عالية الكثافة الكهربي شراء في القوارض نموذج باستخدام منخفضة التكلفة والمصدر المفتوح الموارد

Summary

Instructions for the low-cost construction and surgical implantation of a chronic transcranial high-density electroencephalographic montage into mice are provided. Signal recording, extraction, and processing techniques are also described.

Abstract

المتقدمة تقنيات التحليل الكهربي التي تتطلب حلا مكانية عالية، بما في ذلك التصوير مصدر كهربائي والتدابير من الاتصال بالشبكة، وقابلة للتطبيق على التوسع متنوعة من الأسئلة في علم الأعصاب. أداء هذه الأنواع من التحليلات في نموذج القوارض يتطلب أعلى كثافة القطب من أقطاب المسمار التقليدية يمكن أن تنجزه. بينما ذات الكثافة السكانية العالية المونتاج الكهربي للقوارض موجودة، فهي من محدودية لمعظم الباحثين، ليست قوية بما فيه الكفاية للتجارب متكررة على مدى فترة طويلة من الزمن، أو تقتصر على استخدامها في القوارض تخدير. ^1-3 منخفضة التكلفة المقترحة والتحقيق في طريقة لبناء دائمة، وارتفاع العد، عبر الجمجمة مجموعة القطب، وتتألف من أغطية الرأس التي تزرع في الجسم بشكل ثنائي وسيلة لأداء متقدمة الكهربائي يحلل في الفئران أو الجرذان.

إجراءات لتصنيع خوذة والجراحية زرع نecessary لإنتاج إشارة إلى ارتفاع الضوضاء، وتعرض الكهربي منخفضة مقاومة وإشارات electromyographic. في حين أن منهجية مفيدة في كل من الجرذان والفئران، وتركز هذه المخطوطة على تنفيذ أكثر تحديا لالجمجمة الماوس أصغر. بحرية والمربوطة الفئران تتحرك فقط لكابلات عبر محول المشترك أثناء التسجيل. يوصف نسخة واحدة من هذا النظام الكهربائي التي تضم 26 قناة الكهربي و 4 قنوات electromyographic أدناه.

Introduction

نشاط الخلايا العصبية يمكن تسجيلها خارج الخلية مع مستويات مختلفة من التفاصيل من المجهرية (إمكانات العمل الفردية) لmesoscopic (امكانات الحقل المحلية) لالعيانية (الكهربائي). ويتم تحليل هذه الآثار الفكرة الرائعة كلاسيكيا في مجال التردد إلى تميز السلوكي، العصبية، أو الدول الكهربية. ويمكن أن يتم هذا مع biopotential واحد، ⁴ لكن متفرق التسجيلات الكثافة EEG لا يمكن حل المكون المكاني للنشاط الخلايا العصبية. يعتمد التحليل الكهربائي الحديث على أقطاب متعددة لإنتاج خرائط تفصيلية لتوزيع الزمانية المكانية النشاط القشرية من أجل ربط هذا النشاط مع حالات نفسية معينة والعمليات الفسيولوجية. ^5-7 اثنان من فئات أكثر شيوعا من تحليل تتطلب عالية الكثافة المونتاج EEG هي التصوير مصدر كهربائي والتدابير الاتصال بالشبكة العصبية. ^8-11

> التصوير مصدر الكهربائية ينطوي على توطين مناطق الدماغ النشطة وظيفيا. رسم الخرائط الطوبوغرافية من مجموعة الكهربائي يمكن تصور كثافة مصدر في الوقت الراهن من النشاط الكهربائي في الدماغ خلال إمكانات الصلة بالحدث (نظم تخطيط موارد المؤسسات)، وإمكانات أثار (EPS). يستخدم توطين مصدر كهربائي عادة في كلتا الدراستين مصادرة وكذلك في توزيع الطاقة يحلل ^12-15 منذ EEG لديها قرار زمنية عالية، ودراسات EEG تسمح تقييم في الوقت الحقيقي من نظم تخطيط موارد المؤسسات وربحية السهم وكذلك الدقيق زمنيا التحليل اللاحق. ^{3،11 ، 12}

ربط الدول والوظائف المعرفية مع التفاعل من التذبذبات ينظر إليه على الكهربائي هو الهدف النهائي للتدابير مختلفة من الاتصال بالشبكة العصبية. وقد أظهرت العديد من الدراسات وتزامن مرحلة قفل من التذبذبات بين مناطق الدماغ المختلفة ترتبط مع دول معينة من الإثارة، والاهتمام، والعمل. ^{6،13،14،16-19} إظهار هذه الجمعيات إشارة بين مناطق الدماغ يتطلب صفائف عالية الكثافة التي تتيح إجراء تقييمات الاتصال بالشبكة.

التعريب المصدر وشبكة يحلل إشارات EEG نشأت مع الدراسات على البشر، ولكن التحقيقات في أساس العصبية لهذه الإشارات تنطوي بالضرورة النماذج الحيوانية، كما أنها تتطلب تقنيات الغازية التي من المستحيل على خلاف ذلك في البشر. من أجل تكرار هذه التحليلات في نماذج القوارض، هناك حاجة إلى وسيلة لالتقاط إشارات EEG ذات الكثافة السكانية العالية في الدماغ والقوارض. في حين غيرها من الجماعات التي شيدت صفائف مسرى مكروي عالية الكثافة للاستخدام في الفئران، وهذه المناهج هي من محدودية للباحثين دون الوصول إلى مرافق nanofabrication، ليست قوية بما فيه الكفاية للتجارب متكررة على مدى فترة طويلة من الزمن، أو تقتصر على استخدامها في تخدير الفئران. ^1-3،7 بروتوكول بديل منخفض التكلفة لبناء المزمنة ذات الكثافة السكانية العالية، عبر الجمجمة القطب الأذربيجانيةويتجلى ذ هنا.

