えの際に、DNAの交換は、高い類似性を有する配列との間で行われます。従って、標的遺伝子に隣接する線形ゲノム配列は、具体的には、所望の組込み部位を選択可能なマーカーを指向するために使用することができます。欠失コンストラクトの平滑末端は細胞のDNA修復系を活性化し、それによって、相同組換えを介して、または非相同末端接合のいずれかによって、構築物の統合を促進します。効率的な相同組換えを有する生物では、成功した遺伝子欠失の割合は、50％以上がこの戦略の貴重な遺伝子破壊システム作りに到達することができます。黒穂菌ウスチラゴmaydisは 、このような効率的な相同recombinatを示す真核生物のモデル微生物でありますイオン。その約6,900の遺伝子のうち、多くは、機能的欠失変異体を利用して特徴づけされており、遺伝子の本質的な機能で遺伝子置換試行点の失敗を繰り返しました。蛍光マーカーまたは予測ドメインの変異とタギングによる遺伝子機能のその後の特徴付けはまた、相同組換えを介したDNA交換に依存しています。ここでは、Uを発表します最も簡単な例を用いて詳細に歪み生成戦略、遺伝子欠失をmaydis。

概要

ウスチラゴmaydisは何十年も1,2のために広く研究されてきた植物病原性のモデル菌です。それは2つの形態、酵母様、非病原性ステージと糸状、感染型3内に存在します。このような相同組換えおよびDNA修復機構としてユニバーサル画期的な発見は、この菌4の酵母様成長段階で行われました。また、感染症のための重要な感染性フィラメントと病原性因子への形態学的スイッチは5,6を十分に特徴づけされています。このスマット菌の生物学と病原性についての増加分子の知識は、優れたゲノムアノテーション10と使用して、逆遺伝学の容易さ、 例えば 、当研究所ではよく組織プラスミドコレクション（HTTPでサポートされている簡単な遺伝子置換戦略7-9に依存しています：//www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。トウモロコシの中で標準化され、急速な感染アッセイeedlingsは、病原因子11の詳細な研究を可能にします。

U.のゲノムmaydisは、約6900の遺伝子10が含まれています 。その機能を研究するために、それらが原因で、効率的な相同組換え系を個別にまたは組み合わせて削除することができます。完全に相同末端を含む約1キロバイトの隣接領域は、相同組換え率50％より多くのための理想的ですが、すでに非相同末端を有する250bpのは、構造9の正しい統合をある程度可能にします。現在、5異なる耐性カセット、ハイグロマイシン、カルボキシン、ヌーセオスリシン、G418およびフレオマイシンに対する耐性を仲介hygR、cbxR、NATR、G418R、およびphleoRは 、形質転換体7,9を選択するために使用されています。また、ハイグロマイシン耐性、異種FLPリコンビナーゼ12の一過性発現によって除去することができる再利用可能なカセット（FRT-hygR）に開発されています。これは、耐性カセットの除去とそれによって理論的には無限の遺伝的改変を可能にします。フレオマイシン新しいカセットと、リサイクルhygRカセット特にphleoRの使用が減少されるように、13変異原性です。四重変異体は、このように他の4つのカセットを使用して生成することができますが、五重変異体について、FRT-hygRシステムは、14をお勧めします。

この一般的な遺伝子欠失戦略は成功し、このようなSporisoriumのreilianum 15、Uのような他の黒穂菌類に転送されましたhordei 16、またはU.エスクレンタ 17したがって、効率的な相同組換えシステムとまだ遺伝的難治生物におけるさらなる応用の可能性を提供しています。関与する遺伝子の欠失によって例示されるようにまた、相同組換えを欠く生物が遺伝子操作を改善するために修飾することができる非相同エンD-参加アカパンカビ 18,19インチ

ここでは、Uのための公開された遺伝子欠失戦略を説明します候補者の迅速かつ正確な検証を中心とした実験的な詳細に7,9を maydis。例として、我々は真菌キチナーゼを使用して、単一変異体の生成だけでなく、複数の欠失株20,21を示しています。彼らは剛性の細胞壁にキチンに作用するためのキチナーゼは、興味深い例です。細胞壁リモデリングは、細胞分裂、糸状成長へのスイッチ、および胞子形成の間に形態学的変化のために必要とされます。従って、欠失変異体でライフサイクル全体の表現型が期待できます。

プロトコル

削除構築物の1世代

  1. それぞれの1 kbの上流側の脇腹（UF）及び下流側腹部（DF）それぞれ鈍い切断制限部位に隣接し、適切な耐性カセットを含む欠失構築物（ 図1）を含むプラスミドを生成します。
    注：任意のクローニング戦略は、我々はそのようなプラスミド9のためのゴールデンゲートのクローニングをお勧めします（クローニングのための基準22を参照）を使用することができます。
  2. 物品税の削除は、削除コンストラクト91μgのDNAを得るために、鈍いカッターを使用してプラスミドから構築します。酵素を除去し、市販の試薬を使用して、22 などを緩衝し、製造業者の指示に従うように欠失構築物を精製します。
    注：ベクター骨格は、形質転換混合物中に残ることができます。

プロトプラストの調製

注：電子のすべての時間中に無菌状態を保ちますxperiment。細胞壁は、細胞膜への分子のアクセスを制限する強い保護バリアです。欠失構築物を含むDNAの取り込みを可能にするために、細胞壁はプロトプラスト反応において細胞壁分解酵素により除去する必要があります。プロトプラストの調製における重要なステップは、媒体の1）浸透圧安定化され、2）プロトプラストに機械的ストレスを避けること。

  1. マーク2プロトプラストを凍結し、-20℃で、それらを冷却するための丸底付きmlチューブ。希望の遺伝的背景を持つ株の新鮮なプレートから3ミリリットルYEPS-ライトで前培養を開始します。 28℃で24時間、回転ホイール上でインキュベートします。
    注：株はsolopathogenic株SG200 10、野生型株は、このようなAB33 23、または二重変異体の生成のための任意の変異体背景として試験菌株することができます。株は、所望の抵抗の自由であることを確認してください。
  2. バッフルのFLAに50ミリリットルYEPS-ライトでの培養を希釈kおよび200rpmで、28℃でオービタルシェーカー上でインキュベートします。
    注：倍加時間は、野生型株では約2時間です。 3重複の最小値を許可します。
  3. 指数増殖期まで成長します。 600 nmの（OD 600）の波長で測定された光学密度は、約0.8（0.6〜1.0が許容可能である）であることを確認してください。 OD 1.0の600は、約1 U. 7〜2×10に対応しますミリリットル当たりの細胞をmaydis。
  4. 顕微鏡下で汚染について細胞を確認してください。 40倍の倍率を使用してください。 5分、1,500×gでの完全な50ミリリットルの培養物の細胞をペレット化し、上清を捨てます。 25ミリリットルのクエン酸ナトリウム、ソルビトール溶液（SCS）、遠心5分、1,500×gで中にペレットを再懸濁し、上清を捨てます。
    注：細菌汚染が小さく、頻繁に移動する細胞として同定することができます。真菌汚染がUの葉巻状細胞と比較して異なるセルの形状や大きさに基づいて同定することができますmaydis。
  5. CENの間trifugationは、プロトプラスト溶液を調製（12.5 mg / mlでトリコデルマは SCS中の酵素を、溶解、細胞ペレット当たり3ミリリットルを準備し、フィルタは22μmのフィルターを通して滅菌;ソリューションは、最適な酵素活性のために新鮮でなければなりません）。 SCSは、細胞壁を除去するとプロトプラストの破裂を防止するための浸透圧安定剤です。
  6. ソリューションをプロトプラスト2mlにペレットを再懸濁。 RTで5〜20分間インキュベートし、細胞の30〜40％が円形またはpinheads（ 図2）のようなものまで、顕微鏡下で確認してください。
    注：今から氷の上のすべてのステップを実行して、注意してプロトプラストを扱います！
  7. 10ミリリットルの冷（4°C）SCSでの洗浄3回、5分間1,000×gで遠心。
  8. 10ミリリットル中にペレットを再懸濁冷たいソルビトール、トリスHCl、 塩化カルシウム溶液（STC）、5分間千×gでスピンし、上清を捨てます。 1ミリリットルの冷STCにペレットを再懸濁し、冷却チューブに100μlのアリコートを作ります。さらに使用するまで-80℃でアリコートを凍結します。

