Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Kathrin Brenker; Kerstin Osthof; Jianying Yang; Michael Reth

doi:10.3791/54707

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Resumen

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Resumen

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Introducción

Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de ^1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular ^5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial.

La mayoría de los estudios optogenética basados en células utilizan métodos basados en la microscopía combinado con el cultivo en presencia de luz, seguido de análisis bioquímico ^11,12. Por el contrario, un flujo singulariza citómetro de células a lo largo de un capilar y mide el tamaño celular, la granularidad y la intensidad de fluorescencia. Este método tiene ventajas importantes sobre microscopía o bioquímicos métodos, incluyendo la capacidad de analizar thousands de células a una resolución de una sola célula de vivir en un tiempo muy corto. Por lo tanto, es deseable combinar optogenética con citometría de flujo.

Hasta donde sabemos, no existe un protocolo establecido para citometría de flujo optogenético. Un procedimiento ampliamente aceptado es iluminar manualmente las células desde el exterior del tubo de reacción con dispositivos de linterna. Sin embargo, la iluminación en el manual de flujo requiere citómetro de que la luz pase a través del tubo de reacción y, por imágenes de células vivas, una forma cilíndrica, cámara de agua caliente. Esto hace que la dispersión de luz y sustancial pérdida de luz. Por otra parte, la intensidad de la luz proporcionada por la iluminación manual no es reproducible entre experimentos (ángulo, distancia, etc.) y hay un límite práctico para el número de longitudes de onda en un experimento.

Mediante la construcción del dispositivo de flujo Thermo LED, hemos sido capaces de superar estas limitaciones. Con este dispositivo, las células pueden ser iluminadas con longitudes de onda específicas en un tempratura controlada de forma durante las mediciones de citometría de flujo. Esto permite que las cantidades precisas y reproducibles de la luz dentro y entre los experimentos.

Para demostrar la utilidad de nuestro dispositivo in vivo, se registró la señal de fluorescencia de Dronpa en las células B Ramos durante photoswitching. células Ramos B se derivan de un linfoma de Burkitt humano. Dronpa es una proteína fluorescente que existe como un monómero, dímero o tetrámero. En su forma monomérica, es no fluorescente. Iluminación con luz de 400 nm induce la dimerización y tetramerización y hace que la proteína fluorescente Dronpa. Este proceso puede ser revertido por iluminación con luz de 500 nm. La proteína Dronpa se ha utilizado para controlar la función y la ubicación de las proteínas de señalización de ^4,13.

Aquí, hemos expresado una proteína Dronpa engarce-Dronpa en las células B Ramos para estudiar photoswitching de Dronpa en un citómetro de flujo. El uso de nuestro dispositivo, hemos sido capaces de manera eficiente yreproducible PHOTOSWITCH Dronpa durante la grabación de su intensidad de fluorescencia en tiempo real. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre los protocolos actuales de iluminación con la iluminación manual y amplía considerablemente el repertorio experimental para herramientas optogenética y compuestos jaula. El uso de nuestro dispositivo simplificará significativamente y acelerar el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas optogenética.