النهج اكتساب إشارة وصفها هنا لا يقتصر على EEG، بل يشمل electromyographic إشارات (EMG). الحصول على إشارات EMG يمكن أن يكون اتباع نهج متكامل لتحديد الدولة السلوك ومفيد بشكل خاص للدراسات النوم. ويوفر هذا النهج وسيطة بين باهظة الثمن، فائقة الكثافة شبكات داخل الجمجمة، وأرقام الرصاص محدودة محتملة مع أقطاب المسمار التقليدية التي لا تكفي لنهج تحليل متقدمة. هي التي شيدت تصميم خوذة بسهولة وبأسعار معقولة للدراسات الإنتاجية العالية. استخدام هذا النظام اكتساب بالتزامن مع تقنيات التلاعب وراثية أو دوائية متنوعة ضمن نماذج القوارض يمكن أن تساعد في الكشف عن آليات توليد القشرية التذبذب، الاختلافات السلوكية من الاختلافات الوراثية الحقيقية، توطين مصدر من نظم تخطيط موارد المؤسسات والعائد على السهم، وشبكة الاتصالات على نطاق واسع.

Protocol

وكانت الدراسات التي أجريت خلال هذا التحقيق بالاتفاق مع المعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية بنسلفانيا.

1. تصميم غطاء الرأس والبناء

1. إزالة كل صف الثامن من الدبابيس من دبوس الطوب 2 × 50 موصل مقبس 100 موقف مع زوج من ملاقط عن طريق دفع جزء عاء من دبوس من خلال الطوب البلاستيك.
   ملاحظة: سوف دبابيس لأسفل يكون الاتجاه الذي سوف يكون مرجعا لبقية البروتوكول. (خذ علما بذلك على وجه التحديد في 2.6).
2. تغطية دبابيس مع طبقة خفيفة جدا من طلاء الأظافر لعزل والسماح للطلاء الأظافر يجف تماما.
3. إزالة طلاء الأظافر من نصائح من المسامير مع الأسيتون وقطعة قماش صغيرة.
4. تقليم البلاستيك الزائد من 2 × 7 باستخدام شفرة حلاقة أو قطع الأسلاك صالكاذبين. وسيؤدي هذا في 2 × 7 الطوب التي معزول على طول دبابيس ويتعرض في الطرف دبوس. وسوف تصبح هذه النهاية الأقطاب EEG عبر الجمجمة. هما 2 × 7 الطوب اللازمة لاستكمال القطب مجموعة المزمنة (الشكل 1A).
5. قطع اثنين 1 × 2 الطوب دبوس لتسجيل إشارة EMG. استخدام نفس عملية إزالة المسامير غير المرغوب فيها مع ملاقط وقطع البلاستيك الزائد بعيدا لإنشاء 1 × 2 الطوب. تأكد من أن هذه ل1 × 2 ديك الجانب السلس لهم من الأصلي 100 الوظيفة وعاء كما هذه المسافة سوف تصبح المسافة دبوس القياسية لكل نقش حتى محول واحد سيعمل لجميع أغطية الرأس (الشكل 1A).
6. استخدام 2-جزء الايبوكسي لإرفاق 1 × 2 دبوس قطعة ل2 × 7 دبوس قطعة (1D الشكل).
   1. كما كلتا المجموعتين من الدبابيس يجب أن يكون في نفس الاتجاه، الايبوكسي 1 × 2 على الجانب الوحشي من كل شطر من خوذة مع الجانبين السلس لل1 × 2 و 2 ×7 بالاتصال بعضها البعض. محاذاة 1 × 2 الثقوب ودبابيس مع الخلفي الأكثر 2 صفوف من العلامات على 2 × 7.
      ملاحظة: لا يتم epoxied ونصفي خوذة معا. وهذا يسمح للمرونة في شطري محول خوذة لتسهيل الاتصال أثناء التعود وخلال أيام التجريبية (الشكل 1E).
   2. دعونا نصفي خوذة شفاء بين عشية وضحاها. عند الانتهاء، وخوذة هي متماثل على المستوى الثنائي. ويتكون كل نصف دبوس الطوب 2 × 7 مع تعلق أفقيا 2 × 1 لبنة دبوس أن يتماشى مع الخلفية أكثر 2 صفوف من دبوس الطوب 2 × 7.
7. إعداد الأسلاك لتسجيل إشارة EMG. احد الذين تقطعت بهم السبل، ويستخدم 31 G سلك الفضة العزل perfluoroalkoxy لEMG إشارة تسجيل (1D الشكل). ومع ذلك، متعدد الذين تقطعت بهم السبل أو يمكن أن تكون بديلا الأسلاك المعدنية الأخرى إذا رغبت في ذلك.
   1. لخلق أسلاك EMG الصدرية تأخذ قطعة 3.0 سم من سلك الفضة perfluoroalkoxy العزل والعينيةاوفه 1 سم من العزل البلاستيك واحدة من نهاية بشفرة حلاقة. التفاف الأسلاك غير المعزولة حول زوج من ملاقط مرتين. إزالة الأسلاك من ملاقط وإزالة 25 ملم من العزل على نهاية غير يحلق مع شفرة حلاقة.
   2. لبناء أسلاك EMG عنق الرحم، وتكرار هذه العملية مع قطعة 1.5 سم من السلك. وهناك حاجة إلى اثنين من الأسلاك EMG عنق الرحم واثنين من الأسلاك EMG الصدري لخوذة كاملة.
8. إزالة دبوس الجانبي في أبعد الصف الأمامي من كل من أغطية الرأس، والتي تتطابق مع إحداثيات التجسيمي 3.3 ملم الأمامي من Bregma و 2.3 ملم الوحشي من Bregma، حيث لا يوجد في الدماغ تحت هذا الموقع على النحو الذي يحدده أطلس مخ الفأر ²⁰ (الشكل 2A).
9. على كل شطر خوذة، وقطع دبابيس من الطوب 1 × 2 إلى قاعدة من البلاستيك للخوذة مع زوج من قواطع للاسلاك (3.0 ملم من غيض من دبوس) وحام السلك EMG عنق الرحم إلى دبوس الأمامي والصدر فريق الإدارة البيئية في الخلفية صفي.
   1. تأكد من أن كل دبوس معزولة كهربائيا. إجراء اختبار الاستمرارية مع الرقمي المتعدد من خلال ربط الخيوط اثنين من الفولتميتر دبابيس مختلفة أثناء وجوده في وضع الاستمرارية. كهربائيا ودبابيس معزولة لا تنتج صوت مسموع مع هذا الاختبار متعدد. ومع ذلك، سوف دبابيس جانب كهربائيا. تغطية المفاصل ملحوم مع طلاء الأظافر، ومرة ​​واحدة جافة، ثني الأسلاك EMG مثل أنهم بالتوازي مع محور الأمامي / الخلفي مع النزوح الأفقي الحد الأدنى.
10. دبابيس تقليم إلى الطول النسبي بحيث أنها تتطابق مع ملف سطح الدماغ.
    1. مع مساعدي ماوس أطلس الدماغ، وبعد المسافة بطني قياسية لسطح الدماغ من Bregma لكل دبوس تنسيق ²⁰ دبوس الذي المسافة بطني من Bregma هو الأكبر سيكون بمثابة مؤشر لتقليم دبوس. لن يتم قطع هذا الرقم في حين سيتم قطع جميع الدبابيس الأخرى فيما يتعلق بهذا دبوس المسافة بطني القصوى (الجدول 1).
       ملاحظة: دبابيس يمكن مطحون وصولا الى حجم ولكن يجب أن يتم ذلك بعناية كما الاحتكاك بين دبوس وعجلة طحن يمكن أن يسبب دبابيس من نقش على الانحناء. إذا دبوس عازمة، استخدام ملاقط لتصويب ذلك. بديلا لطحن المسامير أسفل إلى طول هو تقليم لهم مع زوج من كماشة قطع الأسلاك.
11. تغطية كل من النصائح دبوس مع حل الفضة باستخدام الفضة حل القلم واسمحوا الجافة. هذه الخطوة تقلل ممانعات الكهربائي إلى ≤30 أوم، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويقضي على حواف خشنة تسببت من دبوس وتقليم، وبالتالي تقليل فرص تلف الأنسجة وتسريع الشفاء من عملية جراحية في وقت واحد. وأكملت الأوزان نصف خوذة حوالي 0.5 غرام.

2. محول البناء ورسم الخرائط القناة

1. قطع الأسلاك موصل لموصل 36 الوظيفة المزدوجة الصف ذكر نانو المصغرة على طول موحد من 2 أو 3 سم باستخدام شفرة حلاقة. لكل سلك، الحادي والعشرينراوغ 2.5 ملم من العزل من النهاية والقصدير المعدن يتعرض لكل سلك. تأكد عند التعليب لديها، حبلا رقيقة واحد من الأسلاك المعلبة لكل سلك محول نانو لأن هذا أمر بالغ الأهمية لعزل الدبابيس. قص قبالة العزل جردت مع كماشة قطع الأسلاك (الشكل 1C).
2. إنشاء مطابقة الذكور / موصل ذكر إلى خوذة باستخدام كون قطاع رأس 2 × 50. قطع اثنين 2 × 7 واثنين 2 × 1 من 2 × 50 لبنة. إزالة المسامير غير المرغوب فيها من الطوب 2 × 50 عن طريق كسر مرة واحدة من دبابيس الذكور، ومن ثم دفع النصف الثاني متواصلة من نفس قطعة من موصل مع زوج من ملاقط (الشكل 1B).
   ملاحظة: سوف جانب واحد من هذه المسامير بمثابة دبابيس محول إلى الاندماج في كل خوذة، في حين سيتم ملحوم النصف الآخر إلى الأسلاك موصل نانو المعلبة. تأكد من وجود حواف بلاستيكية مسطحة في الفؤاد 2 × 1 و 2 × 7 لضمان التزاوج السليم للذكور / موصل الذكور مع خوذة بإنشائه في الخطوة1.
3. لحام على واحد من الأسلاك الأرضية / إشارة من الموصل نانو لدبوس الأرض / إشارة المرجوة. ترتبط الأرض وإشارة الأسلاك معا على رقاقة مكبر للصوت RHD2132. استخدام دبوس واحد هو 0.60 ملم الأمامي إلى Bregma و 1.00 ملم الوحشي من Bregma على حد سواء إشارة والأرض. (خوذة اليسار، دبوس وسطي من الثالث الصف الأمامي أكثر، ومع ذلك، يمكن أن تسند أي طرف آخر إذا كان يفضل، الشكل 2.) لاحظ أنه من الممكن الفصل بين الأرض وإشارة على رقاقة مكبر للصوت عن طريق إزالة المقاوم 0Ω الذي يربط الأرض والمرجعية معا إذا عزل اثنين هو المطلوب.
4. لحام المعلبة الأسلاك نانو موصل إلى نفس الجانب من الذكور / موصلات للذكور كاتصال دبوس الأرض / المرجعية. خرائط كل سلك لقناة معينة، بحيث يمكن الانتهاء الإعداد القناة في هذا الوقت. تم العثور على الرسوم البيانية خريطة قناة لheadstages مكبر للصوت على موقع المفتوحة Ephys ويكي (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). لحام السلك المقابلة التي من المعروف عنها دبوس منها قناة لتحقيق الخرائط المطلوبة.
5. قطع الأسلاك غير المستخدمة في قاعدة للموصل نانو مع كماشة قطع الأسلاك.
6. استخدام الفولتميتر لضمان أن كل دبوس معزولة كهربائيا من جميع دبابيس أخرى. بمجرد تأكيد العزلة، وتطبيق طبقة رقيقة من طلاء الأظافر حول كل مشترك لحام لمواصلة عزل كل طرف.
7. باستخدام 2-جزء الايبوكسي، وتعزيز محول نانو مطابقة للالثنائية 2 × 7 و 2 × 1 العلامات على الطوب بين الذكور.
   ملاحظة: سيكون هناك نصفين لهذا محول واحد التي تطابق ترتيب دبوس من نصفين خوذة بإنشائها سابقا. فمن الأهمية بمكان للتأكد من أن الجزء الأنسي من كل شوط من محول لايوجد الايبوكسي الزائد تفيض على حافة البلاستيكية من الذكور / موصل الذكور، حيث سيؤدي ذلك إلى منع كل شطر من خوذة أن تسد في وقت واحد. لا تسمح لأي الايبوكسي لتتدفق إلى الجانب السفلي من بور محول دبوسسوف نشوئها من محول، وهذا أيضا منع الاتصالات المناسبة. استخدام نصفين خوذة 2 كقالب لمحاذاة دبوس موصل المناسبة.
8. الايبوكسي كل شطر من محول والايبوكسي قاعدة موصل نانو لزيادة متانته. تأكد من تغطية جميع المفاصل لحام مع مادة لاصقة. السماح ليلة وضحاها محول علاج.
9. تأكيدا لرسم الخرائط قناة السليم لا يمكن أن يؤديها باستخدام قياسات مقاومة في واجهة المستخدم الرسومية المفتوح Ephys (GUI). محول الانتهاء يزن حوالي 1.3 غرام (الشكل 1F).

3. جراحة

1. إعداد الجراحي الميداني العقيمة.
   1. ارتداء قفازات معقمة ومعدات الوقاية الشخصية الأخرى على النحو المطلوب. تعقيم الأدوات في الأوتوكلاف. تعقيم إطار المجسم مع حل ثاني أكسيد الكلور 1.0 ملم. رذاذ الحل على الإطار وانتظر 5 دقائق قبل الشطف بالماء المعقم.
   2. لتعقيم headp تزرع في الجسمأجزاء IECE، رذاذ المكونات مع حل ثاني أكسيد الكلور 1.0 ملم، والانتظار 5 دقائق قبل الشطف بالماء المعقم. وضع الأجهزة زرع الآن عقيمة في طبق بتري معقمة.
2. الحصول على الوزن قبل الجراحة للماوس، ثم تخدير الماوس في غرفة تحريض 200 مل باستخدام 1،5-2،0٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪. استخدام معدل التدفق في غرفة ما يقرب من 500 مل / دقيقة.
3. تأكيد فقدان المنعكس التقويمي من خلال تناوب غرفة الاستقراء. إزالة الماوس من غرفة تحريض ومكان في مخروط الأنف على إطار المجسم بدون تأمين تماما رأس الفأر مع قضبان الأذن. تواصل رصد للعمق المناسب للتخدير عن طريق تقييم قرصة أخمص قدميه بينما أيضا تقييم العلامات الحيوية.
4. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية مع وحدة تحكم في درجة الحرارة حلقة مغلقة، مثل التحقيق ونظام التدفئة وسادة المستقيم. تغطية عيون الماوس مع مرهم العين العيون قبل أن يقلص من الفراءفي الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام مقص منحنية أو كليبرز. تطهير الرأس مع betadine والسماح للbetadine حتى يجف تماما قبل المتابعة.
5. إدارة المسكنات والمضادات الحيوية جنبا إلى جنب مع السوائل داخل الصفاق. ل25 غ الماوس، 0.5 ملغ سيفازولين، 0.125 ملغ ميلوكسيكام، 0.5 مل المالحة، و 2.5 ميكروغرام البوبرينورفين ف 4-6 ساعة برن.
6. ضخ 250 ميكرولتر 0.25٪ بوبيفكين تحت الجلد على طول خط الوسط على رأسه، وحقن 100 ميكرولتر 0.25٪ بوبيفكين تحت الجلد على كل من الأقواس الوجني من الفأرة.
7. تأمين الماوس في الإطار التجسيمي وفضح الجمجمة.
   1. تأمين رأس الفأر مع الحانات الأذن التجسيمي إلى الإطار التجسيمي. تأكد من أن الفأر هو في الطائرة من التخدير الجراحي من خلال التأكيد على عدم وجود منعكس قرصة أخمص قدميه. إنشاء شق 1،5-2،0 سم على طول مع مشرط المتاح رقم 11 على طول خط الوسط من الجمجمة. سيبدأ شق من بين العينين ويستمر الخلف إلى قفا.
   2. فضح الجمجمة عن طريق نشر الجلد أفقيا مع المشابك الصغيرة. تقليل تركيز الأيزوفلورين من 2.0٪ إلى تركيز يحافظ على الطائرة من التخدير الجراحي، ولكن لا تقلل إلى أقل من 1.0٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪. تسكين قبل العملية يقلل من كمية من مخدر استنشاقه اللازمة للحفاظ على عمق الجراحية التخدير، ويمكن أن يؤدي إلى سرعة الشفاء وتحسين النتائج البقاء على قيد الحياة.
8. مستوى الجمجمة وحفر ثقوب لدغ.
   1. تحديد Bregma والصفر الإحداثيات المجسم في Bregma، الذي يصبح أصل نظام الإحداثيات. لمعادلة الجمجمة في محور وسطي / الوحشي، نقل التحقيق التسوية تعلق على الذراع تتلاعب التجسيمي 1.50 ملم أفقيا في كل الاتجاهات من Bregma وتأكيد أن ظهري / عمق البطني هو أقل من 0.05 ملم عندما الاتصالات التحقيق اليسار واليمين من جانبي الجمجمة.
      ملاحظة: القرار 10 ميكرون من ظهري / بطني ع مناورم استخدامها جنبا إلى جنب مع الرقمية تنسيق عرض يبسط التسوية. تسوية محور الأمامي / الخلفي حول Bregma يتبع نفس الأسلوب. وينبغي أيضا أن يكون الفرق في المسافة البطنية للاتصال Bregma وLAMDA أقل من 0.05 ملم.
      1. ضبط الجمجمة حتى تسوية كاملة في كلا الاتجاهين بحيث الطائرة عرضية موازية على الأرض. وهذا يسمح للإحداثيات المجسم الحقيقية كما رأينا في الأطلس مخ الفأر. ²⁰
   2. مع 0.5 مم مثقاب الصغير داخل الحفر التجسيمي، الحفر لدغ من 3.30 ملم الأمامي إلى 4.50 مم الخلفي لBregma في 1.30 زيادات ملم عند 1.00 ملم أفقيا إلى خط الوسط في كل شطر من الجمجمة. الأعمدة الجانبية من الأقطاب الكهربائية 2.30 ملم، حفر ثقوب لدغ من 2.00 ملم الأمامي إلى Bregma إلى 4.50 مم الخلفي لBregma في 1.30 زيادات ملم على جانبي خط الوسط (الشكل 2). عالية الدقة والإحكام ما هو مطلوب لهذا الدكتورتم تبسيط عملية ايلينج بقرار 10 ميكرون من الذراع تتلاعب التجسيمي الرقمية.
      ملاحظة: من أجل دبابيس من خوذة ليكون مزروع بشكل صحيح، يجب أن تكون الجمجمة من الفأرة في مكان آمن داخل الإطار التجسيمي. اذا تحركت الجمجمة أثناء الحفر، اختلالها من خوذة ولدغ الثقوب قد تترتب على ذلك.
9. زرع أغطية الرأس.
   1. مع ملقط على التوالي، وإعداد EMG الأنفاق الأسلاك للأسلاك EMG الصدرية. تحفر 2.5 سم بين الجلد والعضلات في الجزء الخلفي لكل من اليسار وأسلاك EMG الصحيحة. إدراج الصدرية وEMGS عنق الرحم في تجويف التي تم إنشاؤها باستخدام ملقط على التوالي لأول مرة، ومن ثم مناورة لبنة EEG مع ملقط منحنية بحيث دبابيس مع الفتحات لدغ حفر سابقا.
   2. تطبيق ضغط طفيف على خوذة وتذبذب المسامير في الجمجمة. قطر دبوس هو 0.46 ملم. مع العازلة طلاء الأظافر، ودبابيس تناسب بإحكام في لدغ حفر حوليه. سوف خوذة تكون مستقرة مرة واحدة يتم إدراجها بشكل مناسب. ضبط أسلاك EMG إلى المواقف النهائية. كرر نفس العملية للنقش على الجانب الآخر.
10. تأمين غطاء الرأس في مكانها باستخدام الاسمنت الأسنان.
    1. عندما تم تعيين كل من أغطية الرأس في مكان، خلط نسبة 1: 1 من ميتاكريليت الميثيل مع مجمع يشابك لها. ضعي الخليط بحيث تغطي الجمجمة المكشوفة، وأجزاء مصقول مسمار من الأقطاب دبوس، والجزء القريب من الأسلاك EMG، ولكن لا يغطي أوعية الإناث من خوذة.
    2. تأكد من عدم الحصول على الأسمنت على الفراء. لا تسمح لالتلال من الاسمنت لتشكيل أن الماوس سوف تكون قادرة على الاستيلاء على. ضمان ما يكفي من الوقت للأسمنت لتجف، ثم قم بإزالة الماوس من إطار المجسم. الوزن الكلي أن الماوس سوف تضطر إلى تحمل هو من نصفين 2 من خوذة والاسمنت تأمين ما يقرب من 1.2 غرام.
11. وضع الحيوان في بيئة نظيفةمنطقة الانتعاش.
    1. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية مع وسادة التدفئة. رصد الماوس حتى يستعيد كل ردود الفعل الوضعي، مما يدل على ظهور من التخدير. ينصح المساكن الفردية للانتعاش على المدى الطويل.
    2. ينصح الرصد اليومي لمدة لا تقل عن 3 أيام بعد الجراحة مع تسكين التداخلية. اسمحوا 10-14 أيام من التعافي بعد العملية قبل بدء فترة التعود المربوطة.

4. الحيوانات روض إلى الربط

1. قم بتوصيل محول إلى الماوس باستخدام مساند الرأس الماوس (الشكل 1G-H). التمسك عكس زوايا من أغطية الرأس التي رسخت في مكانه مع المرقأة المنحنية بمجرد ضبط النفس الماوس وإدراج ببطء دبابيس المحول في خوذة المزروعة على الجانبين.
2. توصيل مكبر للصوت 32 قناة للمحول (الشكل 1H). تأكد من محاذاة الشعارات على كل من محول ومكبر للصوت في التعاونالتوجه nsistent لكل محول ومكبر للصوت لمنع الأخطاء قناة رسم الخرائط. توصيل مكبر للصوت لبرقية RHD2000 معيار واجهة الطرفية التسلسلية (SPI). وهذا الكابل الاتصال بالنظام الاستحواذ لتسجيل إشارة.
3. ضع الماوس داخل الغرفة التي تحتوي على ذراع ناتئ المثبتة على جدار الغرفة. إرفاق كابل واجهة SPI إلى الذراع ناتئ وضبط التوتر في الذراع ناتئ للتصدي للوزن كابل المربوطة. الفأر هو قادرة على التحرك بحرية واعتادوا لمدة ساعة يوميا في الأسبوع قبل التسجيل.
4. لقطع الماوس، ببساطة افصل كابل ومحول من الماوس أثناء استخدام ملعقة صغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ شقة لمساعد في فصل محول من الماوس.

الإعداد 5. إشارة النظام استخراج / تسجيل الإشارة

1. قم بتوصيل محول شيدت في خوذة من الماوس المزروع. توصيل مكبر للصوت headstage إلى محول وإرفاق القياسية كابل واجهة SPI إلى مكبر للصوت ولوحة الحصول على. هل لديك كابل SPI نعلق على ناتئ المتأزم بشكل صحيح بحيث يتم التقليل من وزن إضافي على رأس الفأر.
2. ضع قفص فاراداي المحلي، التي تم إنشاؤها باستخدام إجراء شبكة أو رقائق الألومنيوم، وحول headstage والأرض قفص فاراداي المحلي.
3. الحصول على ممانعات الكهربائي قبل بداية كل تسجيل عن طريق اختيار 30 كانساس / معدل أخذ العينات ثانية وقياس ممانعات عبر وحدة في واجهة المستخدم الرسومية. مطلوب قيمة مقاومة أقل من أو تساوي 10 أوم لدبوس الفردية لتأكيد الاتصال الكهربائي المناسب. قيم مقاومة أعلى نتيجة في بيانات رفض من أن القطب.
4. للتسجيل، قم بإنشاء سلسلة إشارة من إيقاع FPGA، ممر الموجة تصفية، وLFP المشاهد في واجهة المستخدم الرسومية. فمن المستحسن لتحديد معدل أخذ العينات من 1.00 كانساس / ثانية، عرض النطاق الترددي من 0.1-7،500 هرتز وإلغاء DSP. تعيين مرشح ممر الموجة إلى ،1-250 هرتز وعرض القنوات التي كتبها المرجعملمسه المشاهد LFP. 250 و 400 سعة قناة μV مع طريقة القرعة اختيار أفضل يتصور البيانات.
5. بدء تسجيل باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. إنشاء مجلد جديد لكل تسجيل وتعيين مسار حفظ الملفات إلى هذا المجلد. لبدء تسجيل ببساطة ضرب قياسي. وتسجل كل القنوات من الموصل 32 افتراضيا، ولكن القنوات غير المرغوب فيها يمكن غير محددة من خلال النقر على الجانب الأيمن من وحدة الإيقاع FPGA قبل بداية التسجيل.
6. استيراد البيانات إلى مطلب للتحليل. هناك العديد من أدوات العمل المفتوحة المصدر التي يمكن استخدامها للمساعدة في التحليل.

النتائج

وأظهرت بيانات العينة المسجلة في الماوس تتحرك بحرية مزروع مع ارتفاع الكثافة EEG نقش في الشكل (3). الطول الموجي EEG الفردية تتوافق مع مخطط قناة رسم الخرائط هو مبين في الشكل 2. يتم عرض أمثلة من EMG عنق الرحم والصدر أيضا في الشكل (3). لاحظ أن تسجيل EMG الصدري ويحتوي أيضا النشاط الكهربائي جزءا لا يتجزأ من مصدرها في قلب الفأر أن يتبين بسهولة عندما يتم احتساب إشارة الفارق بين السلكين EMG الصدر (T). مع هذا التسجيل هو أيضا من الممكن لحساب معدل ضربات القلب الماوس، عن طريق قياس الوقت بين المسامير QRS electrocardiographic ^23-24 وبالمثل، فمن الممكن لقياس معدل التنفس الماوس، عن طريق حساب التباين طوري من ارتفاع QRS مع توسع التجويف الصدري و العقود مع كل نفس. ²⁵ وبالتالي، يسمح هذا الإعداد لاقتناء سدراسة النوم الفئران و. وعلاوة على ذلك، الإعداد يمكن رسم الخرائط القشرية من إمكانات أثار البصرية (الشكل 4). عندما يتم تسليم 10 نبض مللي ثانية من الضوء فقط على العين اليسرى الماوس، يتم تسجيل الاستجابات الكلاسيكية في الجانب المقابل (ولكن ليس المماثل) القشرة البصرية الأولية التي تليها الاستجابة المتأخرة في القشرة البصرية الثانوية المقابل. الفيلم جزءا لا يتجزأ في الشكل (4) ويظهر في الوقت متفاوتة إمكانات الكهربائية عبر السطح القشري كامل مع الرسوم البيانية من النشاط في V1 المقابل وV2.

AP
3.3			0	0
2		0.4	0.6	0.6	0.4
0.7		0.6	0.9	0.9	0.6
-0.6		0.9	1	1	0.9
-1.9		1	1.1	1.1	1
-3.2	3	1	1	1	1	3
-4.5	3	0.7	0.7	0.7	0.7	3
ML		-2.3	-1	1	2.3

الجدول 1: دبوس التشذيب أطوال هذا الرقم يدل على أطوال وتقليم المطلوبة، في ملم، في دبوس للنقش. تم الحصول على أطوال لتقليم دبوس من أطلس مخ الفأر. بالعربيةثالثا دبابيس وتقليم، وخوذة يطابق ملف سطح الدماغ. ²⁰ دبابيس EMG ومعزولة تماما كما هي ملحوم الأسلاك المستخدمة لتسجيل إشارة EMG على كعب دبوس.

الشكل 1: غطاء الرأس مكونات والمتوسط خطوات البناء، والاتصال السليم لتسجيل هذا الرقم يدل على المواد الخام المستخدمة في إنشاء أغطية الرأس. بدءا من 100 دبوس وعاء اتصال، يتم إنشاء أصغر 2 × 7 و 2 × 1 المكونات. لاحظ أنه في العنصر 2 × 1، على حافة الأصلية لل2 × 50 سليمة، الذي يسمح البناء خوذة الثابت وتسمح للمحول واحد للاتصال العديد من الفئران مزروع. 1B الشكل و1C تقديم المواد الخام اللازمة لإنشاء محول من نقش على مكبر للصوت. يقدم 1B نهاية خوذة من المحول الذي بالمثل تقطع للاتصال خوذة. لاحظ أن ذلك 2 × 1 ديه مرة أخرى على حافة الأصلية من المكون الخام، وضمان الاتصال الصحيح بين المحول وخوذة. الشكل 1C يظهر نهاية المحول الذي يتصل مكبر للصوت. ويوضح الشكل 1D في epoxied 2 × 7 و 2 س المكونات 1 جنبا إلى جنب مع أسلاك EMG مستعدة لتسجيل إشارة. ويوضح الشكل 1E خوذة الانتهاء. يعرض الشكل 1F محول الانتهاء. ويبين الشكل 1G اتصال السليم بين أغطية الرأس ومحول. وأخيرا، الشكل 1H يدل على الماوس المزروع مع محول اتصال ومكبر للصوت. توصيل رقاقة مكبر للصوت إلى كابل واجهة الذي يمتد إلى مجلس اقتناء (لا يظهر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 2: القطب المونتاج وغطاء الرأس مصنوعة بالكامل ويظهر هذا الرقم القطب التنسيب فيما يتعلق مخ الفأر. تستند مواقع الكهربائي على الإحداثيات التجسيمي من Bregma. إحداثيات كل قطب كهربائي يمكن العثور عليها في الخطوة 4.8 من البروتوكول. اللون الكهربائي يتوافق مع مناطق الدماغ الأساسية لكل القطب. الأبيض = الأمامية القشرة الترابطية (FRA)، أورانج = المحرك الأساسي القشرة (M1)، وردي = الثانوية القشرة الحركية (M2)، الأخضر الداكن = الابتدائية القشرة الحسية الجسدية، والمنطقة forelimb (S1FL)، أخضر = الابتدائية القشرة الحسية الجسدية، منطقة dysgranular (S1DZ )، الضوء الأخضر = القشرة الحسية الجسدية الأولية، مجال برميل (S1BF)، أصفر = الجدارية وسطي القشرة الترابطية (MPTA)، أزرق داكن = القشرة البصرية الأولية (V1)، أزرق فاتح = القشرة البصرية الثانوية، منطقة mediomedial (V2MM)، أسود = دى خلف الطحالقشرة sgranular (RSD). ويظهر ²⁰ المشتركة المرجع / الأرضي أيضا. هذا المخطط إشارة يقلل قطعة أثرية الجهاز التنفسي في إشارة الخام. الأرقام المرتبطة بكل القطب الفردية توفر خريطة قناة لمجموعة بأكملها. الصورة المعدلة من ألين ماوس أطلس الدماغ. ^21،22 الشكل 2B يظهر نقش تشييده بشكل كامل لتوسيع نطاق فيما يتعلق عشرة سنتات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

آثار EEG عينة وEMG من القطب المونتاج الطول الموجي الكهربائي تتوافق مع تعيين القناة هو مبين في الشكل 1A: الرقم 3. عنق الرحم EMG (C) يوفر القدرة على تحديد العضلات القفوية (+). تحتوي على إشارات EMG أيضا نبضات كهربائية القلب QRS(*). وأظهرت أشرطة النطاق من 200 μV لسعة التتبع و1 ثانية لمدة أثر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التوزيع المكاني للالبصرية مستدعى إمكانية التوزيع المكاني لتطبيق يلي المحتملين أثار من ومضة ضوء من جانب واحد تدار فقط في العين اليسرى. الرسم البياني العلوي يصور عالي الكثافة EEG المونتاج مع كل دائرة يمثل القطب. تغيير في اللون مع مرور الوقت يتوافق مع الجهد التغيرات على مر الزمن لكل قطب منها. في الوقت = 0 ميللي ثانية، يتم تسليم نبض 10 مللي ثانية ضوء وممثلة في الشكل الأوسط. ويوضح الرسم السفلي يعني آثار المحتملة أثار لالمقابل V1 و V2 EEG أقطاب (التجارب n = 108 EP). بول خفيفةيحدث ذاتها في 0 مللي ثانية. لاحظ أنه لوحظ استجابة المحتملة أثار المقابلة في V1 المقابل (تتبع الأسود)، تليها الكمون الطويل استقطبت عروضا المحتملة في V2 المقابل (تتبع الأحمر). (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Discussion

يوصف بناء منخفضة التكلفة والخطوات الجراحية اللازمة للوصول الى 26 قناة، وارتفاع الكثافة EEG المونتاج في الماوس بشكل صحيح. سليم فوق الجافية الاتصال الكهربائي أمر بالغ الأهمية في الحصول على إشارات جودة EEG في هذا النظام. خطوتين داخل عنوان بروتوكول هذه المشكلة: دبوس تقليم لمطابقة كفاف الدماغ، وزرع خوذة قبل تعزيز الاكريليك. ومن المهم عدم قطع دبوس قصيرة جدا خلال مرحلة البناء. عندما غرس أغطية الرأس، لا بد من التحقق من رقم التعريف الشخصي المواقع قبل أن التعزيز الاكريليك النهائي. طريقة واحدة لتأكيد السليم اتصال الكهربائي هو من خلال اختبار مقاومة. ظاهريا، ممانعات من 5-10 أوم تشير وضع فوق الجافية السليم. ²⁶   قياسات مقاومة تثبت متانة أغطية الرأس، كقيم مقاومة القطب مستقرة ضمن هذا النطاق أوم 5-10 لمدة 4 أشهر على الأقل بعد الزرع. الأخرىتتضمن خطوة أساسية التوفيق بين دبابيس EMG مع اثنين من الخلفية، معظم الصفوف من EEG الطوب 2 × 7. هذا أمر بالغ الأهمية للاتصال محول، كما EMG المنحرفة ودبابيس EEG سوف يؤدي إلى عدم القدرة على توصيل محول أو دبابيس محول العزم.

