Bir Kemirgen Modelinde Yüksek yoğunluklu Elektroensefalografik Toplama Düşük maliyetli ve Açık kaynak Kaynakları Kullanma

Özet

Instructions for the low-cost construction and surgical implantation of a chronic transcranial high-density electroencephalographic montage into mice are provided. Signal recording, extraction, and processing techniques are also described.

Özet

elektrik kaynağı görüntüleme ve ağ bağlantısının tedbirler de dahil olmak üzere, yüksek uzaysal çözünürlüğü gerektiren İleri elektroensefalografik analiz teknikleri, nörobilim soruların genişleyen çeşitli geçerlidir. bir kemirgen modelinde analiz bu tür Sahne geleneksel vida elektrotlar başarabilirsiniz daha yüksek elektrot yoğunluğu gerektirir. Kemirgenler için yüksek yoğunluklu elektroensefalografi montages bulunmakla birlikte, bunlar, çoğu araştırmacıya sınırlı sayıda vardır uzun bir süre boyunca tekrarlanan deneyler için yeterince güçlü değildir, ya da anestezi kemirgenlerde kullanmak sınırlıdır. ^1-3 Önerilen bir düşük maliyetli bilateral implante edilebilir başlık parçaları kapsayan bir dayanıklı, yüksek sayısı, transkraniyal elektrot dizisi oluşturmak için bir yöntem, gelişmiş elektroensefalogram farelerde ya da sıçanlarda analiz gerçekleştirmek için bir araç olarak incelenmiştir.

başlık imalat ve cerrahi implantasyon n için prosedürlergürültü yüksek sinyal üretmek için ecessary, düşük empedanslı EEG ve EMG sinyalleri sunulmaktadır. metodoloji hem sıçanlarda ve farelerde yararlı olsa da, bu yazının daha küçük fare kafatası için daha zorlu uygulanması üzerinde duruluyor. Serbestçe hareket eden fareler sadece kayıt sırasında ortak bir adaptör aracılığıyla kablolara gergin olan. 26 elektroensefalografik kanalları ve 4 elektromyografik kanalı içerir, bu elektrot sistemi bir versiyonu aşağıda tarif edilmektedir.

Giriş

Nöronal aktivitenin makroskopik (electroencephalogram) için Mezoskopik mikroskopik (bireysel eylem potansiyelleri) den ayrıntı (yerel alan potansiyelleri) çeşitli düzeylerde ile ekstraselüler kaydedilebilir. Bu beyin izleri klasik davranışsal, nörofizyolojik veya elektrofizyolojik durumları tanımlamak için frekans analiz edilmektedir. Bu nöronal aktivitenin uzaysal bileşeni çözemeyen bir tek Biyopotansiyelin, ⁴ ama seyrek yoğunluklu EEG kayıtları ile yapılabilir. Modern elektroensefalogram analizi belirli bir psikolojik koşullar ve fizyolojik süreçleri ile bu etkinliği ilişkilendirmek için kortikal aktivite uzaysal dağılımının ayrıntılı haritaları üretilmesi için çok sayıda elektrot dayanır. Yüksek yoğunluklu EEG montajları olan gerektiren analiz daha yaygın olarak kullanılan listelerinde ^5-7 İki elektrik kaynağı görüntüleme ve sinir ağ bağlantısı ölçer. ^8-11

Elektrik kaynak görüntüleme fonksiyonel olarak aktif beyin bölgelerinin lokalizasyonu içerir. elektrot dizisinin topografik haritalama olayı ile ilgili potansiyeller (OİP) ve uyarılmış potansiyeller (EP) sırasında, beyindeki elektriksel aktivitenin akım kaynağı yoğunluğu benzetebiliriz. Elektrik kaynak lokalizasyonu yaygın hem nöbet çalışmalarında yanı sıra güç dağıtımında kullanılan analiz eder. ^12-15 EEG yüksek zamansal çözünürlüğe sahip olduğundan, EEG çalışmaları ERP ve EP gerçek zamanlı değerlendirilmesi yanı sıra zamansal hassas post hoc analizi izin verir. ^{3,11 12}

elektroensefalogramda görülen salınımlar etkileşimi ile bilişsel durumları ve fonksiyonları ilişkilendirme sinir ağı bağlantısı çeşitli önlemler nihai hedeftir. Çeşitli çalışmalar senkronizasyonu ve uyarılma, dikkat ve eylem spesifik durumları ile ilişkili farklı beyin bölgeleri arasındaki salınımlarının faz kilitlenmesi göstermiştir. ^{6,13,14,16-19} Beyin bölgeleri arasında sinyal dernekleri Gösteren ağ bağlantısı değerlendirmelerini izin yüksek yoğunluklu diziler gerektirir.

Kaynak yerelleştirme ve ağ insanlarda çalışmalarla kökenli EEG sinyallerinin analizi, ancak insanlarda aksi imkansız invaziv teknikler gerektirir olarak bu sinyaller için nöronal temel soruşturmaların mutlaka hayvan modelleri içerir. Kemirgen modellerinde, bu analizler çoğaltmak için, bir kemirgen beynindeki yüksek yoğunluklu EEG sinyallerini yakalamak için bir yöntem gereklidir. Diğer gruplar, farelerde kullanılmak için yüksek yoğunluklu mikroelektrot dizileri inşa ederken, bu tür yaklaşımlar, Nanofabrikasyona tesislerine erişimi olmayan araştırmacılara sınırlı sayıda vardır uzun bir süre boyunca tekrarlanan deneylerde için yeteri kadar güvenli değildir, ya da, anestezi uygulanmış kullanımı sınırlıdır fareler. ^1-3,7 kronik yüksek yoğunluklu oluşturmak için düşük maliyetli bir alternatif protokolü, transkranial elektrot array burada gösterilmiştir.

Burada anlatılan sinyal alımı yaklaşımı EEG ile sınırlı, ancak elektromiyografi (EMG) sinyalleri içermektedir değildir. EMG sinyallerinin kazanılması davranışı durumunu tanımlamak için tamamlayıcı bir yaklaşım ve uyku çalışmaları için özellikle yararlıdır olabilir. Bu yaklaşım pahalı, ultra-yüksek yoğunluklu intrakranial ızgaraları arasında bir ara sağlar ve ileri analiz yaklaşımları için yetersiz geleneksel vida elektrotlar ile mümkün sınırlı kurşun numaraları. başlık tasarımı kolayca inşa ve yüksek verimli çalışmalar için uygun fiyatlı bir. kortikal salınım nesil, gerçek genotipik farklılıklardan davranış farklılaşmaları, ERP ve EP kaynak lokalizasyonu ve büyük ölçekli ağ iletişimi mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir kemirgen modelleri içinde çeşitli genetik veya farmakolojik manipülatif teknikleri ile birlikte bu satın alma sisteminin kullanılması.

Protokol

Bu soruşturma boyunca yapılan çalışmalar Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes ile anlaşmaya vardı ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Başlık Parçası Tasarım ve İnşaat

1. plastik tuğla ile pimin hazne kısmını iterek bir cımbız ile 100 pozisyon hazne konnektörü 2 x 50 pin tuğladan pimleri her sekizinci satırı kaldırın.
   Not: aşağı bakacak iğneler protokol geri kalanı için başvurulan edilecek yönlendirme olacaktır. (Özellikle 2.6 Bu not alın).
2. yalıtmak ve oje tamamen kuruması için oje çok hafif bir ceket ile işaretçilerine örtün.
3. aseton ve küçük bir bezle pim uçlarından oje çıkarın.
4. Bir jilet veya tel kesme p kullanarak 2 x 7 en aşırı plastik Trimliers. Bu pim uzunluğu boyunca yalıtılmış ve pim ucunda maruz 2 x 7 tuğla neden olur. Bunlar sonuçta transkranial EEG elektrotları olacak. İki adet 2 x 7 tuğla tam bir kronik elektrot dizisinin (Şekil 1A) için gereklidir.
5. EMG sinyali kayıt için iki adet 1 x 2 pin tuğla kesin. Cımbız ile istenmeyen işaretçilerine kaldırılması ve 1 x 2 tuğla oluşturmak için uzak aşırı plastik kesme aynı işlemi kullanın. Bu mesafe, böylece tek bir adaptör bütün başlık parçaları (Şekil 1A) için çalışacak her headpiece standart pin mesafesi olacak şekilde bu 1 x 2 orijinal 100 Pozisyon Receptacle onlara yumuşak bir tarafı olduğundan emin olun.
6. 2 x 7 pin parçasının (Şekil 1D) 1 x 2 pin parça takmak için 2 parçalı epoksi kullanın.
   1. pim, her iki seti de aynı yönde olması gerektiği gibi, 1 x 2 ve 2 x düzgün yanlarıyla baş kısmının her iki yarısının yan tarafında 1 x 2 epoksi7 birbirine temas. 2 x 7 pimleri arka-en fazla 2 satır ile 1 x 2 iğne delikleri ve işaretçilerine hizalayın.
      Not: headpiece iki yarısı birbirine epoxied değildir. Bu alışkanlık sırasında daha kolay bağlantı için başlık adaptör iki yarısı olan esnekliğe ve deneysel gün (Şekil 1 E) sırasında sağlar.
   2. başlık yarıları gecede tedavi edelim. Tamamlandığında, başlık bilateral simetriktir. Her yarım 2 x 7 pin tuğla en fazla 2 satır posterior doğrultusunda bir yanal bağlı 2 x 1 pin tuğla ile 2 x 7 pin tuğla oluşur.
7. EMG sinyali kayıt için kabloları hazırlayın. Telli tek, 31 G perfloroalkoksı yalıtımlı gümüş tel kayıt EMG sinyali (Şekil 1D) için kullanılır. Bununla birlikte, çok-şeritli ya da istenirse başka metal kablo ikame edilebilir.
   1. Torasik EMG teller perfloroalkoksi yalıtımlı gümüş tel ve rem bir 3,0 cm uzunluğunda bir parça almak oluşturmak içinbir jilet ile bir ucundan plastik yalıtım Ove 1 cm. iki kez bir cımbız etrafında olmayan yalıtılmış tel sarın. cımbız teli çıkarın ve bir jilet ile olmayan ilmekledi ucundaki yalıtım 25 mm kaldırın.
   2. Servikal EMG teller inşa etmek, tel 1,5 cm segment işlemi tekrarlayın. İki Servikal EMG teller ve iki göğüs EMG teller tam bir baş kısmını ihtiyaç vardır.
8. Bir fare beyin atlas ²⁰ (Şekil tarafından belirlenen bu konuma altında hiçbir beyin olmadığı için, bregma 3,3 mm ön ve bregma 2.3 mm yanal bir stereotaksik koordinatlar karşılık, her iki başlık parçaları en uzak ön satırda yan pimi, kaldır Şekil 2A).
9. Her iki başlık yarısının üzerinde, (3,0 mm pin ucundan) tel makasları bir çift headpiece plastik taban 1 x 2 tuğla işaretçilerine kesilmiş ve ön pin ve göğüs servikal EMG tel lehim arka p EMGiçinde.
   1. Her pin elektriksel olarak izole olup olmadığını kontrol edin. süreklilik modundayken farklı pimleri voltmetre iki yol açar bağlayarak dijital multimetre ile bir süreklilik testi yapın. Elektriksel olarak izole pimleri bu multimetre testi ile bir uyarı sesi üretmek değil; Ancak, elektrik birleştiğinde pimleri olacak. minimal yan deplasman ön / arka eksenine paralel olacak şekilde EMG teller viraj, oje ve bir kez kuru ile lehimli eklemler örtün.
10. göreceli uzunluğu Trim pimler beynin yüzey profiline uygun şekilde.
    1. Bir fare beyin atlas yardımcısı ile her pin için Bregma beyin yüzeyine rekor ventral mesafe koordinat. ²⁰ olan ventral mesafe bregmadan pim süsleme için gösterge olarak görev yapacak en büyük pim. Diğer tüm iğneler Bu maksimal ventral mesafe pim (Tablo 1 ile ilgili olarak kesilir ise, bu PIN kesilmiş olmayacak).
       Not: iğneler boyutuna aşağı öğütülmüş olabilir ama headpiece pimleri bükülmesine neden olabilir pim ve öğütme tekerleği arasındaki sürtünme dikkatle yapılmalıdır. Bir pim bükülmüş ise, bunu düzeltmek için cımbız kullanın. uzunluğu aşağı işaretçilerine taşlama bir alternatif tel kesme bir pense ile süs etmektir.
11. Bir gümüş çözüm kalemi kullanarak bir gümüş çözeltisi ile pim tüm ipuçları Kapak ve kurumaya bırakın. Bu adım, sinyal gürültü oranını arttırır ve aynı zamanda çıkıntılar nedenle doku hasarı olasılığını azaltmak ve ameliyat sonrası iyileşmesinin hızlandırılmasında pim kesme kaynaklanan ortadan ≤30 kH, elektrot empedanslarının düşürür. Tamamlanmış bir başlık yarım ağırlıkları yaklaşık olarak 0.5 gr.

2. Adaptörü İnşaat ve Kanal Haritalama

1. Bir jilet kullanarak 2 ya da 3 cm üniform bir uzunluğa 36 Pozisyon Çift Sıra Erkek Nano-Minyatür Connector konektör kablolarını kesti. Her tel, st içinSonunda ve kalay her tel için maruz kalan metal yalıtım malzemesini 2.5 mm rip. Bu işaretçilerine izole etmek çok önemlidir her nano adaptör tel için kalaylı tel tek bir ince teli var Kalaylama zaman emin olun. Tel kesme pense (Şekil 1C) ile soyulmuş yalıtım snip.
2. kullanarak baş kısmını bir uyan erkek / erkek konnektör oluşturma 2 x 50 tuğla Conn Şerit Başlık 2 x 50 Cut iki 2 x 7 en ve iki 2 x 1 en. Erkek iğnelerden birini kopararak 2 x 50 tuğla istenmeyen işaretçilerine çıkarın ve ardından bir cımbız (Şekil 1B) ile konnektörü kapalı aynı parçanın kesintisiz ikinci yarısında itin.
   Not: Adaptör pimleri her headpiece takmak için diğer yarısı kalaylı nano konektörü telleri lehimli olacak iken bu iğnelerden bir tarafı, hizmet edecektir. adımda oluşturduğunuz kemik ile erkek / erkek konnektörü uygun çiftleşme garanti altına almak için 2 x 1 ve 2 x 7 dokunmadan düz plastik kenarları emin olun1.
3. İstenilen zemin / referans pin nano konektöründen zemin / referans tellerinin birinde lehim. Zemin ve referans telleri RHD2132 amplifikatör yongası üzerinde birbirine bağlanır. Bregma 0.60 mm ön ve referans ve zemin hem de bregma 1.00 mm yanal olan tek pimini kullanın. Yere bağlayan 0Ω direnci kaldırarak amplifikatör çipi üzerinde zemin ve referans ayırmak mümkün olduğunu unutmayın; (Sol headpiece, üçüncü en ön sıranın orta pin tercih ancak, başka bir iğne, Şekil 2. atanabilir) ve referans ikisini izole isteniyorsa.
4. Zemin / referans pin bağlantısı olarak erkek / erkek konnektörleri aynı tarafına kalaylı nano bağlayıcı telleri lehim. Kanal kurulumu şu anda tamamlanmış böylece her tel, belirli bir kanala eşler. amplifikatör headstages Kanal harita şemaları Aç Ephys Wiki sitesinden (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home bulunur). kimin kanalı, ilgili pin bilinmektedir istenen haritalama elde etmek için gelen tel lehim.
5. tel kesme pense ile nano konnektörü dibinde kullanılmayan telleri kesti.
6. Her pin diğer tüm pimleri elektriksel olarak izole olmasını sağlamak için bir voltmetre kullanın. izolasyon onaylandıktan sonra, ayrıca her pimi izole etmek her lehim eklem çevresinde oje ince bir tabaka uygulayın.
7. 2 parçalı epoksi kullanarak, erkek-erkek tuğla ikili 2 x 7 ve 2 x 1 pimleri uygun nano adaptörünü güçlendirir.
   Not: Daha önce oluşturulan başlık yarım pin uyuşabilecek bu tek adaptöre iki yarısı olacaktır. Bu aynı zamanda takılı olan headpiece her iki devreyi de önleyecektir gibi, adaptör her yarısının orta kısmı erkek / erkek konnektörü plastik kenar taşan fazla epoksi yok emin olmak için önemlidir. Herhangi bir epoksi pimi adaptörü por alt akmasına izin vermeyinBu kadar adaptörün tion, aynı zamanda uygun bağlantıları önleyecektir. Uygun bağlantı pimi uyum için bir kalıp olarak 2 başlık yarısını kullanın.
8. adaptörün iki yarıyı epoksi ve dayanıklılığı artırmak için nano konnektörü tabanını epoksi. epoksi ile tüm lehim eklemleri kapsayacak şekilde emin olun. Adaptör tedavi gecede edelim.
9. Uygun kanal eşleme teyit Açık Ephys grafik kullanıcı arayüzü (GUI) empedans ölçümleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tamamlanmış bir adaptör yaklaşık 1.3 g (Şekil 1F) ağırlığındadır.

3. Cerrahi

1. Steril cerrahi alanında hazırlayın.
   1. gerektiği gibi steril eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman kullanın. bir otoklav araçları sterilize edin. 1.0 mM klor dioksit çözeltisi ile stereotaktik çerçeve sterilize edin. çerçeve üzerine çözelti püskürtünüz ve steril su ile yıkamadan önce 5 dakika bekleyin.
   2. implante headp sterilize etmek içinIECE parçaları, 1.0 mM klor dioksit çözeltisi ile bileşenlerin sprey ve steril su ile yıkamadan önce 5 dakika bekleyin. steril bir petri içine şimdi steril implante donanım yerleştirin.
2. Daha sonra% 100 oksijen 1.5-2.0% izofluran ile 200 ml'lik bir indüksiyon odasında fare anestezi, fare için bir ameliyat öncesi ağırlığı elde. / Dakika yaklaşık 500 ml bölmesine bir akış hızını kullanarak.
3. İndüksiyon odayı döndürmek suretiyle düzeltme refleksi kaybının kontrol edin. tamamen kulak çubukları ile farenin kafasını güvence olmadan stereotaktik çerçeve üzerinde burun konisi içine indüksiyon odası ve yerden fareyi çıkarın. Ayrıca vital bulguları değerlendirirken ayak tutam değerlendirme ile anestezi uygun derinlikte izlemek için devam edin.
4. Böyle bir rektal prob ile ısıtma yastığı sistemi gibi bir kapalı döngü sıcaklık kontrolörü, 37 ° C 'de iç vücut ısısını korumak. kürk kapalı kırparak önce oftalmik göz merhemi ile fare gözleri Kapakkavisli makas veya makası kullanarak kafatasının üstünde. betadin baş dezenfekte edin ve betadin geçmeden önce tamamen kurumasını bekleyin.
5. intraperitoneal sıvılarla birlikte analjezik ve antibiyotik uygulayın. 25 g bir fare için, 0.5 mg sefazolin, 0.125 mg meloksikam, 0.5 mi tuzlu su ve 2.5 ug buprenorfin q 4-6 saat prn.
6. kafasına orta hat boyunca 250 ul% 0.25 bupivakain subkutan enjekte edilir ve fare hem de elmacık kemerler üzerine 100 ul% 0.25 bupivakain subkutan enjekte edilir.
7. stereotaksik çerçeve fare sabitleyin ve kafatası maruz.
   1. stereotaksik çerçeveye stereotaksik kulak çubukları ile fare kafasını sabitleyin. Fare ayak tutam refleksi olmadığından emin olunduktan anestezi cerrahi düzleminde olduğundan emin olun. Kafatasının orta hat boyunca bir No. 11 atılabilir neşter ile birlikte 1.5-2.0 cm'lik kesi oluşturun. kesi gözler arasındaki başlayıp oksiputta için posterior devam edecektir.
   2. Mikro kelepçeler ile yanal cildi yayarak kafatası maruz. anestezi cerrahi uçağı sağlayan bir konsantrasyona 2.0 den% izofluran konsantrasyonunu azaltmak, ancak% 100 oksijen daha düşük% 1.0 izofluran azaltmak yoktur. Ameliyat öncesi analjezi anestezi cerrahi derinliği sürdürmek için gerekli inhale anestezik miktarını azaltır ve daha hızlı iyileşme ve sağkalım sonuçlara yol açabilir.
8. Kafatası ve matkap çapak delik Seviye.
   1. Bregma tanımlamak ve koordinat sisteminin orijinini olur bregmadan en stereotaktik koordinatları sıfır. Lateral / medial ekseninde kafatası seviye için bregmadan her iki yönde 1,50 mm yanal bir stereotaksik manipülatör kolunun bağlı bir tesviye probu hareket ve dorsal / ventral derinliği az 0,05 mm olduğunu teyit zaman sonda temas sol ve sağ kafatasının taraf.
      Not: Dorsal / ventral manipülatör ar 10 mikron çözünürlüğüDijital birlikte kullanılan m ekran tesviye kolaylaştırır koordinat. Bregma hakkında ön / arka ekseni Tesviye aynı tekniği izler. Bregma ve Lamda temas için ventral mesafe farkı da az 0,05 mm olmalıdır.
      1. enlemesine bir düzlem yere paralel olacak şekilde regüle her iki yönde de tamamlanana kadar kafatası ayarlayın. Bu fare beyin atlası görüldüğü gibi gerçek stereotaktik koordinatlar için izin verir. ²⁰
   2. stereotaksik matkap içinde 0.5 mm çaplı mikro matkap ucu ile, kafatasının iki yarısı üzerinde orta hatta yanal 1.00 mm 1.30 mm aralıklarla bregma 4.50 mm posterior 3.30 mm anterior matkap çapak delik. Elektrotların 2.30 mm lateral kolonlar için, 2.00 mm ön matkap çapak delik orta hattın her iki tarafında 1.30 mm'lik artışlarla bregma 4.50 mm posterior (Şekil 2) bregma. Bu dr için gerekli olan yüksek doğruluk ve hassasiyetIlling işlem dijital stereotaksik manipülatör kolunun 10 mikron kararı ile kolaylaştırılmıştır.
      Not: headpiece pimleri için için düzgün implante edilebilir, fare kafatası stereotaksik çerçevesinde yerine güvenli bir şekilde olması gerekir. kafatası delme işlemi sırasında hareket ederse, başlık ve çapak delik hiza meydana gelebilir.
9. Kafa takımlarına implant.
   1. Düz forseps ile, göğüs EMG teller için EMG tel tünelleri hazırlamak. sağ ve sol EMG teller hem de arka deri ve kas arasındaki 2.5 cm yuva. pimleri önceden delinmiş çapak delikleriyle aynı hizada olacak şekilde kavisli bir forseps ile EEG tuğla manevra sonra ilk düz forseps ile oluşturulan boşluğa toraks ve servikal EMGS takın ve.
   2. headpiece üzerine hafif basınç uygulayın ve kafatası içine işaretçilerine kıpırdatmak. Aks çapının 0.46 mm 'dir. oje yalıtım, iğneler delinmiş çapak ho sıkıca uyacakles. o uygun eklenir kez başlık istikrarlı olacaktır. Nihai pozisyonlara EMG teller ayarlayın. diğer tarafta headpiece için aynı işlemi tekrarlayın.
10. Diş çimento kullanarak yerine baş kısmını sabitleyin.
    1. çapraz bağlanma bileşiği ile metil metakrilat: 1 oranını, hem başlık parçaları yerine ayarlandığında, 1 karıştırın. o maruz kafatası, pim elektrotların tırnak cilalı parçaları ve EMG tellerin proksimal bölümünü kapsar, ancak headpiece kadın kapları kapsamaz şekilde karışımı uygulayın.
    2. kürk üzerinde çimento alamadım emin olun. Fare üzerine kapmak mümkün olacağını oluşturmak için çimento sırtlar için izin vermeyin. kuru çimento için yeterli zaman sağlanması ve daha sonra stereotaktik çerçeve fare kaldırmak. Fare taşımak zorunda kalacak toplam ağırlık headpiece 2 yarım olduğunu ve güvence çimento yaklaşık 1.2 gramdır.
11. Temiz bir hayvan yerleştirinkurtarma alan.
    1. bir ısıtma yastığı ile iç vücut ısısını korumak. o anestezi çıkmasını simgeleyen, tüm postural refleksleri kavuşur kadar fare izleyin. Bireysel konut, uzun vadeli iyileşme için tavsiye edilir.
    2. cerrahi sonrası 3 gün en az günlük izleme girişimsel analjezi ile tavsiye edilir. kurtarma ameliyat sonrası 10-14 gün gergin alışma dönemi başlamadan önce izin verin.

Tethering 4. alıştırarak Hayvanlar

1. Bir fare baş desteğini (Şekil 1G-H) kullanılarak fare adaptörünü bağlayın. Fare ölçülü ve yavaş yavaş her iki tarafta implante headpiece içine adaptör işaretçilerine eklemek kez kavisli hemostatlarla yerine yapıştırılarak uygulanır başlık parçaları ters köşeleri üzerine tutun.
2. Adaptörü (Şekil 1H) 32 kanallı amplifikatör bağlayın. Bir işbirliği içinde adaptörü ve amplifikatör hem logolar hizalamak için emin olunadaptör ve kanal haritalama hataları önlemek için amplifikatör hem nsistent yönelim. Bir RHD2000 standart seri çevresel arabirim (SPI) kablosuna amplifikatörü bağlayın. Bu kablo, sinyal kayıt için toplama sistemine bağlanır.
3. bölme duvar üzerine monte konsol kolu olan bir bölme içinde fare yerleştirin. konsol koluna SPI arabirim kablosunu takın ve gergin kablo ağırlığını dengelemek için konsol kolunda gerginliğini ayarlamak. Fare serbestçe hareket edebilir ve kaydetmeden önce bir gün bir saat hafta habitüe edilir.
4. Fare adaptörü kesmeden yardımcı olmak amacıyla bir yassı paslanmaz çelik mikro spatula kullanırken fareyi kesmek için, sadece fare kablosunu ve adaptörünü fişten çekin.

5. Sinyal Ekstraksiyon Sistem Kurulumu / Sinyal Kayıt

1. implante fare headpiece içine inşa adaptörünü takın. adaptörü headstage amplifikatör bağlayın veamplifikatör ve satın alma kuruluna standart bir SPI arabirim kablosunu takın. farenin kafasına ek ağırlık en aza indirecek şekilde SPI kablosu düzgün gerilmiş konsol eklemek zorunda.
2. Yerel bir Faraday kafesi yerleştirin headstage etrafında, iletken örgü veya alüminyum folyo kullanılarak oluşturulan ve yerel Faraday kafesi zemin.
3. GUI modülü ile 30 kS / sn örnekleme hızı ve ölçü empedans seçerek her kaydın başlangıcından önce elektrot empedanslarından alın. veya daha az bir bireysel pin 10 k eşit bir empedans değeri uygun elektrot temas onayı için gereklidir. Yüksek empedans değerleri o elektrottan reddedilen verilere neden olur.
4. kayıt için, Ritim FPGA, GUI Bandpass Filtresi ve LFP görüntüleyici bir sinyal zinciri oluşturmak. 1.00 kS / s, 0.1-7,500 Hz bant genişliğinin bir örnekleme oranını seçmek ve DSP seçimini kaldırmak için tavsiye edilir. 0,1-250 Hz Bant filtre ayarlayın ve op tarafından kanalları görüntülemekLFP görüntüleyici günler. En iyi seçilen beraberlik yöntemi ile 250 ve 400 mV kanal genlikleri verilerini görüntüler.
5. GUI kullanarak kaydetmeye başlamak. Her kayıt için yeni bir klasör oluşturun ve bu klasöre dosyaları kaydetmek için yolunu ayarlamak. Bir Kayda başlamak için sadece rekor. konnektörü bütün 32 kanal varsayılan olarak kaydedilir, ancak istenmeyen kanallar kayıt başlamadan önce Ritim FPGA modülünün sağ tarafında tıklayarak seçilmemiş olabilir.
6. analiz için Matlab içine veri alma. analizinde yardımcı olmak için kullanılabilecek açık kaynak toolbox çok sayıda vardır.

Sonuçlar

Yüksek yoğunluklu EEG kemik ile implante serbestçe hareket eden bir fare kaydedilen Örnek veriler Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bağımsız EEG dalga biçimleri, Şekil 2'de gösterilen kanal eşleme şemasına karşılık gelmektedir. Servikal ve torasik EMG örnekleri arasında, aynı zamanda, Şekil 3'te gösterildi. torasik EMG kaydı da iki göğüs EMG teller arasındaki bir diferansiyel sinyali (T) hesaplanır zaman kolaylıkla görünür hale farenin kalp menşeli gömülü elektriksel aktivite içerdiğini unutmayın. Bu kayıt sayesinde elektrokardiyografik QRS sivri arasındaki süreyi ölçerek farenin kalp hızını hesaplamak da mümkündür. Aynı şekilde ^23-24, bu göğüs boşluğu genişledikçe QRS başak fazik değişkenliği hesaplayarak farenin solunum hızı ölçmek mümkündür ve her nefes sözleşmeler. o edinimi için ²⁵ Dolayısıyla, bu kurulum iznif fare polisomnografi. Ayrıca, kurulum görsel uyarılmış potansiyeller (Şekil 4) kortikal haritalama sağlar. ışık 10 milisaniye darbe farenin sol göze sadece teslim edildiğinde, klasik tepkiler kontralateral ikincil görsel korteks gecikmeli tepki tarafından takip edilmektedir kontralateral (ama aynı tarafta) birincil görsel korteks kaydedilir. Şekil 4'te gömülü bir film kontralateral V1 ve V2 faaliyet grafikleri ile birlikte tüm kortikal yüzeyi boyunca elektriksel potansiyelleri farklı süresini gösterir.

AP
3.3			0	0
2		0.4	0.6	0.6	0.4
0.7		0.6	0.9	0.9	0.6
-0.6		0.9	1	1	0.9
-1.9		1	1.1	1.1	1
-3.2	3	1	1	1	1	3
-4.5	3	0.7	0.7	0.7	0.7	3
ML		-2.3	-1	1	2.3

Tablo 1:. Pim Kesme Uzunlukları Bu rakam headpiece için pin başına, mm olarak, gerekli düzeltme uzunluklarını göstermektedir. pin düzeltme için Uzunlukları bir fare beyin atlas elde edilmiştir. Afkırpma pimleri ter, başlık beynin yüzey profilini eşleşir. EMG sinyali kaydetmek için kullanılan teller pim saplama lehimlenir olarak ²⁰ EMG pimleri tamamen kesilir.

Şekil 1:. Başlıkiçi Bileşenleri, Intermediate İnşaat Adımlar ve Kayıt için uygun bağlantı Bu rakam kafa takımlarına oluşturmak için kullanılan hammadde gösterir. 100 pim yuvasının connecter ile başlayarak, daha küçük 2 x 7 ve 2 x 1 parçalar oluşturulur. . 2 x 1 bileşende, 2 x 50 orijinal kenarı tutarlı headpiece inşaat izin veren, sağlam ve bir adaptör birçok implante farelere bağlanmak için izin verdiğini unutmayın Şekil 1B ve adaptör oluşturmak için gerekli hammadde sunmak 1C amplifikatör headpiece gelen. 1B ve başlık ucunu sunarBenzer kısmak adaptör headpiece bağlanmak için. Bu 2 x 1 tekrar adaptör ve başlık parçası arasında uygun bir bağlantı sağlanması, ham bileşen orijinal bir kenar vardır unutmayın. Şekil 1C amplifikatör bağlanan adaptörün ucunu gösterir. Şekil 1D epoxied gösterir 2 x 7 ve 2 sinyal kayıt için hazırlanan EMG telleri ile birlikte 1 x bileşenleri. Şekil 1E tamamlanmış bir baş kısmını göstermektedir. Şekil 1F tamamlanmış bir adaptör gösterir. Şekil 1G başlıkları ve adaptör arasında düzgün bir bağlantı göstermektedir. Son olarak, Şekil 1H adaptöre bağlı ve amplifikatör ile implante fare göstermektedir. Amplifikatör yonga toplama kartı (gösterilmemiştir) çalışan bir arabirim kablosu bağlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

: fo class = "jove_content"
Şekil 2:. Elektrot Montaj ve Tam inşa başlıkiçi Bu rakam fare beyin ile ilgili elektrot yerleşimi gösterir. Elektrot konumları bregmadan stereotaksik koordinatlar dayanmaktadır. her elektrot için koordinatları protokolün adım 4.8 bulunabilir. Elektrot rengi her elektrot için altta yatan beyin bölgelerine karşılık gelir. Beyaz = frontal dernek korteks (FRA), Turuncu = primer motor korteks (M1), Pembe = ikincil motor korteks (M2), Koyu Yeşil = birincil somatosensoriyel korteks, ön ayakları bölge (S1FL), Yeşil = birincil somatosensoriyel korteks, dysgranular bölge (S1DZ ), Açık Yeşil = birincil somatosensoriyel korteks, varil alanı (S1BF), Sarı = medial parietal dernek korteks (MPtA), Lacivert = birincil görsel korteks (V1), Açık Mavi = ikincil görsel korteks, mediomedial alanı (V2MM), Siyah = retrosplenial dysgranular korteks (RSD). ²⁰ Ortak Referans / Zemin de gösterilmiştir. Bu referans düzeni ham sinyal içinde solunum artifakı en aza indirir. her bir elektrot ile ilişkili Sayılar tüm dizi için bir kanal haritası sunar. Allen Fare Beyin Atlas. ^21,22 Şekil 2B değiştirilmiş görüntü bir kuruş göre ölçekli bir tam inşa baş kısmını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Örnek EEG ve EMG Elektrot Montage İzleri Elektrot dalga Şekil 1A gösterilen kanal haritalama karşılık gelmektedir.. Servikal EMG (C) ense kas tonusu (+) belirlemek için yeteneği sağlar. EMG sinyalleri ayrıca kalp QRS elektrik darbeleri ihtiva(*). Iz genlik 200 uV ve iz süresi 1 sn Ölçek çubukları gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Görsel Uyarılmış Potansiyel Mekansal Dağılımı sol göz sadece uygulanan tek taraflı ışık flaş uyarılmış potansiyel aşağıdaki uygulamasının Mekansal dağılımı.. Üst diyagram bir elektrot temsil eden her daire ile yüksek yoğunluklu EEG montajı göstermektedir. zamanla renk değişikliği ilgili her elektrot için zaman içindeki değişiklikleri voltaja karşılık gelir. Zaman = 0 msn at, 10 milisaniye ışık nabız teslim edilir ve orta şekilde temsil etti. Alt grafik kontralateral V1 ve V2 EEG elektrotları (n = 108 EP denemeleri) için uyarılmış potansiyel izleri anlamına göstermektedir. Işık pulse 0 msn oluşur. İlgili uyarılmış potansiyel yanıtı daha uzun bir gecikme ile takip kontralateral V1 (siyah iz) gözlenen kontralateral V2 (kırmızı iz) potansiyel uyarılmış yanıt olduğunu unutmayın. (Sağ indirmek için tıklayın).

Tartışmalar

düşük maliyetli inşaat ve uygun bir farede 26 kanalı, yüksek yoğunluklu EEG montajı elde etmek için gerekli olan cerrahi basamaklar tarif edilmektedir. Uygun epidural elektrot temas bu sistemde kaliteli EEG sinyallerini edinme önemlidir. protokol adresi içinde iki adım bu sorunu: beyin kontur ve başlık implantasyonu öncesi akrilik takviye maç kırpma pimi. Inşaat aşamasında çok kısa bir iğne kesmek için önemlidir. başlık parçaları implante, final akrilik takviye önce pin yerleşimi kontrol etmek zorunludur. Uygun elektrot teması onaylamak için tek yönlü empedans testi geçer. Görünüşte, 5-10 kÊ empedansları uygun epidural göstermektedir. ²⁶   empedans değeri implantasyon sonrası en az 4 ay boyunca bu 5-10 kÊ aralığında stabil olarak empedans ölçümleri, başlıkları 'dayanıklılık göstermektedir. diğerönemli bir adımdır 2 x 7 EEG tuğla iki arka-en satır ile EMG pimleri hizalayarak içerir. yanlış hizalanmış EMG ve EEG pimleri adaptörü veya bükülmüş adaptör işaretçilerine bağlamak için bir yetersizlik neden olacak gibi bu, adaptör bağlantısı için kritik öneme sahiptir.

Bu satın alma sisteminin önemli bir avantajı, çeşitli deneysel ihtiyaçları optimize etmek için elektrot dizisinin şekil değiştirme kolaylığıdır. en iyi şekilde, belirli deney için uygundur özelleştirilmiş elektrot düzenlemeleri kolaylıkla oluşturulabilir. Belirli deneyler için Özelleştirme potansiyel. Kombine farmakolojik, elektroensefalografi ve davranışsal çalışmalar için yönlendirilmiş ilaç verilmesi için kanül ile ²⁷ headpieces, adaptörler EEG birleştirebilir ve cerrahi işlemler kolaylıkla yukarıdaki protokol açıklanan yöntemlerden aşağıdaki çalışmaların geniş bir dizi tasarlandı . Bu satın alma sisteminin ikinci önemli avantajı düşük maliyetli olduğunu. Şu anda, bu satın alma sistemi can4 fareler ya da yüksek yoğunluklu ızgaraları ile istenirse, sıçanların eşzamanlı kayıtları izin 4'e kadar ayrı kablolar üzerinde rekor 128 giriş kanalı. Böyle bir genişleme sadece ekstra kablo ve adaptörleri gerektirir.

yüksek yoğunluklu EEG edinimi Bu yaklaşım farelerde diğer yüksek yoğunluklu EEG elde etme yöntemlerinin dezavantajlarını giderir. Bu çalışmada açıklanan sistem handily basit malzemelerle inşa edilmiş ve bir deney sırasında serbest dolaşımına izin verir, ucuz ve istikrarlı açık kaynak donanım ve yazılımı kullanır ay içinde aynı hayvanda tekrarlayan ölçümler için izin verir, ve olmak fareler gerektirmez edilir kayıt için anestezi. Bu sistemin sınırlamalarının sadece 20 g veya daha fazla tartmak ve daha eski 12 haftadır farelerde bugüne kadar onaylanmıştır vardır. Küçük ya da genç fareler başlık implantasyonu ile zorluk olabilir. Bu metodolojinin ikincil sınırlama tam headp sonra elektrot derinliğini kontrol etmek yetersizlikIECE imalatı. tam kortikal yüzeye göre ön otopsi vida derinliğini bilmek yolu yoktur çünkü Ancak, bu aynı sınırlama geleneksel vida EEG elektrotları için de geçerlidir. parazitsiz bir sinyal elde etmek için gergin Bu yöntem, genellikle düzgün bir fare müdahale sinyalini koruyucu içerir için giderme.

Yüksek yoğunluklu EEG dizileri, modern EEG yorumlanmasında yeni normal EEG verilerinin kompleks uzaysal analizleri için gereklidir. Bir görsel uyarılmış potansiyel mekansal dağılımı tarif edilmesine rağmen, bu sistemi kullanarak elde edilen veriler elektrik kaynağı görüntüleme teknikleri ve nöronal bağlantı önlemleri kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, geleneksel bir vidalı temas göre, bu elektrot pimler arasındaki temas alanı içinde% 60 ila% 70 azalma, daha kesin bir sinyal lokalizasyonunu izin verir. Genetik olarak tadil edilmiş farelerde yüksek yoğunluklu analitik tekniklerin kullanılmasıyla aşağıdaki Pharmacological müdahale veya böyle, belirli kortikal salınımlar üreten mekanizmaları ayırt yardımcı ERP ve EP kaynaklarını lokalize ve büyük ölçekli ağ özelliklerini ortaya çıkarabilir nöbet bozuklukları gibi içsel patoloji ile hayvanlarda. Daha iyi Paralelleme insan sistemleri tarafından, bu yaklaşım insanlarda bilimsel ve klinik önemine kemirgen modellerinde yapılan keşifler daha kolay çeviri sağlayan, insan nörofizyoloji ve nöropatoloji küçük hayvan modelleri artıracaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
32 Channel RHD2132 amplifier headstage	Intan Technologies	C3314
Aquistion Board	Open Ephys	v2.2
100 Position Receptable Connector	Digi-Key	ED85100-ND	Headpiece
Acetone (1 L)	Sigma Aldrich	179973-1L
Razor Blade (100 pack)	McMaster Carr	3962A4
Wire-Cutting Pliers	MSC Industrial	321786
2-Part Epoxy	McMaster Carr	7605A18
PFA Coated Silver Wire (25 ft)	A-M Systems	787000	EMG Wire
CircuitWriter Pen	MCM Electronics	200-175	Silver Applicator for Electrode Tips
36 Position Dual Row Male Nano-Miniature Connector	Omnetics Connector Corporation	A79028-001	Headpiece to Amplifier Adapter
Conn Strip Header 2 x 50	Digi-Key	ED83100-ND	Headpiece to Amplifier Adapter
Clidox Base and Acitvator	Pharmacal	95120F & 96120F	Sterilant
Isoflurane	Priamal Enterprises Ltd	66794-019-10
Oxygen	Airgas	OX USP300
Closed Loop Temperature Controller	CWE Inc.	08-130000
Curved Scissors	FST	14085-09
0.25% Bupivicaine Hydrochloride	Hospira	0409-1159-02	Local Anesthetic
Meloxicam 5mg/ml	Henry Schein	6451602845	Pain/Inflammation Relief
0.9% Sodium Chloride	Hospira	0409-4888-20	Fluids
Cefazolin	Hospira	0409-0806-01	Antibacterial
No.11 Disposable Scapel (20 pk)	Feather	2975#11
Micro Serrefines	FST	18052-3
Cotton Swabs (1,000 pk)	MSC Industrial	8749574
0.5 mm Micro Drill Bit	FST	19007-05
Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1471
Curved Forceps	Roboz	RS-5136
Methyl Methacrylate	A-M Systems	525000	Cement for headpiece
Methyl Methacrylate Crosslinking Compound	A-M Systems	526000
Curved Hemostats	FST	13003-10	Aide in Adapter Connection
RHD2000 standard SPI interface cable (3ft)	Intan Technologies	C3203
Cantilever Arm	Instech	MCLA
Micro Spatula (12 pk)	Fischer Scientific	S50822
Digital Soldering Station	MCM Electronics	21-10115
Rosin Core Solder 60/40 Tin/Lead	MCM Electronics	21-1045
Color Craze Nail Polish with Hardeners (Nitrocellulose based)	L.A. Colors	CNP508
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940