Uの3変容maydis

注：Uの転換maydisプロトプラストは、技術的に簡単で、特別な装置を必要としないエレクトロポレーションまたは微粒子銃形質転換に反対であるポリエチレングリコール（PEG）媒介形質転換方法に依存しています。

  1. 2層構造の選択プレート（形質転換反応あたり2板）を準備します。底層は倍濃度の抗生物質が含まれています。 400 / mlのハイグロマイシンを含むRegLightのピペット12ミリリットル（または300 / mlのヌーセオスリシンまたは4 / mlのカルボキシンまたは1 mg / mlでのG418）ペトリ皿に。気泡を避けてください。
    注：ボトム層プレートは4℃で数日保存されているが、（下記参照）変換時に新鮮にトップ層を作製することができます。
  2. 氷上で解凍プロトプラスト（1チューブ/変換）。 1μlのヘパリン（15 mg / mlで）を追加します。 1μgのDNA（線状化構築物）または10μlのH 2を追加します。 O（水対照）。氷上で10分間インキュベートします。
  3. この時間の間に、上位層のためRegLight底板上にRegLight（沸騰し、60℃に冷却）に液化12ミリリットルを広げます。
    注：この層は、抗生物質が含まれていません。
  4. 変態チューブ（3 2）に500μlのSTC / PEG（ポリエチレングリコール）を追加し、チューブを反転させて慎重に混ぜます。氷上で15分間インキュベートします。
  5. 二層RegLightプレート2上の各形質転換反応を配布します。ガラスピペットで慎重にゆっくりと広がった。形質転換体は、コロニーとして成長するまで5〜7日間28℃で直立プレートをインキュベートします。プレートあたり約100から200個のコロニーを取得します。
    注：下の数字は、どちらかがあまりにも多くの細胞壁を含んでいるため、DNAを取ることができない、または再生することはできません "悪い"プロトプラストによって引き起こされている可能性があります。前者は自己複製プラスミド、抗生物質を含まないプレート上で再生をテストすることにより、後者を用いた形質転換によって試験することができます。
    6. <李> 200 / mlのハイグロマイシン（;ボトムプレートに使用されるもののこれらの濃度と等しい半分または150 / mlのヌーセオスリシンまたは2 / mlのカルボキシンまたは500 / mlのG418）で、適切な抗生物質を含むYEPS-光板を準備します。これらのプレート上の少なくとも24の推定上の形質転換体コロニーを再精製します。単一のコロニーを得られるはずです。非選択培地上の元の歪みアウト同時にストリークで。
    注意：プレートを1〜2週間4℃で保存することができます。

正しい削除イベントの4検証

注：変異は、三段階の手順で確認している（ 図1）。まず、遺伝子の野生型コピーが含まれている候補者は、PCRによって除外されています。第二に、遺伝子座への耐性カセットの組み込みは、PCRによって確認されます。第三に、唯一の所望の軌跡への耐性カセットの組み込みは、サザンブロット分析によって確認されます。慎重な歪みの検証がESSEです変異体の表現型は本当に削除と相関するように、ntial。

  1. 最初の診断PCR 20
    1. 250〜600塩基対（ 図1）の生成物に、その結果を削除する遺伝子における設計プライマー対。このような小さな製品は、コロニーPCRで増幅することが容易であり、標準的なゲル電気泳動での検出のために十分に長いです。
    2. 各候補者と陽性対照として、元の株について、20μlの0.02 M NaOH中の爪楊枝でシングルコロニーの細胞物質の少し（ピンヘッドの量）を再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。
      注：新鮮なコロニーを使用してください。プレートは、新鮮なコロニーを得るために再ストリーク1週間以上経過している場合。
    3. すぐにPCR用の細胞懸濁液1μLを使用してください。標準的なPCR反応を実行し、得られた断片を分析します。
      注：これらのサンプルを保存することはできません。
      注：このPCR野生型遺伝子の存在について試験し、それによって負CANDの迅速な同定を可能にします目的の遺伝子が置換されていないでidates。このPCR反応においてバンドを生じるクローンは破棄されます。そのような負のクローンがとにかく追加の陰性対照として運ばれるべきです。 PCR産物のない候補者は、さらに分析する必要があります。他の半分はバンドになるべきではありませんしながら、有害な影響のない遺伝子について候補者の約半分は、野生型の遺伝子が含まれている必要があります。これは50％の相同組換え率に対応します。
  2. 第2の診断PCR
    1. ゲノムDNAの調製。
      注：ゲノムDNA（gDNAを）は、2つの異なるプロトコルを使用して調製することができます。最初は、それゆえ、フェノールやクロロホルムなどの有毒な試薬を必要とする第二も、経験の少ない学生で扱うことができるが、4.2に4.2.1.6で説明した（だけ（4.2.1.5を4.2.1.1に記載されている）経験豊富な研究者によって処理されるべきです。 1.11）。どちらのプロトコルも確実に作業しています。ステップ4.2.1.1は両方protocで同じですオール。
      1. 各候補に5ミリリットルYEPS-ライトに接種し、28℃で24時間、回転ホイール上でインキュベートします。 CMプレート上で培養2μLをドロップします。無菌培養しておいてください。
        注：以下は、標準的なプロトコル（：毒性の手順注意）です。
      2. 2ミリリットルチューブに塩酸洗浄したガラスビーズの1スクープ（〜200μl）を入れてください。 Uの2ミリリットルを追加します。 maydis文化 。 5分間、12,000×gでスピン。上清を捨て（ペレットは、この段階で凍結することができます）。 （：24：1〜25）ペレットに500μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを追加します。注意！フェノールは有毒です！
      3. 1000rpmでvibraxに500μlのウースチー-溶解緩衝液を6〜10分間1.シェイクを追加します。細胞ペレットを完全に再懸濁されていることを確認したが、gDNAをのせん断を防止するために、揺れ拡張避けます。 15分間、12,000×gでスピン。新しい反応管に水相400μlのを転送（相間には触れないでください）。
      4. （v / v）エタノール1ミリリットル100％を追加します。 Cを観察、混合するためにチューブの3倍を反転すぐに表示されたDNAの大声。 5分間、12,000×gでスピン。上清を除去し、200μlの70％EtOHで洗浄します。この段階でペレットを再懸濁しないでください。
      5. （ペレットが完全に乾燥させてはいけない）完全に上清を取り除きます。 50μlのTE / RNアーゼを追加します。 10分間50℃で400rpmで振盪することによりたgDNAを溶解します。 0.8％アガロースゲル20上のgDNAの2μLを分析します。
        注：以下の手順は、代替の非毒性のプロトコルを備えます。
    2. ゲノムDNAの代替準備
      1. HClを1スクープ（〜200μl）を入り、2 mlチューブにガラスビーズを洗浄しました。 Uの2ミリリットルを追加します。 5分間、12,000×gでの文化やスピンをmaydis。上清を捨て（ペレットは、この段階で凍結することができます）。
      2. ペレットに500μlのウースチー溶解バッファー2を追加します。 1000rpmでvibraxに5〜15分間振ります。細胞ペレットを完全に再懸濁されていることを確認します。
      3. 15〜20分間、65℃でチューブをインキュベートします。アプロを使用しました2ミリリットルチューブをホストするように設計されたpriateインキュベーターは重要です。その後、5分間氷上に置きます。
      4. 100μlの8 M酢酸カリウム、渦を追加または8〜10回転倒。 RTで15分間、12,000×gでスピン。
      5. 新しい1.5mlチューブに上清の500μLを移し、400μlのイソプロパノールを追加します。ボルテックスあるいは反転8〜10倍。 15分間、12,000×gでスピン。上清を除去し、500μlの70％EtOHで洗浄します。 5分間、12,000×gでスピン。
      6. 完全に上清ソークオフ！最終的には、残留液体を除去するために、短いスピン（10秒）を追加します。 3〜5分間、DNAペレットが乾燥してみましょう。 50μlのTE / RNA分解酵素を添加し、400rpmで10〜15分間50℃でインキュベートします。
    3. PCR
      1. デザインそれらの一方が（UF-F、RC-R; RC-F、DF-R、 図1）側面の外側に結合および耐性カセット内のバインディングいずれかを対応有する2つのプライマー対9。
      2. すべてのCののgDNAの1:10希釈の1μLを使用しますandidate 2のPCR反応におけるテンプレートとして上流と下流の9正しい挿入を検証します。
      3. 各候補者のための標準的なPCR反応を使用して、断片22を得られた分析。
        注：これらのPCRは正しいゲノム遺伝子座における耐性カセットの挿入をテストします。製品は両側のために得られた場合、候補者はおそらく正しい挿入です。しかし、片側のみ（上流または下流）も候補は、PCR反応は、単に1のフランクに失敗しました場合には、さらなる分析のために沿って行われるべきで確認することができました。
  3. サザンブロット分析22によって正しいゲノム挿入の検証
    1. 15変異体候補のgDNAをμlの（4.2.1）および遺伝子座の外/建設し、加えて切断する適切な酵素を用いて、対応する野生型/前駆細胞株、遺伝子または明確のdistにつながる耐性カセットのいずれかでカットをダイジェストinguishableパターン（ 図1）8。
      注：彼らは明らかに未消化のDNAと区別されるように期待されるバンドのいずれも、10キロバイトより大きくてはなりません。
    2. プローブとして、上流と下流の脇腹を使用してください。例では、PCR DIGラベリングキットまたは任意の同様の標準的な方法を使用するためにそれらを標識するために。 1で標識したプローブを混ぜる：1分子比およびサザンブロットを行います。少なくとも2つの独立正しい形質転換体を保管してください。
      注：野生型のパターンは、元の株で明らかに検出すべきであり、正確なクローンのみが予想されるバンドが含まれている必要があります。候補者にのみ存在する追加のバンドは、間違った軌跡内に構築物の他の挿入を示しています。このようなクローンは破棄されるべきです。最初の診断PCRで同定された負の候補者が誤って統合され、削除構築物の野生型バンドと（サイズは予測できない）バンドを含める必要があります。
  4. グリセロールストック
    注：グリセロールストックは、歪みのコレクションに年間のクローンを維持するのに役立ちます。少なくとも二つの独立した形質転換体は、各変異体のために維持されるべきです。これは、同一でなければなら表現型を比較す​​ることができます。
    1. 500μlのNSY-グリセロール培地での各培養物の28°Cミックスを500μlで24時間、回転ホイール上YEPS-ライトで確認された変異株の5ミリリットルの文化を育てます。文化とメディアが十分に混合されるまでチューブを反転。培地中のグリセロールは、氷結晶の形成を防止します。
    2. -80℃で凍結します。再ストリーク在庫が機能しているかどうかをテストするための凍結培養物の一部。

5.微視的表現型

  1. 28℃で12時間、回転ホイール上YEPS-ライトで野生型および変異株の5ミリリットルの文化を育てます。
  2. 次の日は、約0.1のOD 600に文化を希釈し、0.5と0.7の間のOD 600までそれを成長させます。 1.0 correspのOD 600秒単位約1 7〜2×10 Uにミリリットル当たりの細胞をmaydis。
  3. 顕微鏡で細胞の形態を調べます。
    注：健康な細胞は葉巻形（ 図4、WT）を表示されます。発音液胞またはフィラメント形成は、細胞がストレスを受けていることを示しています。
    注：予想突然変異表現型に応じて、分析をレポーター株が使用される場合、例えば 、適切なアッセイがこの段階で行うことができ、適合させることができます。細胞の形態を変更した場合、統計的分析は、平均セル長さを決定するために、 例えば 、実施されるべきです。

6.感染アッセイ

注：苗感染アッセイは、本誌11で、以前に可視化されています。これは、いずれかのそのようなSG200 10として、または両方の突然変異を運ぶ互換交配パートナーを混合して半数体、solopathogenic株バックグラウンドを使用して行うことができます。

  1. 当たり少なくとも40トウモロコシの苗を育てます16時間の光周期で7日、200μE、28℃/ 22℃（昼/夜）のための菌株。彼らは3葉期と10〜15センチメートル感染の日に背の高いであるべきです。
  2. 感染の2日前に、28℃で24時間、回転ホイール上で5ミリリットルYEPS-ライトで株の前培養を開始します。最大OD 600〜50ミリリットル YEPS -ライトの主な文化を育てる= 1.0（= 2時間細胞分裂速度、3部門の最小値を許可し、O / N行うことができます）。
  3. 5分間、1500×gで50ミリリットルの培養物の細胞をスピンダウンし、上清を捨てます。滅菌H 2 Oで洗浄3倍OD 3.0の600に滅菌H 2 Oで細胞を再懸濁します。必要に応じて、交配相手を混ぜます。
  4. 小さな注射器を使用して、7日齢のトウモロコシ苗の幹に細胞懸濁液500μlの - 250を注入します。コントロールとして、滅菌H 2 Oを使用してください。同じ光や温度条件の追加の7〜14日のために、感染苗を保管してください。各工場aの表現型をスコア健康、クロロシス、アントシアニンの形成、小さな腫瘍、大きな腫瘍、枯れた植物10にccording。
    注：スコアリングが早く7日として行われ、時間をかけて感染を追跡するために14日目に繰り返すことができます。

結果

U.でエンコードされたすべての4キチン分解遺伝子に対する欠失構築maydisゲノムはCTS1の削除のためにhygRカセットを使用して、ゴールデンゲートクローニングによって生成された、NATR CTS2の削除のため、CTS3の削除とcts4 20の削除のcbxRためG418Rカセット 。遺伝子置換戦略の概要は、CTS3の欠?...

ディスカッション

このプロトコルはU.で逆遺伝学的研究のための欠失変異体を生成する方法について説明しますmaydis。出発点は、それが以前に7,9を最適化したとして、目的遺伝子の約1開始の上流および終止コドンの下流キロバイトだけでなく、適切な耐性カセットの配列を含有するフランキング配列を含む欠失構築物であります。構築物は、個別に各遺伝子のために生成され、慎重に遺?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

原稿の重要な読書のための博士ベネディクトSteutenに感謝します。キチナーゼ上のオリジナル作品は、博士はThorstenラングナーにより行いました。 VGの研究室は、植物科学優秀（CEPLAS、DFG EXC 1028）とBioSCのクラスタでサポートされている、KSの研究室ではBioSCによってサポートされています。 KBはBioSCによってサポートされています。 Bioeconomy科学センター（BioSC）の科学的な活動は財政NRW Strategieprojekt BioSC（第313 / 323-400-00213）の枠組みの中でイノベーション、科学・研究省によってサポートされていました。 LFはDFG国際研究研修グループ1525 iGRADplantの博士課程の交わりによってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

参考文献

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

115 maydis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved