JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Abstract

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Introduction

تم أدوات علم البصريات الوراثي تكتسب شعبية، في جزء منه لأنها يمكن أن تستخدم لفك الأسلاك من مسارات الإشارات 1-4. وهي تستند إلى قدرة بروتينات photoactivatable تغيير على التشكل وملزمة تقارب عندما مضيئة مع الضوء. دمج هذه البروتينات لعناصر إشارات تسمح لتنظيم محدد من لاعب واحد داخل معقدة مسارات الإشارات بين الخلايا 5-12. وبالتالي، فإن مسار الإشارات يمكن دراستها مع القرار الزماني والمكاني عالية.

معظم الدراسات علم البصريات الوراثي القائم على خلية تستخدم أساليب تعتمد على المجهر جنبا إلى جنب مع زراعة في وجود الضوء، تليها تحليل الكيمياء الحيوية 11،12. في المقابل، تدفق singularizes الكريات الخلايا على طول شعري ويقيس حجم الخلية، تحبب وكثافة مضان. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة خلال الفحص المجهري أو البيوكيميائية الطرق، بما في ذلك القدرة على تحليل thousanس من الخلايا في قرار وحيدة الخلية تعيش في وقت قصير جدا. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي.

على حد علمنا، ليس هناك بروتوكول تأسيس لالتدفق الخلوي علم البصريات الوراثي. إجراء مقبولة على نطاق واسع هو إلقاء الضوء خلايا يدويا من خارج أنبوب تفاعل مع الأجهزة مصباح يدوي. ومع ذلك، والإضاءة اليدوية في تدفق يتطلب الكريات ضوء أن يمر من خلال أنبوب رد فعل، ولتصوير الخلايا الحية، أسطواني، وغرفة للمياه ساخنة. هذا يسبب تشتت الضوء كبير وفقدان للضوء. وعلاوة على ذلك، فإن شدة الضوء التي تقدمها إضاءة يدوية ليست استنساخه بين التجارب (زاوية، والمسافة، الخ) وليس هناك حد عملي لعدد من موجات في تجربة واحدة.

عن طريق بناء جهاز LED الحرارية التدفق، كنا قادرين على التغلب على هذه القيود. مع هذا الجهاز، وخلايا يمكن أن تكون مضيئة مع موجات محددة في درجة الحرارةالطريقة أثناء قياس تدفق cytometric التي تسيطر عليها erature. وهذا يسمح لكميات محددة وقابلة للتكرار للضوء داخل وبين التجارب.

للتدليل على فائدة الجهاز لدينا في الجسم الحي، سجلنا إشارة مضان من Dronpa في الخلايا راموس B خلال photoswitching. وتستمد الخلايا راموس B من سرطان الغدد الليمفاوية بوركيت البشري. Dronpa هو ببروتين موجود كما مونومر، ديمر أو tetramer. في شكله أحادى، فمن غير الفلورسنت. الإضاءة مع 400 نانومتر الخفيفة الحث dimerization وtetramerization ويجعل البروتين الفلوري Dronpa. هذه العملية يمكن عكسها من خلال الإضاءة مع 500 نانومتر الخفيفة. وقد استخدم البروتين Dronpa للسيطرة على وظيفة، والمكان من الإشارات البروتينات 4،13.

هنا، أعربنا عن بروتين Dronpa-رابط-Dronpa في الخلايا راموس B لدراسة photoswitching من Dronpa في قياس التدفق الخلوي. استخدام الجهاز لدينا، كنا قادرين على كفاءة وبتكاثر photoswitch Dronpa أثناء تسجيل كثافة مضان في الوقت الحقيقي. وهذه الطريقة توفر مزايا كبيرة عبر بروتوكولات الإضاءة الحالية مع إضاءة يدوية ويوسع بشكل كبير من ذخيرة تجريبي للأدوات علم البصريات الوراثي والمركبات القفص. استخدام الجهاز لدينا سيسهل بشكل كبير والإسراع في اكتشاف وتطوير أدوات علم البصريات الوراثي جديدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم وبناء جهاز

  1. تجارب رائدة
    ملاحظة: شدة الضوء المطلوبة لعلم البصريات الوراثي أداة وخلية نوع معين قد تختلف بشكل كبير. التجارب الرائدة مع نماذج مفيدة لتقدير الحد الأدنى من شدة الضوء اللازمة. الأداة علم البصريات الوراثي المستخدمة في التجارب التالية هي عبارة عن اندماج بناء Dronpa-رابط-Dronpa. تم الحصول على تسلسل Dronpa تجاريا (انظر قائمة من المواد). تم استنساخ ورابط طويلة بين اثنين من سلاسل Dronpa للسماح للبناء أعرب لتشكيل dimers ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ (وبين الجزيئات). الخطوات الموضحة أدناه يمكن أن تتكيف مع العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي الأخرى أو المواد الخاضعة للرقابة بصريا.
    1. تنبيغ الخلايا الليمفاوية B راموس مع Dronpa-رابط-Dronpa تحتوي على بناء باتباع إرشادات الشركة المصنعة لتنبيغ باستخدام طاف تحتوي على فيروسات، من خلايا التعبئة والتغليف. الحصاد وخلايا العد وفقا لمرحلة ما قبلنشرت viously بروتوكول 13.
    2. Resuspend الخلايا بتركيز 1 × 10 6 / مل في المتوسط (RPMI 1640، 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) ونقلها إلى أنبوب زجاجي FACS.
    3. إدراج أنبوب إلى قياس التدفق الخلوي وقياس كثافة مضان من Dronpa (قناة GFP) 14،15.
    4. ارتداء النظارات الواقية لجميع المزيد من الخطوات لحماية العينين من موجات ربما ضارة.
    5. يدويا وضع ضوء 500 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
    6. زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى تنخفض Dronpa كثافة مضان.
    7. يدويا وضع ضوء 400 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
    8. زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى فلوو Dronparescence زيادة كثافة.
    9. استخدام ما لا يقل عن العديد من أضواء LED لبناء الجهاز كما يتوقع أن تكون ضرورية من photoswitching في خطوات 1.1.5 و 1.1.7.
  2. بناء الجهاز
    ملاحظة: تم بناء الجهاز عن طريق متجر بالقطع المهنية، وArbeitsgruppe تكنيك من جامعة فرايبورغ. والعرف معظم أنحاء وغير متوفرة تجاريا. وصفت الأبعاد الدقيقة من كل جزء في أرقام 1 و 2. لتوضيح تجميع هذا الجهاز، التكميلية فيديو 1 يتم توفير وموصوفة أهم الخطوات الأساسية أدناه.
    1. مطحنة قطعة ومن البولي فينيل كلورايد (PVC) مع القياسات الدقيقة هو مبين في الشكل 1A.
    2. إدراج أضواء LED في حفر ثقوب في قطعة ووختم كل ثقب مع الغراء بولي كلوريد الفينيل لمنع تسرب المياه.
    3. توصيل المصابيح على محول متعدد القنوات (كل طول موجي يجب أن تحتل chann منفصلشرم) مع انتاج الطاقة القابلة للتعديل 0-29 مللي أمبير.
    4. إرفاق غمد الخارجي (ب) مع 3 مسامير لقطعة وكما هو مبين لحماية المصابيح من الأضرار المادية.
    5. لتكون قادرة على توصيل الجهاز إلى مضخة المياه، والغراء في لقطات أنبوب (C) في حفر ثقوب في قطعة و(يصور في الشكل 1A، المقطع العرضي Y: 9 ملم و 61.5 ملم) باستخدام الغراء بولي كلوريد الفينيل.
    6. قطع أنبوب زجاجي طويل 58.5 ملم (D1).
    7. تصنيع قطع D2 و D3 من زجاجي كما هو مبين في الشكل 2.
    8. الغراء قطعة D3 إلى أسفل D1 مع زجاجي الغراء.
    9. إرفاق المطاط يا الدائري إلى قطعة D2 والغراء إلى أعلى D1 مع زجاجي الغراء.
      ملاحظة: القطع D1 و D2 و D3 معا تشكل قطعة د.
    10. إدراج قطعة D في قطعة ومع 3 مسامير.
    11. اختبار جهاز لتسرب الماء قبل تطبيق السلطة للمحول.

2. قياس حركية لأداة علم البصريات الوراثي

  1. إعداد الخلايا
    1. ثقافة الخلايا راموس B في RPMI المتوسطة (RPMI 1640، و 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) في كثافة 3- 10 × 10 6 خلية / مل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. حصاد الخلايا راموس B عن طريق الطرد المركزي في 350 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور باتباع إرشادات الشركة المصنعة و resuspend 1-5 × 10 6 خلايا في 600 ميكرولتر المتوسطة.
    4. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS الزجاج، ووضعها على الجليد وحمايتها من ضوء حتى القياس.
  2. إعداد الكريات تدفق والجهاز.
    1. وصل الجهاز إلى مضخة مياه ساخنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. عند استخدام أنابيب زجاجية نظام مراقبة الأصول الميدانية، تبادل سوداء يا الدائري من قياس التدفق الخلوي مع المطاط يا الدائري وبالإضافة إلى تطبيق غرام السيليكونسهولة.
  3. قياس
    1. إدراج بعناية الزجاج FACS أنبوب في الجهاز وتوصيله إلى قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).
    2. بدء تشغيل قياس وتسجيل Dronpa كثافة الفلورسنت (قناة GFP).
    3. إلقاء الضوء على عينة الخلايا مع 400 نانومتر أو 500 نانومتر الخفيفة على التوالي وسجل كثافة مضان Dronpa (قناة GFP).
  4. تحليل البيانات
    1. تحليل البيانات التجريبية مع تدفق مناسب الكريات البرمجيات. مؤامرة مبعثر إلى الأمام ضد مبعثر sideward وبوابة الخلايا الحية. رسم كثافة مضان Dronpa مع مرور الوقت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام التدفق الحراري LED مع عداد الكريات تدفق

جوهر الوظيفي للجهاز هو غرفة اسطوانية يتم ترتيب أضواء بطريقة دائرية لافتا إلى الداخل التي الصمام. هذه القاعة يمكن توصيل إمدادات المياه والمضخات، ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

والحرارية تدفق الصمام هو أداة مبتكرة لدراسة أدوات علم البصريات الوراثي في ​​عداد الكريات التدفق.

حتى الآن، تم مضيئة عينات علم البصريات الوراثي فقط مع الليزر المجهر أو الأجهزة مصباح يدوي 11،12. اعتمادا على زاوية ومسافة المص?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass FACS tubeThermo Fisher Scientific; Waltham, USA14-961-26Borosilicate glass tubes 12x75 mm
Flow CytometerBD Bioscienceg; Heidelberg, GermanyFortessa IISpecial Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, USA41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyUV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mmMaertin; Freiburg, Germany76999
Plexiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Germany692230
Plexiglas 2.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692225
Plexiglas 1.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692215
PVC tile 5 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.005
PVC tile 6 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.006
PVC block 50 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany61870-010
2-MercaptoethanolEMD; Germany805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, GermanyP30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany15140-122
Acrifix plexiglas glueEvonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U glueHenkel, Düsseldorf, Germany

References

  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved