JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Özet

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Giriş

Onlar yolları 1-4 sinyal kablolarını deşifre etmek için kullanılabilir, çünkü optogenetic araçlar kısmen, popülerlik kazanmaktadır. Işıkla aydınlatıldığında, kendi yapısını ve bağlanma afinitesini değiştirme fotoaktıfleştırılebılır proteinlerin yeteneğine dayanmaktadır. Sinyalizasyon elemanları bu proteinlerin kaynaştırarak karmaşık hücre içi sinyal yollarının 5-12 içinde tek bir oyuncunun belirli düzenlenmesi için izin verir. Sonuç olarak, bir sinyal yolu yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile ele alınabilir.

Çoğu hücre bazlı Optogenetic çalışmalarda biyokimyasal analiz 11,12 ardından ışık varlığında kültürlenmesi ile birlikte mikroskopi dayalı yöntemler kullanmaktadır. Bunun aksine, akış sitometresi kılcal boyunca hücrelerin singularizes ve hücre boyutu, boyutu ve floresan yoğunlukları ölçülür. Bu yöntem thousan analiz yeteneği dahil olmak üzere mikroskopi veya biyokimyasal yöntemlerle üzerinde önemli avantajlara sahiptirÇok kısa bir süre içinde tek hücreli çözünürlükte yaşayan hücrelerin DS. Bu nedenle, akış sitometrisi ile optogenetics birleştirilmesi arzu edilir.

Bildiğimiz kadarıyla, optogenetic flow sitometri için kurulan protokol yoktur. Bir yaygın olarak kabul prosedür el feneri cihazları ile reaksiyon tüpü dışından hücreleri aydınlatmaktır. Bununla birlikte, akış kılavuzu aydınlatma sitometresi canlı hücre görüntüleme, bir silindirik, ısıtılmış su odası, reaksiyon borusu içinden geçen ve ışık gerektirir. Bu önemli bir ışık saçılması ve ışık kaybına neden olur. Ayrıca, manuel aydınlatma tarafından sağlanan ışık yoğunluğu (vb açı, mesafe,) deneyler arasında tekrarlanabilir değildir ve bir deneyde dalga boylarının sayısı için pratik bir sınır yoktur.

LED Thermo Akış cihazı inşa ederek, bu sınırlamaları aşmak için başardık. Bu cihaz sayesinde, hücreler, bir sıcaklığı belirli dalga boyları ile aydınlatılabilirkısa süreli olarak kontrol edilen akış sitometrik ölçümleri sırasında bir şekilde. Bu mesafede olan ve deneyler arasında ışık hassas ve tekrarlanabilir miktarda sağlar.

In vivo olarak, bizim cihazın kullanılmasını göstermek için, photoswitching sırasında Ramos B hücrelerinde Dronpa floresan sinyali kaydedilmiştir. Ramos B hücreleri, bir insan Burkitt lenfoma türetilir. Dronpa bir monomer, dimer ya da tetramer olarak var olan bir fluoresan proteindir. monomerik formda, bu ışıltısızdır. 400 nm ışık ile aydınlatma dimerizasyonu ve tetramerizasyonu uyarır ve Dronpa protein floresan vermektedir. Bu süreç, 500 nm ışık ile aydınlatma ile ters olabilir. Dronpa protein proteinler 4,13 sinyal fonksiyonu ve yerini kontrol etmek için kullanılmaktadır.

Burada, bir akış sitometresinde Dronpa arasında photoswitching çalışma Ramos B hücrelerinde Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa proteini ifade etmiştir. Bizim cihaz kullanarak, başardık verimli vegerçek zamanlı olarak floresan yoğunluğu kayıt sırasında tekrarlanabilir Dronpa photoswitch. Bu yöntem, manuel aydınlatma ile mevcut aydınlatma protokolleri üzerinden önemli avantajlar sağlamaktadır ve önemli ölçüde optogenetic araçları ve kafes bileşikleri için deneysel repertuarı genişletir. önemli ölçüde basitleştirmek ve yeni Optogenetic araçlarının keşif ve gelişimini hızlandıracak bizim aygıtının kullanılması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Tasarımı ve Aygıtı Bina

  1. Pilot Deneyler
    NOT: Belirli bir optogenetic aracı ve hücre tipi için gerekli olan ışık yoğunluğu önemli ölçüde değişebilir. prototip Pilot deneyler gerekli minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek yararlıdır. Aşağıdaki deneyler için kullanılan Optogenetic aracı Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon konstruktu olup. Dronpa dizisi ticari (Malzeme Listesi) elde edildi. Uzun bir bağlayıcı ifade yapısı, molekül-içi (ve moleküller arası) dimerlerinin oluşturulması için izin vermek için iki Dronpa diziler arasında klonlandı. aşağıda tarif edilen kademeler bir çok Optogenetic araçları veya optik olarak kontrol edilen maddelere adapte edilebilir.
    1. ambalaj hücrelerden retroviral-ihtiva eden üst sıvıyı kullanarak transdüksiyonu için üreticinin talimatlarına göre bir Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa ihtiva eden bir yapı Ramos B lenfositleri transdüksiyonu. Bir ön göre Hasat ve sayım hücreleribir önce protokolü 13 yayınladı.
    2. Bir konsantrasyonda yeniden süspanse hücreler 1 x 10 6 orta / ml (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) ve bir cam tüp FACS aktarabilirsiniz.
    3. Bir akış sitometresinde içine tüp takın ve Dronpa (GFP kanal) 14,15 floresan yoğunluğu ölçmek.
    4. muhtemelen zararlı dalga boylarında gözleri korumak için diğer tüm adımlar için koruyucu gözlük kullanın.
    5. El ile borunun dış 500 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin.
    6. Dronpa floresan yoğunluğu azalır kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmak.
    7. El ile borunun dış 400 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin.
    8. Dronpa fluo kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmakyoğunluk artar rescence.
    9. adımlar 1.1.5 ve 1.1.7 de photoswitching gerekli olduğu tahmin olarak cihazı oluşturmak için en az sayıda LED ışıkları kullanın.
  2. cihazı bina
    NOT: Cihaz bir profesyonel işleme dükkanı, Freiburg Üniversitesi'nden Arbeitsgruppe Technik tarafından yaptırılmıştır. Çoğu parça özel yapılmış ve piyasada mevcut değildir. Her bir parçanın tam boyutları, Şekil 1 ve 2 'de gösterilmiştir. Bu cihazın düzeneğinin açıklamak için, Ek Video 1 sağlanır ve en önemli adımlar aşağıda tarif edilmiştir.
    1. Şekil 1A gösterilen kesin ölçümler ile polivinil klorür (PVC) Mill parça A.
    2. Parça A delinmiş deliklere LED ışıkları yerleştirin ve su sızıntısını önlemek için PVC yapıştırıcı ile her delik mühür.
    3. Bir çok kanallı trafosuna LED'leri bağlayın (her dalga boyu ayrı Chann işgal etmelidir0-29 mA ayarlanabilir çıkış gücüne sahip el).
    4. fiziksel hasardan LED korumak için gösterildiği gibi parça A 3 vida ile dış kılıfı (B) takın.
    5. Parça A delinmiş deliklere tüp klipleri (C) bir su pompası, tutkal cihazı bağlamak mümkün (Şekil 1a tasvir, kesit Y: 9 mm ve 61.5 mm) PVC yapıştırıcı kullanarak.
    6. Bir 58.5 mm uzunluğunda pleksiglas tüp (D1) kesin.
    7. Şekil 2'de tasvir edildiği gibi Pleksiglastan adet D2 ve D3 imalatı.
    8. Pleksiglas yapıştırıcı ile D1 altına Tutkal parçası D3.
    9. parça D2 bir lastik O-ring takın ve pleksiglas yapıştırıcı ile D1 üstüne tutkal.
      NOT: adet D1, D2 ve D3 birlikte parça D formu
    10. 3 vida ile parça A'ya parça D yerleştirin.
    11. transformatör güç uygulamadan önce su kaçağı cihazı test edin.

2. Bir optogenetic Aracı Kinetiği Ölçme

  1. hücreleri hazırlayın
    1. RPMI-aracı madde içinde kültür Ramos B hücreleri (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) 3- yoğunluğunda 10 x 10 6 hücre / ml 37 ° C de ve% 5 CO2.
    2. 350 xg 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile hasat Ramos B hücreleri.
    3. Üreticinin talimatlarına göre bir Neubauer sayım odası kullanılarak hücrelerin sayısı ve 600 uL ortamında 1-5 x 10 6 hücreleri tekrar süspansiyon.
    4. Bir cam FACS tüpüne hücreleri aktarmak ölçüme kadar ışıktan buz üzerine koydu ve onları korumak.
  2. Flowsitometri ve cihazı hazırlayın.
    1. ısıtılmış su pompasına aygıtı bağlayın ve 37 ° C sıcaklığını ayarlamak.
    2. Cam FACS tüpler kullanırken, sitometresinde bir lastik O-ring ile akış siyah O-ring değişimi ve buna ek olarak silikon gr uygulamakkolaylaştırmak.
  3. Ölçüm
    1. Dikkatle cihazın içine cam FACS tüp takın ve (Şekil 3) akış sitometresi bağlayın.
    2. ölçümünü başlatmak ve Dronpa floresan yoğunluğu (GFP kanalı) kaydedin.
    3. sırasıyla 400 nm veya 500 nm ışık ile hücre örneği aydınlatın ve Dronpa floresan (GFP kanalı) kaydedin.
  4. Veri analizi
    1. Yazılımın sitometresi uygun akış ile deneysel verileri analiz edin. yana dağılım ve kapısı canlı hücreler karşı komplo ileri dağılım. zamanla Dronpa floresan çizilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir Akış Sitometre LED Thermo Flow kullanarak

Cihazın bir işlevsel çekirdek ışıkları içe bakan dairesel bir biçimde düzenlenir LED silindirik bir bölme olabilir. Bu bölme ışıklarının sıcaklığı, hem de hücre örneği kontrol edilmesi için izin veren bir su ve pompa bağlanabilir. LED'ler bir transformatör bağlı ve dolayısıyla her dalga boyu için ışık yoğunluğu ayrı ayrı kontrol edilebilir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

LED Thermo Akış bir akış sitometresinin içinde optogenetic araçları incelemek için yenilikçi bir cihazdır.

Şimdiye kadar, optogenetic numuneler sadece mikroskopi lazerler veya el feneri cihazlarla 11,12 ile aydınlatılan edilmiştir. örnek el feneri açısı ve mesafeye bağlı olarak, aydınlatma miktarında önemli değişkenlik deneyler arasında bekleniyor. Ayrıca, tek bir kişi bir deney çalışabilir fenerleri sayısında bir sınır yoktur. Bu deneysel repert...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass FACS tubeThermo Fisher Scientific; Waltham, USA14-961-26Borosilicate glass tubes 12x75 mm
Flow CytometerBD Bioscienceg; Heidelberg, GermanyFortessa IISpecial Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, USA41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyUV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mmMaertin; Freiburg, Germany76999
Plexiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Germany692230
Plexiglas 2.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692225
Plexiglas 1.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692215
PVC tile 5 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.005
PVC tile 6 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.006
PVC block 50 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany61870-010
2-MercaptoethanolEMD; Germany805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, GermanyP30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany15140-122
Acrifix plexiglas glueEvonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U glueHenkel, Düsseldorf, Germany

Referanslar

  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 118optogeneticsflow sitometrikalsiyumkafes bile ikfotoaktivasyonsinyalizasyonh cre s ralama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır