LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Zusammenfassung

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Zusammenfassung

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Einleitung

Optogenetische Werkzeuge wurden an Popularität gewinnt, zum Teil , weil sie verwendet werden können , die Verdrahtung von Signal ^1-4 Wege zu entziffern. Sie basieren auf der Fähigkeit von photoaktivierbaren Proteine ​​anhand ihrer Konformation und Bindungsaffinität zu ändern, wenn sie mit Licht bestrahlt. Fusing diese Proteine Signalelemente ermöglicht die spezielle Regelung eines einzelnen Spielers in komplexen intrazellulären Signalwege ^5-12. Folglich kann ein Signalweg mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersucht werden.

Die meisten zellbasierten optogenetische Studien verwenden Mikroskopie-basierten Methoden mit Kultivierungs kombiniert in Gegenwart von Licht, ^11,12 durch biochemische Analyse verfolgt. Im Gegensatz dazu Zytometer ein Fluss singularizes Zellen entlang einer Kapillare und misst Zellgröße, Granularität und Fluoreszenzintensitäten. Dieses Verfahren hat wesentliche Vorteile gegenüber der Mikroskopie oder biochemische Methoden, einschließlich der Fähigkeit zu analysieren thousands von Zellen bei Single-Cell-Auflösung in einer sehr kurzen Zeit zu leben. Daher ist es wünschenswert Optogenetik mit Durchflusszytometrie zu kombinieren.

Unseres Wissens gibt es kein anerkanntes Protokoll für optogenetische Durchflusszytometrie. Ein breit akzeptiertes Verfahren ist die manuelle Zellen von außerhalb des Reaktionsrohres mit Taschenlampe Geräte beleuchten. Allerdings erfordert eine manuelle Beleuchtung im Durchflusszytometer das Licht durch das Reaktionsrohr zu passieren, und für Live Cell Imaging, eine zylindrische, beheizte Wasserkammer. Dies führt zu einer wesentlichen Lichtstreuung und Lichtverlust. Außerdem ist die Lichtintensität durch manuelle Beleuchtung vorgesehen nicht reproduzierbar zwischen den Experimenten (Winkel, Abstand, etc.) und es gibt eine praktische Grenze für die Anzahl von Wellenlängen in einem Experiment.

die LED-Thermo Flow-Gerät Durch die Konstruktion, wir waren in der Lage, diese Einschränkungen zu überwinden. Mit diesem Gerät können die Zellen mit spezifischen Wellenlängen in einem temporären beleuchtbareratur gesteuert während der Messungen durchflusszytometrischen. Dies ermöglicht eine präzise und reproduzierbare Lichtmengen innerhalb und zwischen den Experimenten.

Um die Nützlichkeit unseres Gerätes in vivo zeigen, nahmen wir das Fluoreszenzsignal von Dronpa in Ramos B - Zellen während der Photoschalten . Ramos-B-Zellen von einem humanen Burkitt-Lymphom abgeleitet. Dronpa ein fluoreszierendes Protein, das als ein Monomer, Dimer oder Tetramer vorliegt. In seiner monomeren Form ist es nicht fluoreszierend. Beleuchtung mit 400 nm-Licht induziert die Dimerisierung und Tetramerisierung und macht das Dronpa Protein fluoreszierend. Dieser Prozess kann durch Beleuchtung mit Licht von 500 nm umgekehrt werden. Das Dronpa Protein verwendet worden ist, die Funktion und Position zu steuern Signalproteinen ^4,13.

Hier ausgedrückt wir eine Dronpa-Linker-Dronpa Protein in Ramos-B-Zellen Photoschaltbarkeit von Dronpa in einem Durchflusszytometer zu studieren. Mit unserem Gerät waren wir in der Lage, effizient undreproduzierbar Photoschalter Dronpa während in Echtzeit die Aufnahme seiner Fluoreszenzintensität. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber aktuellen Beleuchtungs Protokolle mit manueller Beleuchtung und erweitert signifikant das experimentelle Repertoire für optogenetische Werkzeuge und Käfigverbindungen. Mit unserem Gerät die Entdeckung und Entwicklung von neuartigen optogenetische Werkzeuge erheblich vereinfachen und beschleunigen.

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Protokoll

1. Planung und Aufbau der Vorrichtung

1. Pilotversuche
   HINWEIS: Die erforderliche Lichtintensität für eine bestimmte optogenetische Werkzeug und Zelltyp kann erheblich variieren. Pilotversuche mit Prototypen sind nützlich, notwendig, um die minimale Lichtintensität zu schätzen. Die optogenetische Werkzeug für die folgenden Experimente verwendet wird, ist ein Dronpa-Linker-Dronpa Fusionskonstrukt. Die Dronpa Sequenz wurde im Handel erhältlich (siehe Liste der Materialien). Ein langer Linker wurde zwischen zwei Dronpa Sequenzen kloniert in das exprimierte Konstrukt zu ermöglichen intramolekulare (und intermolekular) Dimere zu bilden. Die nachfolgend beschriebenen Schritte können zu vielen anderen optogenetische Werkzeuge oder optisch kontrollierten Substanzen angepasst werden.
   1. Transduzieren Ramos-B-Lymphozyten mit einem Dronpa-Linker-Dronpa enthaltenden Konstrukt nach den Anweisungen des Herstellers für die Transduktion von Verpackungszellen, die retroviral-enthaltende Überstand verwendet wird. Ernte und Zählen von Zellen nach einem vorherviously veröffentlichten Protokoll ^13.
   2. Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ / ml in Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) und sie auf einem Glas FACS-Röhrchen.
   3. Legen Sie das Rohr in einem Durchflusszytometer und messen die Fluoreszenzintensität von Dronpa (GFP - Kanal) ^14,15.
   4. Schutzbrille tragen für alle weiteren Schritte von möglicherweise schädlichen Wellenlängen Augen zu schützen.
   5. Stellen Sie manuell eine 500 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen.
   6. Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis Dronpa Fluoreszenzintensität abnimmt.
   7. Stellen Sie manuell eine 400 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen.
   8. Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis zum Dronpa FluoFluoreszenz Intensität zunimmt.
   9. Verwenden Sie mindestens so viele LED-Leuchten für den Aufbau der Vorrichtung als vorhergesagt erforderlich sein, von den Photoschalten in den Schritten 1.1.5 und 1.1.7.
2. Der Aufbau des Gerätes
   HINWEIS: Das Gerät wird von einem professionellen Bearbeitungswerkstatt, der Arbeitsgruppe Technik der Universität Freiburg gebaut wurde. Die meisten Teile sind kundenspezifisch und nicht im Handel erhältlich. Die genauen Abmessungen der einzelnen Teile sind in den 1 und 2 dargestellt. Um die Montage dieser Vorrichtung zu verdeutlichen, wird Ergänzungs Video 1 vorgesehen ist und die wesentlichsten Schritte werden nachfolgend beschrieben.
   1. Mühle Stück A aus Polyvinylchlorid (PVC) mit den genauen Maßen in 1A gezeigt.
   2. Legen Sie LED-Leuchten in die Bohrungen des Stückes A und versiegeln jedes Loch mit PVC-Kleber Wasseraustritt zu verhindern.
   3. Schließen Sie LEDs auf einen Mehrkanal-Transformator (jede Wellenlänge sollte eine separate chann besetzenel) mit einer einstellbaren Ausgangsleistung von 0 bis 29 mA.
   4. Bringen Sie die äußere Hülle (B) mit 3 Schrauben an einem Stück, wie dargestellt, um die LEDs vor Beschädigung zu schützen.
   5. Um das Gerät mit einer Wasserpumpe, Leim in den Rohrschellen (C) in die Bohrungen des Stückes A (dargestellt in 1a, Querschnitt Y: 9 mm und 61,5 mm) zu verbinden mit PVC - Kleber.
   6. Schneiden Sie ein 58,5 mm lange Plexiglasröhre (D1).
   7. Herstellung Stücke D2 und D3 aus Plexiglas , wie in Abbildung 2 dargestellt.
   8. Klebestück D3 auf den Boden des D1 mit Plexiglas Klebstoff.
   9. Bringen Sie einen Gummi-O-Ring zu Stück D2 und kleben Sie es an die Spitze der D1 mit Plexiglas Klebstoff.
      HINWEIS: Die Stücke D1, D2 und D3 zusammen Stück D. bilden
   10. Einsatzstück D in Stück A mit 3 Schrauben.
   11. Testen Sie das Gerät für Wasserleck vor der Leistung an den Transformator anzuwenden.

2. Messung der Kinetik eines optogenetische Werkzeug

1. Vorbereitung der Zellen
   1. Kultur Ramos-B-Zellen in RPMI-Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) bei einer Dichte von 3- 10 x 10 ⁶ Zellen / ml bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Ernte Ramos-B-Zellen durch Zentrifugation bei 350 xg und 4 ° C für 5 min.
   3. Zählen von Zellen unter Verwendung einer Neubauer - Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren 1-5 x 10 ⁶ Zellen in 600 & mgr; l Medium.
   4. Übertragen Sie die Zellen in ein Glas FACS-Röhrchen, legte sie auf Eis und schützen sie vor Licht, bis die Messung.
2. Bereiten Sie die Durchflusszytometer und das Gerät.
   1. Schließen Sie das Gerät auf eine beheizte Wasserpumpe und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
   2. Wenn Glas FACS-Röhrchen verwenden, tauschen Sie den schwarzen O-Ring des Durchflusszytometer mit einem Gummi-O-Ring und zusätzlich Silizium gr geltenLeichtigkeit.
3. Messung
   1. Setzen Sie vorsichtig das Glas FACS - Röhrchen in das Gerät und verbinden Sie es mit dem Durchflusszytometer (Abbildung 3).
   2. Starten Sie die Messung und Aufzeichnung Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal).
   3. Illuminate der Zellprobe mit 400 nm oder 500 nm Licht jeweils und notieren Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal).
4. Datenanalyse
   1. Analysieren experimentellen Daten mit geeigneten Durchflusszytometer Software. Plot Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung und Gate die lebenden Zellen. Zeichnen Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität über die Zeit.

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Ergebnisse

Mit der LED-Thermo Fluss mit einem Durchflusszytometer

Die funktionelle Kern der Vorrichtung ist eine zylindrische Kammer, in der LED-Leuchten in einer kreisförmigen Weise angeordnet sind nach innen gerichtet. Diese Kammer kann mit einer Wasserversorgung und der Pumpe verbunden sein, der zur Steuerung der Temperatur der LEDs sowie der Zellprobe ermöglicht. Die LEDs sind an einen Transformator angeschlossen ist und somit die Li...

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Diskussion

Die LED Thermo Flow ist ein innovatives Gerät optogenetische Werkzeuge in einem Durchflusszytometer zu studieren.

Bisher optogenetische Proben nur ^11,12 mit Mikroskopie Laser oder Taschenlampe Geräte beleuchtet worden. Je nach Winkel und Abstand der Lampe zur Probe, erhebliche Variabilität in der Menge des Beleuchtungs zwischen Experimenten erwartet. Darüber hinaus gibt es eine Grenze für die Anzahl von Taschenlampen eine einzelne Person in einem Experiment arbeiten kann. Die...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass FACS tube	Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA	14-961-26	Borosilicate glass tubes 12x75 mm
Flow Cytometer	BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany	Fortessa II	Special Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N	Addgene; Cambridge, USA	41645
PolyJet	SignaGen, Rockville, USA	SL100688
LED 505 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	HLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	UV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mm	Maertin; Freiburg, Germany	76999
Plexiglas 3 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692230
Plexiglas 2.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692225
Plexiglas 1.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692215
PVC tile 5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.005
PVC tile 6 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.006
PVC block 50 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.050
RPMI	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	61870-010
2-Mercaptoethanol	EMD; Germany	805740
FCS	PAN Biotech; Aidenbach, Germany	P30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	15140-122
Acrifix plexiglas glue	Evonic industries, Essen, Germany	1R0192
Tangit PVC-U glue	Henkel, Düsseldorf, Germany