والميزة الرئيسية لهذا النظام اكتساب هو سهولة تعديل شكل مجموعة الكهربائي من أجل تحسين احتياجات تجريبية متنوعة. ترتيبات الكهربائي مخصصة التي تناسب الأمثل للتجارب محددة يمكن أن تنشأ بسهولة. التخصيص لتجارب معينة يحتمل أن الجمع بين EEG مع قنية لتسليم المخدرات الموجهة للالدوائية جنبا إلى جنب، الكهربي، والدراسات السلوكية. ²⁷ أغطية الرأس، والمحولات، ومصممة العمليات الجراحية بسهولة إلى عدد كبير من الدراسات عند اتباع الأساليب المذكورة في البروتوكول فوق . والميزة الرئيسية الثانية من هذا النظام الحيازة انخفاض تكلفته. في الوقت الحاضر، يمكن لهذا النظام اكتسابسجل 128 قنوات الإدخال على ما يصل إلى 4 كابلات منفصلة، ​​والسماح التسجيلات في وقت واحد من 4 الفئران أو إذا رغبت في ذلك، الفئران مع شبكات أعلى كثافة. ومن شأن هذا التوسع لا تتطلب سوى كابلات اضافية والمحولات.

هذا النهج إلى عالية الكثافة اكتساب EEG يعالج عيوب عالية الكثافة وطرق حيازة EEG أخرى في الفئران. تم بناء النظام المذكور في هذا العمل بسهولة مع مواد بسيطة ويستخدم الأجهزة مفتوحة المصدر والبرمجيات التي هي رخيصة ومستقرة، ويسمح لالقياسات المتكررة في نفس الحيوان على مدى الأشهر، يسمح بحرية الحركة أثناء التجربة، و لا يتطلب الفئران أن تكون تخدير للتسجيل. قيود من هذا النظام هي أنه قد تم التحقق من صحتها فقط حتى الآن في الفئران التي تزن 20 غراما أو أكثر، وتكون أقدم من 12 أسبوعا. قد يكون الفئران أصغر أو أقل صعوبة مع زرع خوذة. والقيد الثانوي من هذه المنهجية هو عدم القدرة على التحكم بدقة عمق الكهربائي بعد headpIECE تلفيق. ومع ذلك، وينطبق هذا القيد نفسه إلى أقطاب المسمار EEG التقليدية حيث لا يوجد طريقة لمعرفة بالضبط ما قبل الوفاة المسمار عمق النسبي إلى السطح القشري. استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا الأسلوب عادة ما ينطوي على التدريع صحيح إشارة التدخل من الماوس عندما المربوطة من أجل الحصول على إشارة خالية من الضوضاء.

عالية الكثافة صفائف EEG ضرورية لالتحليلات الزمانية المكانية معقدة من البيانات EEG التي هي طبيعية جديدة في تفسير EEG الحديث. بينما توضح التوزيع المكاني للإمكانات أثار البصرية، والبيانات التي حصل عليها باستخدام هذا النظام يمكن تحليلها باستخدام تقنيات التصوير مصدر كهربائي والتدابير اتصال الخلايا العصبية. تخفيض 60٪ إلى 70٪ في منطقة التماس بين هذه الدبابيس القطب مقارنة اتصالات المسمار التقليدية يسمح أكثر دقة توطين إشارة، كما هو مبين في الشكل (4). توظيف عالية الكثافة التقنيات التحليلية في الفئران المعدلة وراثيا، pharmacol التاليةتدخل ogical، أو في الحيوانات يعانون من أمراض الجوهرية مثل اضطرابات الاستيلاء يمكن أن تساعد في إدراك آليات توليد اهتزازات القشرية محددة، حصر مصادر نظم تخطيط موارد المؤسسات والعائد على السهم، وتكشف عن خصائص الشبكة واسعة النطاق. من خلال تحسين النظم البشرية في موازاة، وهذا النهج تحسين نماذج حيوانية صغيرة من علم وظائف الأعصاب البشري وأمراض الأعصاب، وتوفير أسهل ترجمة الاكتشافات التي تمت في نماذج القوارض إلى أهمية علمية وسريرية على البشر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32 Channel RHD2132 amplifier headstage	Intan Technologies	C3314
Aquistion Board	Open Ephys	v2.2
100 Position Receptable Connector	Digi-Key	ED85100-ND	Headpiece
Acetone (1 L)	Sigma Aldrich	179973-1L
Razor Blade (100 pack)	McMaster Carr	3962A4
Wire-Cutting Pliers	MSC Industrial	321786
2-Part Epoxy	McMaster Carr	7605A18
PFA Coated Silver Wire (25 ft)	A-M Systems	787000	EMG Wire
CircuitWriter Pen	MCM Electronics	200-175	Silver Applicator for Electrode Tips
36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector	Omnetics Connector Corporation	A79028-001	Headpiece to Amplifier Adapter
Conn Strip Header 2 x 50	Digi-Key	ED83100-ND	Headpiece to Amplifier Adapter
Clidox Base and Acitvator	Pharmacal	95120F & 96120F	Sterilant
Isoflurane	Priamal Enterprises Ltd	66794-019-10
Oxygen	Airgas	OX USP300
Closed Loop Temperature Controller	CWE Inc.	08-130000
Curved Scissors	FST	14085-09
0.25% Bupivicaine Hydrochloride	Hospira	0409-1159-02	Local Anesthetic
Meloxicam 5mg/ml	Henry Schein	6451602845	Pain/Inflammation Relief
0.9% Sodium Chloride	Hospira	0409-4888-20	Fluids
Cefazolin	Hospira	0409-0806-01	Antibacterial
No.11 Disposable Scapel (20 pk)	Feather	2975#11
Micro Serrefines	FST	18052-3
Cotton Swabs (1,000 pk)	MSC Industrial	8749574
0.5 mm Micro Drill Bit	FST	19007-05
Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1471
Curved Forceps	Roboz	RS-5136
Methyl Methacrylate	A-M Systems	525000	Cement for headpiece
Methyl Methacrylate Crosslinking Compound	A-M Systems	526000
Curved Hemostats	FST	13003-10	Aide in Adapter Connection
RHD2000 standard SPI interface cable (3ft)	Intan Technologies	C3203
Cantilever Arm	Instech	MCLA
Micro Spatula (12 pk)	Fischer Scientific	S50822
Digital Soldering Station	MCM Electronics	21-10115
Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead	MCM Electronics	21-1045
Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based)	L.A. Colors	CNP508
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940